CN103717754A - 使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法。更具体地说，本发明涉及一种方法，其包含将含有靶核酸的样品施加于具有有DNA探针固定其上的基底的DNA芯片，使与双螺旋核酸相结合的嵌入剂在其中偶联的金属纳米粒子起反应，以及使金属增强溶液起反应从而放大所述金属纳米粒子的尺寸并用肉眼检测所述靶核酸。根据本发明的检测核酸的方法使用嵌入剂偶联的金属纳米粒子，并因此能够在没有任何其它设备的情况下用肉眼检测核酸；因此，与传统的检测方法相比，本发明具有降低分析成本和检测所需时间的效果，并能够使装置的尺寸小型化，从而能够在畜牧场、家里或类似的地方进行现场诊断。

Description

使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法
技术领域
本发明涉及使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法，更具体地说，涉及一种方法，其中将含靶核酸的样品施加于其中探针被固定于基底的DNA芯片，使与嵌入剂偶联的金属纳米粒子起反应，使金属增强溶液起反应，金属纳米粒子的尺寸被放大，并用肉眼检测所述靶核酸。
背景技术
生物芯片是指生物信息检测元件，其中生物材料比如DNA、蛋白质、抗体、糖链、细胞或神经元以高密度整合于固体基质比如玻璃、硅树脂、聚合物上，以超高速度分析极微量的样品，获得生物信息比如基因表达模式、遗传缺陷、蛋白分布和神经元之间的相互信息交流，并且生物化学鉴定、反应速率或信息处理速率提高。
生物芯片可根据与生物分子的系统化程度分为DNA芯片、RNA芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、神经元芯片等等，并且可被广义地定义为包括可检测和分析各种生化材料的“生物传感器”，比如以小尺寸整合样品预处理、生化反应、检测和数据分析并具有自动分析功能的芯片实验室。
特别是，根据人类基因组计划的进程，DNA芯片技术已作为取代现有分子生物学研究方法的技术进入了公众注意的中心。在DNA芯片中，数十到数百万种的DNA片段被整合入非常小的表面比如载玻片。使用DNA芯片的DNA检测方法可在短时间内检测少量样品中所包含的RNA或DNA，并已引起公众的注意，因为它能够使现有的Southern blot和Northern blot在短时间内大规模的进行。DNA芯片可用于基因组DNA的突变检测、基因诊断、药物基因组学、个体化用药和对于基因组研究和分子生物学研究必不可少的大规模的RNA表达测量。
目前，已出台两种DNA芯片，寡核苷酸芯片和cDNA芯片。在寡核苷酸芯片中，成千上万的20到25聚体的寡核苷酸被整合。在cDNA芯片中，比所述寡核苷酸长的cDNA片段被整合。
在DNA芯片的已知的基本原理中，使用各种方法将具有特异序列的探针DNA片段整合入被称作芯片的表面，并从整合的探针DNA片段中检测结合所述样品中所含靶DNA（或RNA）的大量的探针DNA。
制作和使用DNA芯片的技术包括固定可特异性与靶DNA反应的探针的技术，检测反应是否发生的技术，以及可处理所检测信息的信息处理技术。
用于检测反应是否发生的技术通常使用特定类型的标记比如荧光、彩色显影和同位素。标记技术对于增加灵敏度是重要的，但是生物分子可由于标记而变形并且难以标记低分子物质。此外，大量的样品用于标记步骤，而且还需要2到3个操作。目前主要使用的代表性的标记方法包括使用激光的荧光检测方法。在所述使用激光的荧光检测方法中，荧光物质与样品结合，并使用所结合的荧光物质光学测定与固定于基底上的探针的反应。尽管荧光检测方法目前被广泛应用，但是需要光学测量仪来测定反应是否发生，从而需要很多时间和成本。另外，当使用这种检测方法时，难以最小化基于DNA芯片的分析系统。另外，进一步需要将所述荧光物质连接到样品中的靶分子的操作，与无标记的检测方法相比较为繁琐。
因此，使用无标记方法的测量技术在DNA芯片技术领域中已越来越被需要。一种这样的无标记检测方法为电化学检测方法。在所述电化学检测方法中，使用电极上的其它化学物质的电化学反应进行检测反应，其中所述探针和样品结合。然而，这种方法比荧光检测方法具有相对低的测量能力。
如上文所述，现有的检测方法具有有限的效率。因此，当这些方法在生化实验中应用和进行时，所述实验总是牵涉在实际使用方面可靠性和满意度最小化的问题。
因此，发明人试图解决低效率以及现有DNA芯片中所需要的额外的昂贵的仪器的问题。当与嵌入剂偶联的金属纳米粒子结合于与DNA探针结合的靶核酸并且金属增强溶液起反应时，由于所述金属增强溶液，所述金属纳米粒子被放大至可用肉眼观察，并因此能够进行无额外仪器的无标记检测。进一步地，发明人证实了所述靶核酸的定量分析可使用一般的扫描仪进行并完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明提供了一种不需要昂贵仪器、用肉眼快速检测和定量核酸的方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，有提供一种使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法。该方法包括(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的DNA探针的基底，并使所述探针和所述靶核酸杂交；(b)使与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子与在(a)的操作中杂交的双螺旋核酸反应；(c)使金属增强溶液与结合于所述双螺旋核酸的所述金属纳米粒子反应；以及(d)通过分析反应斑点的颜色变化来检测所述靶核酸。
根据本发明的另一方面，有提供一种使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子定量核酸的方法。该方法包括(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的探针的基底，并使所述探针和所述靶核酸杂交；(b)使与所述嵌入剂偶联的金属纳米粒子与在(a)的操作中杂交的双螺旋核酸反应；(c)使金属增强溶液与结合于所述双螺旋核酸的所述金属纳米粒子反应；以及(d)通过分析反应斑点的颜色变化来定量所述靶核酸。
有益效果
根据本发明，检测核酸的方法使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子。因此，与现有检测方法相比，能够在没有任何仪器的情况下用肉眼检测核酸，并减少检测时间和分析成本。另外，它能够使装置最小化以及在奶牛养殖场或家里进行现场诊断。
附图简介
图1图示说明了根据本发明的检测核酸的方法的过程。
图2图示说明了根据本发明的将作为嵌入剂的道诺霉素与双螺旋核酸结合的过程和偶联道诺霉素和金纳米粒子的过程。
图3为显示由与靶核酸DNA的特异杂交反应产生的每个DNA浓度的斑点和其以灰度形式的定量分析结果的图表。
发明模式
根据本发明的一个方面，有提供一种使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法。该方法包括(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的DNA探针的基底，并使所述探针与所述靶核酸杂交；(b)使与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子与在(a)的操作中杂交的双螺旋核酸反应；(c)使金属增强溶液与结合所述双螺旋核酸的金属纳米粒子反应；以及(d)通过分析反应斑点的颜色变化来检测所述靶核酸。
在本发明中，所述基底的类型包括在相关领域中常用的用于制作DNA芯片的固体基底而没有限制。优选地，可使用玻璃、氧化铝、陶瓷、碳、金、银、铜、铝、化合物半导体、硅树脂等。更优选地，可使用玻璃基底。在所述基底上进行表面处理。进行表面处理以容易连接和固定探针分子。另外，可进行表面处理以包括用于在所述DNA芯片的物质表面上固定生物分子的官能团。例如，所述基底可改良成醛基、羧基或胺基。当使用玻璃基底或半导体基底时，进行硅烷处理以形成氨基（比如-NH3或-NH2）。为了有效地进行所述硅烷处理，也可在硅烷处理前进行生成羟基（-OH）的处理。在本发明中，在所述基底上固定探针分子的任何方法均可使用而没有限制，并且可使用化学或物理方法。
在本发明的实施方案中，在玻璃基底的表面进行O2等离子处理，-OH暴露于所述玻璃基底的表面，所述表面用胺基进行功能化，用胺基处理的表面用羧基进行取代，并且将具有氨基(-NH2)的作为探针的DNA通过肽键作为共价键固定于所述基底上。没有结合所述DNA的基底通过与具有胺基的聚乙二醇（PEG）反应而封闭以防止背景染色。
在本发明中，术语“DNA探针”是指可特异地结合样品中要被检测的靶核酸的物质和可通过所述结合特异地检查靶核酸是否在样品中存在的物质。
在本发明中，术语“靶核酸”是指样品中的要被检测的物质。所述靶核酸的类型包括DNA、RNA、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）等等，并且更优选地，是指DNA。更具体地说，所述靶核酸可作为生物材料或类似地来源于有机体，或体外制备，DNA包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸，并且RNA包括基因组RNA、mRNA、寡核苷酸等。
在本发明中，术语“样品”是指组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液或尿液，其包含要被检测的所述靶核酸，但是所述样品不限于此。
在本发明中，术语“斑点”是指其中探针被精细地整合在基底上的部分，也就是说，是指其中DNA探针被固定于基底上比如所述DNA芯片的部分。
当包含靶核酸的所述样品接触到其中具有固定的DNA探针的基底时，探针分子和样品中的靶核酸之间的特异结合反应，即靶核酸和DNA探针的互补序列之间的特异杂交反应发生。
在本发明的实施方案中，将能够检测靶核酸的探针固定于基底上，并且为了减少非特异反应，使用封闭分子封闭其中探针不起反应的部分。此时，当要被测量的靶核酸起反应时，具有互补序列的靶核酸和探针杂交并形成双螺旋形式。在所述靶核酸起反应后，与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子起反应，所述嵌入剂仅结合杂交的双螺旋核酸而不结合非杂交部分，并因此纳米粒子不连接到那。
在本发明中，术语“嵌入剂”是指能嵌入双螺旋核酸的所有物质并且可包括硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、盐酸道诺霉素、诺加霉素、阿霉素、赫达霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎纳克林和吖啶橙。
在本发明的实施方案中，制备金属纳米粒子溶液，加入所述嵌入剂并起反应，然后制备与所述嵌入剂偶联的金属纳米粒子。在此，加入所述金属纳米粒子溶液的所述嵌入剂的比例可为0.1mM到1mM，并且反应时间可为大约3到10小时。在这种情况下，在所述偶联的金属纳米粒子中，通过通过现有的精制方法比如透析去除未结合所述嵌入剂的金属纳米粒子从而仅获得与道诺霉素偶联的金属纳米粒子。
所述金属纳米粒子可包括金（Au）、银（Ag）和铂（Pt），可通过混合金属离子和还原剂而制备，或者也可很容易地从商业试剂公司比如Sigma获得。
在本发明中，进行其中所述金属增强溶液起反应的操作(c)以放大结合所述杂交的双螺旋核酸的与所述嵌入剂偶联的金属纳米粒子的尺寸，并因此用肉眼检测和测量所述靶核酸。
在本发明中，术语“金属增强溶液”是指金属离子的溶液并且是指当使用所述金属纳米粒子作为催化剂还原所述金属纳米粒子周围的金属离子时可以放大纳米粒子尺寸的溶液。可没有限制地使用相关领域中常用的能够放大纳米粒子尺寸的金属增强溶液。优选地，可使用包含金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)或钯(Pd)离子的溶液，更优选地，可使用包含金离子的溶液。
在本发明中，所述靶核酸可通过用肉眼观察操作(d)中的斑点的颜色变化来检测，但是本发明不限于此。所述靶核酸可通过使用光学原理比如反射方法或透射方法测量反射光或透射光的强度变化来检测。在这种情况下，最终检测信号可通过黑与白的灰度大小来表示。
例如，灰度光强度可使用短波长光源比如LED或激光二极管并使用光电二极管阵列比如CMOS或CCD作为光检测装置进行测量，但是本发明不限于此。可使用普通光扫描器进行分析。
在本发明的实施方案中，与所述嵌入剂偶联的金纳米粒子起反应，以及金增强溶液起反应1分钟。其结果是，金离子减少，金纳米粒子的周边包被有金属，所述粒子的尺寸增加，以及靶核酸与其连接的部分以灰色出现并用肉眼观察。特别地，观察到与探针特异反应的部分呈现深灰色而非特异部分呈现非常浅的灰色或者看不到。因此，根据本发明的方法，能够通过在靶核酸或探针分子上简单地标记荧光物质或者使用所述DNA芯片在没有额外的光学仪器或荧光扫描器的情况下用肉眼检测所述靶核酸（图1）。
根据本发明的另一个方面，有提供一种使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子定量核酸的方法。该方法包括(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的探针的基底，并使所述探针与所述靶核酸杂交，(b)使与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子与操作(a)中杂交的双螺旋核酸反应;(c)使金属增强溶液与结合所述双螺旋核酸的金属纳米粒子反应；以及(d)通过分析反应斑点的颜色变化来定量所述靶核酸。
在本发明中，测量操作(d)中与所述金属增强溶液反应的部分的反应强度用于样品中的靶核酸的定量分析。随着样品中的靶核酸浓度增加，与所述金属增强溶液反应的部分的反应强度也增加，并因此能够定量所述靶核酸。
操作(d)中斑点的颜色变化可使用利用光学原理比如反射方法或透射方法的反射光或透射光的强度变化来测量。最终检测信号可通过黑与白的灰度大小来表示。
例如，灰度光强度可使用短波长光源比如LED或激光二极管，并使用光电二极管阵列比如CMOS或CCD作为光检测装置进行测量，但是本发明不限于此。可使用普通光扫描器进行分析。
在本发明的实施方案中，观察到随着靶核酸从1pM增至100nM，灰色的斑点变得较暗和较大。使用普通扫描器捕获该变化并使用Adobe Photoshop软件分析灰度变化。结果，观察到，随着靶核酸的浓度增加，灰度值也增加，并且所述靶核酸未连接其上的周围基底无关所述浓度而呈恒定值。因此，能使用普通扫描器和通用软件定量分析靶核酸。
以下，将参考实施例具体地描述本发明。这些实施例应被认为仅为描述性的意义，并且本发明的范围并不限于这些实施例，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例1.制备与嵌入剂偶联的金属纳米粒子的方法
为了制备与嵌入剂偶联的金属纳米粒子，将18.5ml蒸馏水倒入容器中。当所述容器以500RPM摇动时，加入500μL HAuCl4(10mM)、500μL柠檬酸钠(10mM)和500μL NaBH4(100mM)并反应三小时，加入400μL10%的十二烷基硫酸钠(SDS)，以及加入400μL道诺霉素(10mM,Sigma Aldrich)，反应六小时或以上以达到0.2mM的最终浓度，以及最后在0.2%SDS柠檬酸钠(2.5mM)溶液中透析。在去除未连接金纳米粒子的道诺霉素后，最终获得与精制的道诺霉素偶联的金纳米粒子。
实施例2.玻璃基底的处理
将玻璃基底使用Piranha溶液清洗，进行O2等离子处理，并将-OH基暴露于所述玻璃基底的表面。将所述玻璃基底与在乙醇溶液中制备的2%氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）反应两个小时。反应两小时后，将所述表面用乙醇清洗、干燥并在120℃的电热板上烘烤1小时，从而所述玻璃基底的表面用胺进行了功能化。所述基底在二甲基甲酰胺（DMF）中与琥珀酰酐（1M）反应过夜，然后清洗，用胺处理的玻璃基底用羧基(-COOH)进行取代。
实施例3.制作DNA芯片
为了制作DNA芯片，首先，EDC/NHS反应15分钟，10μM的包含NH2-O-AATGGTTTATTCTGCTCA的DNA(以下称为“H5”)和50μM的包含NH2-O-GACATCAAGCAGCCATC的对照DNA(以下称为“HM”)反应1小时，从而将作为探针的DNA固定于实施例1中所制备的玻璃基底。为了封闭其中DNA未被固定的部分，具有氨基末端的乙醇胺（1M）反应1小时，从而制作有探针连接其中的DNA芯片。
实施例4.与靶核酸DNA的特异杂交反应
为了核实靶核酸DNA和实施例2中制备的有探针连接其中的DNA芯片的特异杂交反应，在作为探针的所述H5DNA中，将具有TGA GCA GAA TAA ACCATT的序列（其为互补序列ID NO.1）的靶DNA(Bioneer,Korea)和作为所述对照的序列ID NO.2GAT GGC TGC TTG ATG TC用杂交缓冲液(5XSSC,0.2%SDS)稀释，并进行各个浓度的杂交反应。
实施例5.与靶核酸DNA的特异杂交反应的放大和测量
为了放大和测量与靶核酸DNA的特异杂交反应，将实施例4中在其上进行杂交反应的DNA芯片用SSC缓冲溶液清洗，去除未反应的DNA。然后，与所述嵌入剂偶联的金纳米粒子反应10分钟，用所述SSC缓冲溶液清洗，并与所述金增强溶液(0.85mL HAuCl4(10mM)、0.25mL AgNO3(10mM)、0.27mL抗坏血酸(100mM)、20mL CTAB(100mM))反应1分钟。然后，将在其上进行所述杂交反应的DNA芯片用水清洗，并观察所述特异杂交反应。
首先，使用普通扫描器观察玻璃基底上形成的斑点。如图3中所示，能够用肉眼观察到，仅在其中与靶核酸DNA的特异杂交反应发生的部分形成灰色斑点。在图3中，所述靶核酸DNA特异地连接作为探针的H5并形成灰色斑点，所述对照DNA仅特异地连接作为对照的HN并形成灰色斑点。可以看出，在非互补的探针DNA和靶核酸DNA处没有斑点出现或斑点模糊地出现，并且灰色的颜色强度根据所述靶核酸DNA的浓度而增加。因此，可以证实，本发明的杂交反应为特异地进行的，所述嵌入剂与其中杂交反应发生的靶核酸DNA和探针DNA的结合相结合。当处理引起还原反应的金增强溶液时，金属离子使用金纳米粒子作为催化剂进行还原，并且粒子的尺寸增加到能够在没有额外的光学仪器的存在下用肉眼观察斑点的程度。
此外，使用Adobe Photoshop软件对所获得的各个浓度靶核酸DNA的斑点以灰度形式进行定量分析。如图3中所示，结果显示从1pM到100nM的各个浓度的灰度值增加。另一方面，可以观察到，在所述靶核酸不与其连接的周围基底上无关浓度进行背景染色。
已具体描述了本发明内容的特定部分。然而，这些具体的描述仅为示例性的实施例，本发明的范围并不限于此，这对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明的范围由所附权利要求书及其等同物所限定。
工业实用性
在根据本发明的检测核酸的方法中，能够在没有任何仪器的情况下用肉眼检测核酸、使装置最小化并进行现场诊断。

Claims (15)

1.一种包括以下操作的使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子检测核酸的方法，所述方法包括：
(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的DNA探针的基底，并使所述探针和所述靶核酸杂交；
(b)使与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子与在操作(a)中杂交的双螺旋核酸反应；
(c)使金属增强溶液与结合于所述双螺旋核酸的金属纳米粒子反应；以及
(d)通过分析反应斑点的颜色变化检测所述靶核酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的所述检测为用肉眼进行测量。
3.权利要求1所述的方法，其中操作(d)中所述斑点的颜色变化用于测量反射光或透射光的强度变化。
4.权利要求1所述的方法，其中所述基底选自由玻璃、氧化铝、陶瓷、碳、金、银、铜、铝和硅树脂组成的组。
5.权利要求1所述的方法，其中所述嵌入剂选自由硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、道诺霉素、诺加霉素、阿霉素、赫达霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎纳克林和吖啶橙组成的组。
6.权利要求1所述的方法，其中所述金属纳米粒子选自由金（Au）、银（Ag）和铂（Pt）组成的组。
7.权利要求1所述的方法，其中所述金属增强溶液选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、钯及其混合物组成的组。
8.权利要求1所述的方法，其中操作(c)中的所述金属增强溶液还原金属离子并放大结合于所述双螺旋核酸的金属纳米粒子的尺寸。
9.一种包括以下操作的使用与嵌入剂偶联的金属纳米粒子定量核酸的方法，所述方法包括：
(a)将包含靶核酸的样品施加于其中固定有要与所述靶核酸杂交的探针的基底，并使所述探针和所述靶核酸杂交；
(b)使与所述嵌入剂偶联的所述金属纳米粒子与操作(a)中杂交的双螺旋核酸反应；
(c)使金属增强溶液与结合于所述双螺旋核酸的金属纳米粒子反应；以及
(d)通过分析反应斑点的颜色变化定量所述靶核酸。
10.权利要求9所述的方法，其中所述基底选自由玻璃、氧化铝、陶瓷、碳、金、银、铜、铝和硅树脂组成的组。
11.权利要求9所述的方法，其中所述嵌入剂选自由硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、道诺霉素、诺加霉素、阿霉素、赫达霉素、米托蒽醌、替洛隆、赫斯特33258、奎纳克林和吖啶橙组成的组。
12.权利要求9所述的方法，其中所述金属纳米粒子选自由金（Au）、银（Ag）和铂（Pt）组成的组。
13.权利要求9所述的方法，其中所述金属增强溶液选自由金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、铂(Pt)、钯及其混合物组成的组。
14.权利要求9所述的方法，其中操作(c)中的所述金属增强溶液还原金属离子并放大结合于所述双螺旋核酸的金属纳米粒子的尺寸。
15.权利要求9所述的方法，其中操作(d)中的斑点的颜色变化用于测量反射光或透射光的强度变化。
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