JP4877297B2 - 選択結合性物質が固定化された基材を用いた被験物質の検出方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
(基材の処理)
顕微鏡用のスライドガラス(松浪ガラス製)にサンドブラスト法により、一辺の長さが8mmの正方形の領域の部分うち、核酸を固定化する部分以外のガラスを削り、凹凸部と平坦部を備える基材をえた。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ0.5mm、直径0.5mm、ピッチが2mmである9本の凸部を設けた。なお、サンドブラスト処理していない部分は平坦である(この部分が本発明における平坦部に相当する)。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-TTTACGTATACACGCGTGTA-3'(配列番号1;5’末端アミノ化)
配列番号(DNA)1の5’末端はアミノ化されている。これを、これをPBS(NaClを8g、Na2HPO4・12H2Oを2.9g、KClを0.2g、KH2PO4を0.2g純水に溶かし1lにメスアップしたもの)に、100pmol/μlの濃度で溶かした。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-TAGCATGCTAATGCATGCATTGGAGAACTGATCGACACAGTACACGCGTGTATACGTAAAGTGGCCATCCATAGTCTTCTAGGCTGCTCCCCGCGTGGCC-3'(配列番号2)
5'-GGCCACGCGGGGAGCAGCCTACAAGACTATGGATGGCCACTTTACGTATACACGCGTGTACTGTGTCGATCAGTTCTCCAATGCATGCATTAGCATGCTA-3'(配列番号3)
配列番号(DNA)2の5’末端から41番目の塩基から60番目の塩基までは、配列番号(DNA)1と相補的な配列を有している。また、配列番号(DNA)3と配列番号(DNA)2とは、相補的な塩基配列を有している。
カバーガラスにクロムを5nm、金を100nm蒸着した。これに金線をはんだで付けた。
スキャナー(Axon Instruments社のGenePix 4000A)に上記処理後の基材をセットし、レーザー出力33%、フォトマルチプライヤーの電圧を500に設定した状態で測定を行った。その結果を表1に示す。
顕微鏡用のスライドガラス(松浪ガラス製)を3mol/l、NaOH水溶液に30分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。そして、10体積% 3-アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に5時間浸した。その後、スライドガラスを引き上げ、アセトンで洗浄して乾燥した。そして、1体積%グルタルアルデヒド水溶液にこの基材を1時間浸した。このような処理を施すことにより、ガラス表面に、アルデヒド基を導入した。
ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート(PMMA)の基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを1mmとした。また、一辺の長さが8mmの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ0.5mm、直径500μm、ピッチが2mmである9本の凸部を設けた。
平坦部上面と、凸部上面の高さの差を100μmにした他は、実施例2と同様に基材を作成し、評価を行った。結果を表3に示す。
ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート(PMMA)製の透明な基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを1mmとした。また、一辺の長さが8mmの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ0.5mm、直径500μm、ピッチが2mmである9本の凸部を設けた。ついで、凸部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と、凸部上面の高さの差が0μmの基材を作製した。
PMMA中に1重量%の割合でカーボンブラックを混合した黒色平面板から、ホットエンボス法により基材を作製した。全体の大きさ、凹凸部の形状は、実施例3と同様にした。また、平坦部上面と凸部上面の高さの差は、実施例3と同様に0μmとした。また、基材表面のアミノ基導入は実施例3と同様に行った。
ホットエンボス法により、材料がポリメチルメタクリレート(PMMA)製の透明な基材を作製した。全体の大きさ、凹凸部の形状は、実施例3と同様にした。また、平坦部上面と凸部上面の高さの差は、実施例3と同様に0μmとした。また、基材表面のアミノ基導入は実施例3と同様に行った。
厚さ1mmの透明なPMMA板をスライドガラスと同じ大きさに切りだした。別途、エチレンジアミン5mlを密閉容器の中に入れ、窒素でパージした後、n−ブチルリチウムを5ml少しずつ加えた。これを2時間程度十分に攪拌し、紫色の反応物(n−リチウムエチレンジアミン)を得た。これを、作製したPMMA板に滴下し1分後に水で洗浄して、表面にアミノ基を導入した。
次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。ホットエンボス法により、基材の材料がポリメチルメタクリレート(PMMA)製の透明な基材を作製した。全体の大きさは、顕微鏡用のスライドガラスと同じ大きさであり、厚さを1mmとした。また、一辺の長さが8mmの正方形の領域の部分をへこませ、この中に、凸部を設け凹凸部を作製した。具体的には、凹凸部における、凹部から凸部表面までの高さ0.2mm、直径500μm、ピッチが2mmである9本の凸部を設けた。ついで、凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面(基準となる凸部)よりも、30μm低い凸部(3箇所)がある基材(基材ア)、他の凸部上面よりも、50μm低い凸部(3箇所)がある基材(基材イ)をそれぞれ作製した。なお、これら基材の低い部分以外の凸部上面の高さと、平坦部分の高さの差は0μmであった。実施例3と同様に、点着するDNAの調整、凸部上面へのDNA溶液の点着、ハイブリダイゼーション用のDNAの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、実施例3と同様に測定を行った。その結果(蛍光強度とノイズの平均値)を表5に示す。
実施例6と同様に、同様に基材を調整し他の凸部上面よりも、100μm低い凸部(3箇所)がある基材(基材ウ)をそれぞれ作製した。実施例3と同様に測定を行った。その結果(蛍光強度とノイズの平均値)を表5に示す。
2 凹凸部
3 マイクロアレイ
4 対物レンズ
5 励起光
6 マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
10 導電性膜
11 凸部上面
12 導電性膜
13 絶縁膜
Claims (6)
- 平坦部と凹凸部が設けられ、該凹凸部の凸部の上面の高さと該平坦部分の高さが略同一であり、該凹凸部の複数の凸部の上面に選択結合性物質が固定化された基材を用いて検体に含まれる被検物質を検出する方法であって、集光された光を該基材平坦部で焦点を合わせてから該基材凹凸部の凸部上面に照射し、選択結合性物質と被検物質との反応を検出する方法。
- 該凹凸部の凸部上面が実質的に平坦であり、選択結合性物質が固定化された凸部上面の高さが、略同一である請求項1に記載の検出する方法。
- 選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部の高さと、最も低い凸部の高さの差が50μm以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の検出する方法。
- 凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が50μmである請求項1から3のいずれかに記載の検出する方法。
- 基材上に設けられた複数の凸部の上面の面積が、略同一である請求項1から4のいずれかに記載の検出する方法。
- 少なくとも基材の一部が黒色である請求項1から5のいずれか記載の検出する方法。
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