WO2013022203A9 - 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법 - Google Patents

인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법 Download PDF

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정봉현
김상규
조현민
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a nucleic acid using a metal nanoparticle conjugated with an intercalator, and more particularly, applying a sample containing a target nucleic acid to a DNA chip having a probe fixed on a substrate, and then The present invention relates to a method for amplifying the size of the metal nanoparticles by visually detecting a target nucleic acid by reacting a conjugated metal nanoparticle with a metal enhancing solution.
  • Biochip integrates biomaterials such as DNA, proteins, antibodies, sugar chains, cells or neurons at high density onto solid substrates such as glass, silicon, and polymers, and analyzes trace amounts of samples at ultra-high speed. It is a bioinformation sensing device that obtains biological information such as protein distribution and mutual information exchange between neurons, or increases biochemical identification and reaction speed or information processing speed.
  • Biochips can be classified into DNA chips, RNA chips, protein chips, cell chips, and neuron chips according to the degree of biomolecules and systemization.In addition, biochips are compactly integrated for sample pretreatment, biochemical reactions, detection, and data interpretation. It can be defined broadly, including a 'bio sensor' capable of detecting and analyzing various biochemicals such as a lab on a chip.
  • the DNA chip is a small amount of dozens or millions of DNA fragments accumulated on a very small surface such as a slide glass.
  • the DNA detection method using this method can detect RNA or DNA contained in a small amount of sample in a short time. Southern blots and Northern blots are in the spotlight in that they can be performed in large quantities in a short time.
  • the DNA chip can be applied to a large amount of RNA expression measurement, genomic DNA mutation detection, gene diagnosis, pharmacogenomics, and customized medicine, which are essential for genomic and molecular biological studies.
  • the basic principle of the known DNA chip is to accumulate a fragment of probe DNA having a specific sequence on a surface called a chip in various ways, and then target DNA (which contains the probe DNA in the sample). Or RNA).
  • Techniques for fabricating and using such DNA chips include immobilization of probes that can specifically react with target DNA, detection technologies that can detect the presence or absence of reactions, and information processing technologies that can process detected information. have.
  • a detection technique capable of detecting the presence of a reaction generally uses a specific type of label such as fluorescence, color development, and isotope.
  • Labeling technology is an important technology in increasing sensitivity, but there is a problem that the labeling of biomolecules or low-molecular substances may be impossible to label. In addition, a lot of samples are consumed in the labeling process, there is a problem that must go through more than two to three steps.
  • Representative labeling methods mainly used at present include a fluorescence detection method using a laser.
  • the fluorescence detection method using the laser is a method of optically distinguishing the reaction using a fluorescent material combined with a probe immobilized on a substrate by binding a fluorescent material to a sample, but is currently the most widely used method.
  • Optical measuring equipment is needed to determine whether or not, and this requires a lot of time and cost, and this detection method has some limitations in miniaturizing an analysis system based on DNA chips. have.
  • a step of attaching a fluorescent material to a target molecule of a sample is additionally required, and has a disadvantage in that it is cumbersome compared to an unlabeled detection method.
  • unlabeled measurement technology is increasingly required in the field of DNA chip technology.
  • One of the unlabeled detection methods is an electrochemical detection method, which detects the reaction by using an electrochemical reaction of another chemical on the electrode where the probe and the sample are combined. There is a problem falling.
  • the present inventors have made diligent efforts to overcome the problems and inefficiencies of the expensive separate equipment of the existing DNA chip, and as a result, combine the metal nanoparticles conjugated with the intercalator to the target nucleic acid combined with the DNA probe
  • the metal nanoparticles are amplified by the metal enhancement solution so that they can be observed with the naked eye. It was confirmed that the quantitative analysis of the target nucleic acid can be used to complete the present invention.
  • the present invention comprises the steps of (a) hybridizing the probe and the target nucleic acid by applying a sample containing the target nucleic acid to a substrate on which a DNA probe hybridizing with the target nucleic acid is immobilized; (b) reacting metal nanoparticles having an intercalator conjugated to the double-stranded nucleic acid hybridized in step (a); (c) reacting a metal enhancement solution with the metal nanoparticles bound to the double-stranded nucleic acid; And (d) analyzing the color change of the reacted spot to detect a target nucleic acid.
  • the present invention also comprises the steps of (a) applying a sample containing the target nucleic acid to the substrate to which the probe hybridizing with the target nucleic acid hybridization of the probe and the target nucleic acid; (b) reacting the metal nanoparticles conjugated with the intercalator with the double-stranded nucleic acid hybridized in step (a); (c) reacting a metal enhancement solution with the metal nanoparticles bound to the double-stranded nucleic acid; And (d) analyzing the color change of the reacted spot to quantify the target nucleic acid, thereby providing a method for quantifying nucleic acid using a metal nanoparticle conjugated with an intercalator.
  • Nucleic acid detection method by using the metal nanoparticles conjugated to the intercalator, it is possible to detect the nucleic acid without any other equipment, as well as the effect of reducing the detection time and analysis cost than the conventional detection method
  • the miniaturization of the device has the advantage that the on-site diagnosis is possible in livestock farms or homes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method of detecting a nucleic acid according to the present invention.
  • Figure 2 schematically shows the process of binding the intercalator daunorubicin to the double nucleic acid in the present invention and schematically shows the process of conjugated daunorubicin and gold nanoparticles.
  • FIG. 3 is a graph showing spots obtained according to DNA concentrations and the results of quantitative analysis on a gray scale as a result of specific hybridization with the target nucleic acid DNA.
  • step (a) hybridizing a probe and a target nucleic acid by applying a sample containing the target nucleic acid to a substrate on which a DNA probe hybridizing with the target nucleic acid is immobilized; (b) reacting metal nanoparticles having an intercalator conjugated to the double-stranded nucleic acid hybridized in step (a); (c) reacting a metal enhancement solution with the metal nanoparticles bound to the double-stranded nucleic acid; And (d) relates to a method for detecting a nucleic acid using a metal nanoparticle conjugated with an intercalator comprising the step of detecting the target nucleic acid by analyzing the color change of the reacted spot.
  • the type of the substrate in the present invention can be used without limitation as long as it is a solid substrate for the production of DNA chips commonly used in the art, preferably glass, alumina, ceramic, carbon, gold, silver, copper, aluminum, compound semiconductor And silicon, and the like, and most preferably, a glass substrate.
  • the substrate is surface treated, which is performed to facilitate the attachment and immobilization of probe molecules.
  • the surface treatment may be performed to include a functional group for immobilizing the biomolecule on the substrate surface of the DNA chip.
  • the substrate may be modified with an aldehyde group, a carboxyl group or an amine group.
  • a glass substrate or a semiconductor substrate may be a silane treatment to form an amino group (-NH 3, -NH 2, etc.).
  • a treatment for making hydroxyl (-OH) groups may be performed before the silane treatment.
  • methods for immobilizing probe molecules on a substrate may be used without limitation, and chemical or physical methods may be used.
  • the surface of the glass substrate is subjected to O 2 plasma treatment to expose -OH groups on the surface of the glass substrate, functionalize with an amine group on the surface, and then replace the surface treated with the amine with a carboxyl group.
  • the substrate was immobilized on the substrate through a peptide bond covalently bonded to DNA which is a probe having an amine group (-NH 2 ).
  • the substrate not bound to the DNA was blocked by reacting with PEG (polyethylene glycol) having an amine group to prevent background staining.
  • DNA probe means a substance that can specifically bind to a target nucleic acid to be detected in a sample, and means a substance that can specifically confirm the presence of the target nucleic acid in the sample through the binding. It is.
  • target nucleic acid is a substance to detect whether it is present in a sample, and the type of target nucleic acid may be DNA, RNA, peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), or the like. Most preferably DNA. More specifically, the nucleic acid of interest includes a biological material derived from, or similar to, or produced in vitro, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotide, RNA is genomic RNA, mRNA, oligonucleotide And the like.
  • sample in the present invention includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine containing the desired nucleic acid to be detected.
  • the term 'spot' refers to a portion in which a probe is finely integrated on a substrate, that is, a portion in which a DNA probe is fixed on a substrate such as a DNA chip.
  • a probe capable of sensing a target nucleic acid is immobilized on a substrate, and a portion of the probe that is not reacted is blocked using a blocking molecule to reduce nonspecific reaction.
  • the probe having the complementary sequence and the target nucleic acid hybridize to form a double helix.
  • the metal nanoparticles conjugated with the intercalator are reacted, the nanoparticles are bound to the hybridized double-stranded nucleic acid and the intercalator is not bound to the hybridized double-stranded nucleic acid. It will not stick.
  • the term "intercalator” refers to any substance capable of intercalating double-stranded nucleic acids, for example, streptomycin sulfate, gentamicin sulfate, daunoru Daunorubicin hydrochloride, nogalamycin, noxoamycin, doxorubicin, hedamycin, mitosantron, tirolone, hechst 33258, quinacrine (Quinacrine), Acridin Orange, and the like.
  • the metal nanoparticle solution was prepared, and then reacted by adding an intercalator, thereby preparing metal nanoparticles conjugated with an intercalator.
  • the ratio of the intercalator added to the metal nanoparticle solution is 0.1mM to 1mM
  • the reaction time may be about 3 hours to about 10 hours.
  • the conjugated metal nanoparticles can be obtained only through the conventional purification method such as dialysis, except for the metal nanoparticles not conjugated with the intercalator, only metal nanoparticles conjugated with daunorubicin.
  • the metal nanoparticles may be gold (Au), silver (Ag), and platinum (Pt), may be prepared by mixing metal ions with a reducing agent, and may be commercially available from a reagent company such as Sigma.
  • the step of reacting the metal enhancement solution of step (c) comprises amplifying the size of the metal nanoparticle conjugated with the intercalator conjugated to the hybridized double-stranded nucleic acid to visually detect the target nucleic acid.
  • the term "metal enhancement solution” refers to a solution that can amplify the size of the nanoparticles while reducing the metal ions around the metal nanoparticles by using metal nanoparticles as a catalyst as a solution consisting of metal ions.
  • a metal enhancement solution capable of amplifying the size of nanoparticles solutions commonly used in the art may be used without limitation, but preferably gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum ( It may be a solution containing Pt) or palladium (Pd) ions, and most preferably a solution containing gold ions.
  • the target nucleic acid can be detected by visually confirming the color change of the spot of the step (d), and the present invention is not limited thereto.
  • the change in the intensity of the reflected or transmitted light using an optical principle such as a reflection method or a transmission method It can be measured and detected.
  • the final detection signal can be expressed according to the magnitude of the gray scale of black and white.
  • a gray wavelength light intensity may be measured using a short wavelength light source such as an LED or a laser diode, and a photodiode array such as a CMOS or a CCD as the photodetector, but is not limited thereto. Can be.
  • a short wavelength light source such as an LED or a laser diode
  • a photodiode array such as a CMOS or a CCD as the photodetector
  • the intercalator reacted with the conjugated gold nanoparticles, and the gold enhancement solution was reacted for 1 minute.
  • the gold ions were reduced, the metal was coated around the gold nanoparticles, thereby increasing the size of the particles.
  • the part that specifically reacted to the probe was dark gray, and the non-specific part was confirmed to be very light gray or not visible. Therefore, according to the method of the present invention, a target nucleic acid can be detected by simply labeling a target nucleic acid or a probe molecule with a fluorescent substance or by using a DNA chip with the naked eye without a separate optical device or a fluorescence scanner (FIG. 1).
  • step (a) applying a sample containing a target nucleic acid to a substrate on which a probe hybridizing with the target nucleic acid is immobilized to hybridize the probe and the target nucleic acid; (b) reacting the metal nanoparticles conjugated with the intercalator with the double-stranded nucleic acid hybridized in step (a); (c) reacting a metal enhancement solution with the metal nanoparticles bound to the double-stranded nucleic acid; And (d) relates to a method for quantifying nucleic acid using a metal nanoparticle conjugated with an intercalator comprising the step of quantifying the target nucleic acid by analyzing the color change of the reacted spot.
  • measuring the intensity of the reaction of the portion reacted with the metal enhancement solution of step (d) is a step for quantitatively analyzing the target nucleic acid present in the sample, and the concentration of the target nucleic acid present in the sample is increased. As the intensity of the reaction of the portion reacted with the metal enhancement solution increases, the target nucleic acid can be quantified.
  • the color change of the spot of step (d) may be performed by measuring the change of the intensity of the reflected or transmitted light by using an optical principle such as a reflection method or a transmission method, and the final detection signal is based on the size of the gray scale of black and white. I can express it.
  • a gray wavelength light intensity may be measured using a short wavelength light source such as an LED or a laser diode, and a photodiode array such as a CMOS or a CCD as the photodetector, but is not limited thereto. Can be.
  • a short wavelength light source such as an LED or a laser diode
  • a photodiode array such as a CMOS or a CCD as the photodetector
  • the concentration of the target nucleic acid is increased from 1pM to 100nM gray spots became darker and larger, and obtained by analyzing on a gray scale using a photoshop software of Adobe (Adobe)
  • the results showed that the gray scale value increased as the concentration of the target nucleic acid increased, whereas the peripheral substrate without the target nucleic acid showed a constant value regardless of the concentration, quantifying the target nucleic acid using a general scanner and ordinary software. It was confirmed that the analysis is possible.
  • the glass substrate was cleaned using a piranha solution and subjected to O 2 plasma treatment to expose -OH groups on the surface of the glass substrate.
  • the glass substrate was reacted with 2% aminopropyltriethoxysilane (APTES) prepared in ethanol solution for 2 hours. After the reaction for 2 hours, the surface was washed with ethanol and dried, and then baked for 1 hour on a 120 °C hot plate, the surface of the glass substrate functionalized (amine) with (amine).
  • the substrate was reacted with 1 M succinic anhydride in DMF (dimethylformamide) for one night, and then washed to replace the glass substrate, which was treated with amine, with a carboxyl group (-COOH).
  • the first EDC / NHS was reacted for 15 minutes, NH 2 -O-AATGGTTTATTCTGCTCA (hereinafter, "H5" as name cards) 10 ⁇ M of DNA and NH 2 -O-GACATCAAGCAGCCATC (hereinafter consisting of, 50 ⁇ M of control DNA consisting of "HM”) was reacted for 1 hour to fix DNA serving as a probe on the glass substrate prepared in Example 1 above.
  • 1M Ethanol Amine having an amine at the end was reacted for 1 hour to prepare a DNA chip to which a probe was attached.
  • the target nucleic acid having the sequence of TGA GCA GAA TAA ACC ATT of SEQ ID NO: 1 complementary to the probe H5 DNA DNA (Bioneer, Korea) and GAT GGC TGC TTG ATG TC (SEQ ID NO: 2) were diluted in Hybridization Buffer (5XSSC, 0.2% SDS) and hybridized by concentration.
  • the DNA chip hybridized in Example 4 was washed with SSC buffer to remove unreacted DNA. Thereafter, the intercalator reacted the conjugated gold nanoparticles for 10 minutes, and then washed with SSC buffer, followed by gold enhancement solution (0.85 mL HAuCl 4 (10 mM), 0.25 mL AgNO 3 (10 mM), 0.27 mL Ascorbic acid (100mM), 20mL CTAB (100mM)) was reacted for 1 minute. Thereafter, the DNA chip subjected to the hybridization reaction was washed with water to observe a specific hybridization reaction.
  • gold enhancement solution 0.85 mL HAuCl 4 (10 mM), 0.25 mL AgNO 3 (10 mM), 0.27 mL Ascorbic acid (100mM), 20mL CTAB (100mM)
  • the target nucleic acid DNA was specifically attached to H5 which is a probe to form a gray color spot
  • the control DNA was specifically attached to only the control HN to form a gray color spot. It was confirmed that spots are not visible or faint in non-complementary probe DNA and target nucleic acid DNA, and that the intensity of gray color is large depending on the concentration of the target nucleic acid DNA, thereby making the hybridization reaction of the present invention specific.
  • the gold nanoparticles can be identified with the naked eye without an additional optical device.
  • As a catalyst it was confirmed that as the metal ions are reduced to increase the size of the particles.
  • the gray scale value was increased from 1 pM to 100 nM for each concentration. I could confirm that. On the other hand, it was confirmed that the background staining was performed regardless of the concentration in the surrounding substrate without the target nucleic acid.
  • Nucleic acid detection method according to the present invention can be detected with the naked eye without any other equipment, and the size of the device can be miniaturized, the field diagnosis is possible.

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Abstract

본 발명은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 기판 상에 DNA 프로브가 고정된 DNA칩에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용시킨 다음, 이중나선 핵산과 결합하는 인컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시킨 후 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시켜서 상기 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 육안으로 목적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용함으로써, 다른 어떠한 장비 없이도 육안으로 핵산 검출이 가능하여 기존의 검출 방식보다 검출 시간 및 분석 비용이 절감되는 효과뿐만 아니라 장치의 소형화가 가능하여 가축 농장이나 가정 등에서 현장 진단이 가능하다는 장점이 있다.

Description

인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법
본 발명은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 기판 상에 프로브가 고정된 DNA칩에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용시킨 다음, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시킨 후 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시켜서 상기 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 육안으로 목적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
바이오칩(Biochip)은 DNA, 단백질, 항체, 당쇄, 세포 또는 뉴런 등의 생체물질들을 유리, 실리콘, 고분자 등의 고체기질 위에 고밀도로 집적화하고 극미량의 시료를 초고속으로 분석해서 유전자 발현양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 신경세포간의 상호 정보교환 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 동정 및 반응속도 또는 정보처리 속도를 높이는 생체정보 감지소자이다.
바이오칩은 생물분자와 시스템화된 정도에 따라 DNA칩, RNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로 구분될 수 있으며, 시료의 전처리, 생화학 반응, 검출 및 자료 해석까지 소형 집적화되어 자동분석기능을 갖는 실험실칩(Lab on a chip)과 같이 각종 생화학물질의 검출 및 분석 기능을 할 수 있는 '바이오 센서'를 포함하여 광범위하게 정의될 수 있다.
특히, 인간 게놈 프로젝트가 진행됨에 따라 기존의 분자생물학적 연구방법들을 대체할 수단으로 DNA칩 기술이 크게 주목받고 있다. DNA칩은 적게는 수십에서 수백만 종류의 DNA 조각을 슬라이드 글라스와 같은 아주 작은 표면에 집적한 것으로 이를 이용한 DNA 검출 방법은 적은 양의 시료에 들어 있는 RNA 또는 DNA를 짧은 시간에 검출할 수 있으므로 기존의 서던 블럿(Southern blot)이나 노던 블럿(Northern blot)을 대량으로 짧은 시간에 수행할 수 있다는 점에서 매우 각광받고 있다. DNA칩은 유전체 연구 및 분자생물학적 연구에 필수적인 대량의 RNA 발현측정, 게놈 DNA의 돌연변이 검출, 유전자 진단, 약물유전학(pharmacogenomics), 맞춤의약 등에 응용할 수 있다.
현재까지 크게 올리고칩(oligochip)과 cDNA 칩이라는 두 가지 종류의 DNA칩이 소개되고 있는데, 전자는 20~25머(mer)의 올리고뉴클레오티드를 수십만개 집적한 것이고, 후자는 올리고뉴클레오티드보다 좀 더 긴 cDNA 조각을 집적한 것이다.
기존에 알려진 DNA칩의 기본 원리는 특정 염기서열을 가진 프로브 DNA 조각을 칩으로 불리는 표면에 다양한 방법으로 집적한 후, 집적된 프로브 DNA 조각 중 어떤 프로브 DNA가 시료에 존재하는 타겟(target) DNA(또는 RNA)와 결합하는지를 다량으로 검출하는 것이다.
이러한 DNA칩을 제작 및 이용하기 위한 기술로는 타겟 DNA와 특이적으로 반응할 수 있는 프로브의 고정화 기술, 반응 유무를 검출할 수 있는 검출 기술 및 검출된 정보를 처리할 수 있는 정보처리기술 등이 있다.
이 중, 반응 유무를 검출할 수 있는 검출 기술은 일반적으로 형광, 발색, 동위원소와 같이 특정한 방식의 표지를 이용하게 된다. 표지기술은 감도를 높이는 데 있어서 중요한 기술이기는 하나, 표지에 의해 생체분자가 변형되거나 저분자 물질은 표지가 불가능할 수 있는 문제점이 있다. 또한 표지과정에서 시료가 많이 소모되며 2~3단계의 공정을 더 거쳐야 하는 문제점이 있다. 현재 주로 사용되고 있는 대표적인 표지 방식으로는 레이저를 이용한 형광검출법 등이 있다. 상기 레이저를 이용한 형광검출법은 시료에 형광물질을 결합시켜 기판에 고정화된 프로브와의 반응 여부를 결합시킨 형광물질을 이용하여 광학적으로 반응 여부를 구별하는 방법으로 현재 가장 널리 이용되고 있는 방법이지만, 반응 여부를 판별하기 위해 광학측정장비가 필요하게 되고, 이로 인해 많은 시간 및 비용이 요구되는 문제점이 있을 뿐만 아니라, 이러한 검출 방식은 DNA칩을 기반으로 한 분석시스템을 소형화하는데 어느 정도 한계가 있다는 문제점이 있다. 또한, 시료의 표적 분자에 형광을 내는 물질을 달아주는 단계가 추가적으로 필요하며, 비표지 방식의 검출 방법에 비해 번거롭다는 단점이 있다.
따라서 비표지 방식의 측정기술이 DNA칩 기술분야에서 점점 요구되고 있다. 비표지 방식의 검출 방법의 하나로서 전기화학적 검출법이 있는데, 이는 프로브와 시료가 결합한 전극 상에서 다른 화학물질의 전기화학반응을 이용하여 반응 여부를 검출하는 방법이지만, 이는 형광검출법에 비해 비교적 측정능력이 떨어지는 문제점이 있다.
이와 같이 종래에 실시하고 있는 검출 방법은 어느 정도 그 효율성에 한계가 있기 때문에 이를 적용하여 실행하는 생화학 실험에 대한 실질적인 사용상의 신뢰도 및 만족도가 극소화되는 문제점들이 항상 내포되어 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 DNA칩이 가지고 있는 고가의 별도의 장비가 필요한 문제점 및 비효율성을 극복하기 위해 예의 노력한 결과, DNA 프로브와 결합한 목적핵산에 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 결합시키고, 금속 인핸싱 용액 (enhancing solution)을 반응시킬 경우, 금속 인핸싱 용액에 의해 금속 나노입자가 육안으로 관찰할 수 있을 정도로 증폭되어 별도의 장비 없이 비표지 방식의 검출이 가능하고, 나아가 일반적인 스캐너를 이용해 목적핵산의 정량적인 분석이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고가의 장비 없이 육안으로 신속하게 핵산을 검출 및 정량하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용함으로써, 다른 어떠한 장비 없이도 육안으로 핵산 검출이 가능하여 기존의 검출 방식보다 검출 시간 및 분석 비용이 절감되는 효과뿐만 아니라 장치의 소형화가 가능하여 가축 농장이나 가정 등에서 현장 진단이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 핵산의 검출방법 과정을 개략적으로 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 있어서 인터컬레이터인 다우노루비신이 이중 핵산에 결합되는 과정을 개략적으로 나타낸 그림 및 다우노루비신과 금 나노입자가 컨쥬게이트하는 과정을 개략적으로 그림으로 나타낸 것이다.
도 3은 목적핵산 DNA와 특이적 혼성화 반응이 일어난 결과로서 DNA 농도별로 얻은 스팟 및 이를 gray scale로 정량 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 기판의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA칩 제작을 위한 고체 기판이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체 및 실리콘 등이 있을 수 있으며, 가장 바람직하게는 유리기판을 이용할 수 있다. 상기 기판은 표면 처리되는 데, 표면처리는 프로브 분자의 부착 및 고정화를 용이하게 하기 위해 수행된다. 또한 표면처리는 DNA칩의 기질 표면에 생물분자를 고정화시키기 위한 관능기를 포함할 수 있도록 수행될 수 있다. 예컨대 상기 기판은 알데히드기, 카르복실기 또는 아민기로 개질될 수 있다. 유리 기판이나 반도체 기판의 경우 실란 처리를 하여 아미노기(-NH3, -NH2 등)를 형성할 수 있다. 또한 실란 처리를 효과적으로 하기 위해 실란 처리 전에 하이드록실(hydroxyl, -OH)기를 만들기 위한 처리를 할 수도 있다. 본 발명의 목적상 프로브 분자를 기판에 고정시키는 방법은 제한 없이 사용될 수 있으며, 화학 또는 물리적 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 유리기판의 표면에 O2 플라즈마 처리를 하여, 유리기판의 표면에 -OH기가 노출되도록 하고 표면에 아민기로 관능화한 후, 아민으로 처리되었던 표면을 카르복실기로 치환시킨 다음, 아민기(-NH2)를 갖고 있는 프로브인 DNA와 공유결합인 펩타이드 결합을 통해 상기 기판 위에 고정화시켰다. 상기 DNA와 결합하지 않은 기판은 배경 염색이 되지 않도록 아민기를 갖고 있는 PEG(polyethylene glycol)와 반응시켜 블로킹시켰다.
본 발명에서 용어 "DNA 프로브"란, 시료 내의 검출하고자 하는 목적핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 목적핵산의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미하는 것이다.
본 발명에서 용어 "목적핵산"이란, 시료 내에 존재하고 있는지 여부를 검출하고자 하는 물질로서, 목적핵산의 종류는 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 DNA이다. 보다 구체적으로, 상기 목적핵산은 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"란 검출하고자 하는 목적핵산이 들어 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 '스팟(spot)'이란 프로브가 기판 상에 미세 집적된 부분을 의미하는 것으로, 즉, DNA칩 등과 같은 기판 상에 DNA 프로브가 고정된 부분을 의미하는 것이다.
목적핵산을 포함하는 시료를 DNA 프로브가 고정된 기판과 접촉시키면 시료 내의 목적핵산과 프로브 분자의 특이적인 결합반응, 즉, 목적핵산과 DNA 프로브 사이의 상보적인 서열끼리의 특이적인 혼성화 반응이 일어난다.
본 발명의 일 실시예에서는 기판 위에 목적핵산을 감지할 수 있는 프로브를 고정화시키고, 프로브가 반응하지 않은 부분은 비특이적인 반응을 줄이기 위해 블로킹 분자를 사용하여 블로킹하였다. 여기에 측정하고자 하는 목적핵산을 반응시키게 되면 이에 상보적인 서열을 갖는 프로브와 목적핵산이 혼성화되어 이중나선 형태를 이루게 된다. 목적핵산을 반응시킨 후, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키면, 혼성화된 이중나선 핵산에만 인터컬레이터가 결합하고, 혼성화가 되지 않은 부분에는 인터컬레이터가 결합하지 않기 때문에 나노입자들이 붙지 않게 된다.
본 발명에서 용어 "인터컬레이터(intercalator)"란 이중나선 핵산에 인터컬레이팅할 수 있는 모든 물질을 지칭하는 것으로, 예컨대, 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 하이드로크로라이드(daunorubicin hydrochloride), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 아크리딘오렌지(Acridin Orange) 등 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 금속 나노입자 용액을 제조한 다음, 인터컬레이터를 첨가하여 반응 시킴으로써, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 제조하였다. 여기서, 금속 나노입자 용액에 첨가되는 인터컬레이터의 비율은 0.1mM 내지 1mM이며, 반응시간은 약 3시간 내지 10시간 정도일 수 있다. 이때, 상기 컨쥬게이트된 금속 나노입자는 투석과 같은 종래의 정제 방법을 통해, 인터컬레이터와 결합되지 아니한 금속 나노입자를 제외하고, 다우노루비신이 컨쥬게이트된 금속 나노입자만을 수득할 수 있다.
상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)일 수 있으며, 금속 이온과 환원제를 혼합하여 제조할 수 있고, Sigma와 같은 시약회사에서도 상업적으로 용이하게 입수 가능하다.
본 발명에서 상기 (c) 단계의 금속 인핸싱 용액을 반응시키는 단계는 혼성화된 이중나선 핵산에 결합한 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 목적핵산의 검출을 육안으로 측정하기 위한 단계이다.
본 발명에서 용어 "금속 인핸싱 용액"이란, 금속 이온으로 이루어진 용액으로 금속 나노입자를 촉매로 하여 상기 금속 나노입자 주변에 금속 이온들이 환원이 되면서 나노입자의 크기를 증폭시킬 수 있는 용액을 의미하며, 나노입자의 크기를 증폭시킬 수 있는 금속 인핸싱 용액으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 금 (Au), 은 (Ag), 구리 (Cu), 백금 (Pt) 또는 팔라듐 (Pd) 이온을 포함하는 용액일 수 있으며, 가장 바람직하게는 금 이온을 포함하는 용액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 목적핵산은 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화를 육안으로 확인함으로써 검출할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 반사법 또는 투과법과 같은 광학적 원리를 이용하여 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하여 검출할 수 있다. 이 때, 최종 검출신호는 흑과 백의 그레이 스케일의 크기에 따라 표현할 수 있다.
예컨대, LED 또는 Laser Diode와 같이 단파장광원을 사용하고 광검출장치로는 CMOS, 혹은 CCD와 같은 Photodiode array를 사용하여 그레이 스케일 광 세기를 측정할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 일반적인 광학 스캐너로 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금 나노입자를 반응시키고, 금 인핸싱 용액을 1분 동안 반응시켰다. 그 결과 금 이온이 환원이 되면서 금 나노입자 주변에 금속이 코팅되면서 상기 입자의 크기가 커져서 목적핵산이 붙은 영역이 회색 빛깔을 띄어 육안으로 관찰할 수 있었다. 구체적으로, 프로브에 특이적으로 반응한 부분이 진한 회색을 띄고 있으며, 비특이적인 부분은 매우 연한 회색을 띄거나 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 경우 간단히 목적핵산 또는 프로브 분자에 형광 물질 등을 표지시키거나 별도의 광학 장치나 형광 스캐너 없이 육안으로 DNA칩을 이용하여 목적핵산을 검출할 수 있다 (도 1).
본 발명은 다른 관점에서, (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 (d) 단계의 금속 인핸싱 용액에 반응한 부분의 반응의 세기를 측정하는 단계는 시료 내에 존재하는 목적핵산을 정량 분석하기 위한 단계로, 시료 내에 존재하는 목적핵산의 농도가 증가할수록 금속 인핸싱 용액에 반응한 부분의 반응의 세기 또한 증가하므로 목적핵산을 정량할 수 있다.
상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사법 또는 투과법과 같은 광학적 원리를 이용하여 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하여 이루어 질 수 있으며, 최종 검출신호는 흑과 백의 그레이 스케일의 크기에 따라 표현할 수 있다.
예컨대, LED 또는 Laser Diode와 같이 단파장광원을 사용하고 광검출장치로는 CMOS, 혹은 CCD와 같은 Photodiode array를 사용하여 그레이 스케일 광 세기를 측정할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 일반적인 광학 스캐너로 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 목적핵산이 1pM 에서 100nM 까지로 농도가 증가할수록 회색 스팟이 진해지고 커지는 것을 확인하였고, 일반 스캐너로 찍어서 아도브(Adobe)사의 포토샵 소프트웨어를 이용하여 gray scale로 분석하여 얻은 결과는 목적핵산의 농도가 증가할수록 gray scale 값도 증가하는 반면, 목적핵산이 붙지 않은 주변 기판에서는 농도에 상관없이 일정한 값을 나타내는 것을 확인하여, 일반적인 스캐너와 보통의 소프트웨어를 이용하여 목적핵산의 정량 분석이 가능함을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자의 제조방법
인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 제조하기 위하여, 용기에 18.5ml의 증류수를 넣고 500RPM으로 shaking하면서, 10mM HAuCl4 500μL, 10mM Sodium Citrate 500μL, 100mM NaBH4 500μL를 첨가하고 3시간 동안 반응시킨 후, 10 % Sodium Dodecyl Sulfate(SDS) 400μL 첨가 후, 마지막으로 10mM 다우노루비신(Sigma Aldrich) 400μL를 첨가하여 최종 농도가 0.2mM이 되도록 6시간 이상 반응시킨 다음, 최종적으로 Sodium Citrate(2.5mM), 0.2% SDS 용액에 Dialysis(투석) 하여, 금 나노입자에 붙지 않은 다우노루비신을 제거한 후, 최종적으로 정제된 다우노루비신이 컨쥬게이트된 금 나노입자를 얻었다.
실시예 2. 유리기판의 처리
유리기판을 피라나 용액(piranha solution)을 이용하여 세정시키고, O2 플라즈마 처리를 하여 유리기판의 표면에 -OH기가 노출되도록 하였다. 상기 유리기판을 에탄올 용액에 준비한 2% APTES(aminopropyltriethoxysilane)로 두 시간 동안 반응시켰다. 2시간 반응 후, 에탄올로 표면을 깨끗이 씻고 건조를 시킨 다음, 120℃ 핫플레이트에서 1시간 동안 baking을 시켜서, 유리 기판의 표면을 아민(amine)으로 관능화(functionalize)시켰다. 상기 기판을 DMF(dimethylformamide)에 넣은 1 M 숙신산 무수물(succinic anhydride)로 하루 밤 동안 반응을 시킨 후, 세정을 하여 아민으로 처리되었던 유리기판을 카르복실기(-COOH)로 치환을 시켰다.
실시예 3. DNA칩의 제작
DNA칩을 제작하기 위하여, 먼저 EDC/NHS를 15분간 반응시킨 후, NH2-O-AATGGTTTATTCTGCTCA(이하, "H5"라고 명명함)로 이루어진 10 μM의 DNA와 NH2-O-GACATCAAGCAGCCATC(이하, "HM"이라고 명명함)로 이루어진 50 μM의 대조구 DNA를 1시간 동안 반응시켜서, 상기 실시예 1에서 준비한 유리기판에 프로브 역할을 하는 DNA를 고정시켰다. DNA가 고정되지 않은 부분을 블로킹시키기 위해서, 말단에 아민으로 되어 있는 1M Ethanol Amine을 1시간 동안 반응시켜서, 프로브가 부착된 DNA칩을 제작하였다.
실시예 4. 목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응
상기 실시예 2에서 제작한 프로브가 부착된 DNA칩과 목적핵산 DNA의 특이적 혼성화 반응을 확인하기 위해, 프로브인 H5 DNA에 상보적인 서열번호 1인 TGA GCA GAA TAA ACC ATT의 서열을 갖는 목적핵산 DNA(Bioneer, Korea) 및 대조구인 서열번호 2인 GAT GGC TGC TTG ATG TC를 Hybridization Buffer (5XSSC,0.2%SDS)에 희석하여 농도별로 각각 혼성화 반응을 시켰다.
실시예 5. 목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응의 증폭 및 측정
목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응의 증폭 및 측정을 위해, 상기 실시예 4에서 혼성화 반응을 시킨 DNA칩을 SSC 완충용액으로 씻어서, 반응하지 않은 DNA를 제거하였다. 그 후, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금나노입자를 10분 동안 반응시킨 후, SSC 완충용액으로 씻은 다음 금 인핸싱 용액 (0.85mL HAuCl4(10mM), 0.25mL AgNO3 (10mM), 0.27mL Ascorbic acid(100mM), 20mL CTAB(100mM))으로 1분 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 혼성화 반응이 진행된 DNA칩을 물로 씻어서, 특이적 혼성화 반응을 관찰하였다.
먼저 유리기판에 형성된 스팟을 일반스캐너로 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 목적핵산 DNA와 특이적 혼성화 반응이 일어난 부분에만 회색 빛깔의 스팟(spot)이 생긴 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 도 3에서는 목적핵산 DNA가 프로브인 H5에 특이적으로 붙어 회색 빛깔을 내는 스팟을 형성하였고, 대조구 DNA가 대조구인 HN에만 특이적으로 붙어 회색 빛깔을 내는 스팟을 형성하였다. 상보적이지 않은 프로브 DNA와 목적핵산 DNA에서는 스팟이 보이지 않거나 희미하게 보이는 것을 확인하였고, 목적핵산 DNA의 농도에 따라 회색 빛깔의 세기가 크게 나오는 것을 확인함으로써, 본 발명의 혼성화 반응이 특이적으로 이뤄지며, 혼성화 반응이 일어난 프로브 DNA와 목적핵산 DNA의 결합에 인터컬레이터가 결합하고, 환원 반응을 일으키는 금 인핸싱 용액을 처리하였을 경우, 별도의 광학 기기 없이 육안으로 스팟을 확인할 수 있을 정도로 금 나노입자를 촉매로 하여서 금속 이온들이 환원이 되면서 입자의 크기를 키우게 되는 것을 확인하였다.
또한, 목적핵산 DNA의 농도별로 얻은 스팟을 아도브사(Adobe)사의 포토샵 소프트웨어를 이용하여 gray scale로 정량 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 농도별로 1 pM에서 100 nM까지 gray scale 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 목적핵산이 붙지 않은 주변 기판에서는 농도에 상관없이 배경 염색이 되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 다른 어떠한 장비 없이도 육안으로 핵산 검출이 가능하고 장치의 소형화가 가능하여 현장 진단이 가능하다.

Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법:
    (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및
    (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적핵산의 검출은 육안으로 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 (daunorubicin), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 및 아크리딘오렌지(Acridin Orange)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 금속 인핸싱 용액은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 금속 인핸싱 용액은 금속 이온을 환원시켜서 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자의 크기를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법:
    (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계;
    (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계;
    (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인핸싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및
    (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기판은 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 (daunorubicin), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 및 아크리딘오렌지(Acridin Orange)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 금속 인핸싱 용액은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 금속 인핸싱 용액은 금속 이온을 환원시켜서 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자의 크기를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
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