KR100498292B1

KR100498292B1 - 경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산 칩을 이용하는 핵산혼성화 검출기 및 핵산 혼성화 검출방법

Info

Publication number: KR100498292B1
Application number: KR10-2003-0007503A
Authority: KR
Inventors: 이상은; 이정건; 윤규식; 임귀삼; 김동천
Original assignee: 엘지전자 주식회사
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2005-07-01
Also published as: KR20040071504A

Abstract

본 발명은 전기화학발광(Electrochemiluminescence)을 이용한 핵산 혼성화 검출 방법에 있어서, 핵산을 직접 전극 위에 고정시키지 않고, 전극과 적정한 간격을 두고 떨어져 있는 별도의 기판 위에 고정화시키고 근접하여 전류를 흘려줌으로써 안정적인 전기화학발광이 유도되고 표면에 부착된 핵산의 전기적 손상이 최소화되며, 기판을 비스듬히 이방성 식각하여 얻은 구멍의 비스듬한 관통면에 핵산이 고정화되고, 여기서 발생하는 빛을 광측정 장치쪽으로 모아줌으로써 인접한 핵산칩의 구멍에서 나오는 빛과 서로 간섭하는 것이 방지되며, 광측성 장치의 작업영역 (working area)에 빛을 모아줌으로써 광측정의 편의성과 빛의 손실을 막을 수 있는 핵산 혼성화 검출기 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 검출방법에 관한 것이다.

Description

경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산 칩을 이용하는 핵산 혼성화 검출기 및 핵산 혼성화 검출방법{DEVICE AND METHOD FOR DETECTING A NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION USING NUCLEIC ACID CHIPS HAVING SLOPING HOLES}

본 발명은 핵산을 고정시킨 칩에 근접하여 전류를 흐르게 함으로써, 칩에 고정된 핵산의 손상을 막고, 집중화된 전기화학발광(electrochemiluminescence)을 검출하는 원리를 이용한 휴대용 핵산검출장치와 그 장치의 제작법에 관한 것이다.

핵산칩 기술은 다음과 같이 분류된다. 우선, 제작 방식에 따라, 핀 마이크로어레이(pin microarray), 잉크젯(Inkjet) 원리를 이용하는 마이크로 드로핑(micro dropping), 광식각 기술(photolithography)을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 직접합성, 및 전기를 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 어드레싱(addressing)하는 일렉트로닉 어레이(electronic array) 방식 등이 있다.

또한, 유전자 집적도에 따라, 고밀도, 중밀도 및 저밀도 칩으로 나눌 수 있다. 고밀도 칩에는 약 10,000 개 이상의 유전자가 집적되어 있으며, 중밀도 칩에는 200 개 내지 10,000 개의 유전자가 집적되어 있고, 저밀도 칩에는 200 개 미만의 유전자가 집적되어 있다.

또한, 칩 상에 고정되는 유전물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고뉴클레오타이드 칩으로 나눌 수 있다. 이들 핵산칩의 이름에서도 알 수 있듯이, cDNA 칩에는 최소한 500bp (base pair)이상의 유전자가 고정되어 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 고정되어 있다.

핵산 칩 시장은 특정 타입의 세포와 질병 상황에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 데이터가 축적됨에 따라, 점차 질병을 중심으로 어떠한 유전자가 관련되었으며 어떻게 상호 작용하는가를 파악하는 시장으로 형성되고 있다. 고밀도 칩을 이용한 다양한 실험을 통하여 특정 질병에서 비교적 높은 상관관계를 보인 유전자들을 선별하여 만든 중밀도 칩을 이용하여 많은 질병 샘플을 분석하여 고밀도 칩에서 선별된 질병관련 유전자를 검증하고 타당성을 입증하는 것이 연구의 주요한 흐름이 되고 있다.

이러한 검증을 바탕으로 하여, 질병의 진단 또는 나아가 질병 예측을 위한 저밀도 칩이 필요하게 되었다. 즉, 질병과 완벽한 상관 관계를 보이는 특이적인 몇 개의 유전자들로만 구성된 저밀도 칩의 필요성이 증대되고 있다.

본 발명은 올리고뉴클레오타이드 또는 cDNA를 이용한 저밀도 칩과 그것을 측정하는 측정기에 관한 것으로, 전기화학발광반응을 이용하고 휴대가 용이한 핵산 혼성화 검출기에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 핵산을 직접 전극 위에 올리지 않고 핵산을 별도의 기판 위에 자기조립(self-assembly)법에 의하여 고정시킨 후, 여기에 근접하여 전류를 흘려줌으로써, 안정적인 전기화학발광을 유도하고, 기판 표면에 부착된 핵산의 전기적 손상을 최소화시킬 수 있는 핵산 혼성화 검출기 및 이를 이용한 핵산 혼성화 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산 칩을 이용하여 구멍의 경사면에 핵산을 고정화시키고 여기에서 발생한 빛을 광측정 장치 쪽으로 모아줌으로써, 다른 기판의 전기화학발광에 간섭받지 않고 빛을 집중화시킬 수 있는 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 핵산 혼성화 검출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 광섬유 등을 이용하여 한 개의 광측정 장치만을 이용하여 여러 개의 핵산 스팟(SPOT)을 검출할 수 있고, 휴대가 용이하도록 소형화된 핵산 검출 장치 및 이의 제작 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 전기화학발광법을 이용하여 핵산의 혼성화 여부를 검출하는 기술에 관한 것으로, 핵산의 전기적 손상을 최소화하기 위하여 전극과 분리된 별도의 기판에 핵산을 고정시키고, 여기에 근접하여 전류를 가함으로써, 안정적인 전기화학발광의 유도가 가능하고, 핵산 칩 구멍에 경사각을 주고 그 경사면에 핵산을 고정화시켜서 여기서 발생된 빛을 모아줌으로써 다른 기판의 전기화학발광의 간섭 없이 빛을 집중시킬 수 있으며, 광섬유 등을 이용하는 광측정 장치를 사용함으로써, 하나의 광측정 장치로 여러 개의 핵산 스팟(SPOT)을 검출 할 수 있고, 소형으로 제작 가능하여 휴대가 용이한, 전기화학발광을 이용한 핵산 혼성화 검출기 및 이를 이용한 핵산 혼성화 검출방법에 관한 것이다.

우선, 본 발명의 핵산 혼성화 검출기는 다음을 포함하여 구성된다:

- 경사각을 주어 이방성 식각(anisotropic etching)하여 양면에 서로 다른 크기의 기판을 관통하는 구멍을 갖는 기판(2), 상기 기판 내의 양면에 형성된 구멍을 잇는 관통 경사면에 고정된 탐침핵산(1), 상기 탐침 핵산과 혼성화된 타겟 핵산(3) 및 상기 탐침 핵산과 타겟 핵산이 혼성화된 이중나선 핵산(4)에 결합된 인터컬레이터(5)를 포함하는 핵산 칩;

- 투명창(20)

- 상기 핵산 칩과 일정한 최적 간격을 유지하며 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성되어 있는 쪽에 위치하는 작업전극(working electrode, 9), 작업전극과 적절한 간격을 유지하며 위치하는 기준전극(reference electrode, 6) 및 대전극(counter electrode, 7)을 포함하는 전기화학 장치;

- 상기 핵산 칩, 투명창, 전기화학 장치 및 전이금속착물(8)의 수용액을 포함하는 암상자(10);

- 인터컬레이터(intercalator), 전이금속착물을 포함하는 수용액에 인가전압을 가할 수 있는 전원공급장치(11); 및

- 핵산 칩의 좁은 구멍이 형성된 쪽에 위치하는 광섬유를 이용한 광입력 부분(24)과 이를 제어할 수 있는 제어기(25)에 연결된 광측정 장치(16).

본 발명에 따른 핵산 혼성화 검출기에 있어서, 기판에 직접 전류가 흐르지 아니하므로, 기판으로서 사용되는 물질에는 제한이 없으며, 일반적으로 금판 또는 슬라이드 글라스 등을 사용할 수 있다. 상기 기판을 경사각을 주어 비스듬히 이방성 식각(anisotropic etching)하여 양면에 서로 다른 크기를 갖고 기판을 관통하는 구멍을 형성시키고, 기판 내부의 관통되는 부분에 형성된 경사면에 탐침 핵산을 고정시켜서 사용한다. 예컨대. 유리, 실리콘, PCB(printed circuit board), 플라스틱류와 같은 기판 재료를 경사각을 주어 이방성 식각하여 기판의 양면에 서로 다른 크기를 갖는 관통 구멍을 형성시킨 후, 기판 내부를 관통하여 양 구멍을 잇는 경사면(15)에 금 박막을 코팅하여, 여기에 탐침 핵산을 고정시킬 수 있다.

탐침 핵산은 타겟 핵산과 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산이며, 탐침 핵산의 5' 포스페이트 말단을 티올(thiol)기로 유도시켜서 자기-조립법(self-assembly)에 의하여 기판에 부착시킬 수 있다. 본 발명에서 검출하고자 하는 핵산(nucleic acid)은 올리고뉴클레오타이드(oligo-nucleotide), DNA, RNA, PNA, cDNA 등을 총칭한다.

상기 투명창은 PDMS(polydimethylsiloxane), 유리 또는 투명한 플라스틱으로 되어 있으며, 전기화학발광에서 발생하는 빛을 투과시키는 역할을 한다.

본 발명에 있어서, 작업전극과 핵산을 올린 기판과의 간격은 상기 작업전극의 작업 영역(working area), 전압 및 전류를 고려하여, 핵산을 올린 기판과 적절한 간격을 유지하도록 위치시킨다. 이 때, 기판과 작업전극의 간격이 너무 멀어지면, 인터컬레이터와 전이금속착물 간의 적절한 전기화학발광이 유도되지 못하며, 너무 가까워지면, 전이금속착물 수용액이 핵산 칩 주변을 적절하게 흐르지 못하므로 전기화학발광에 장애를 일으키게 된다. 따라서, 시행착오의 방법으로 작업전극과 핵산을 올린 기판 간의 적절한 간격을 찾는다. 예컨대, 작업전극과 핵산을 올린 기판과의 간격은 0.30 내지 1.50 mm가 적당하며, 0.60 내지 1.10 mm인 것이 보다 더 바람직하다.

상기 인터컬레이터로서 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 독소루비신(doxorubicin) 등을 사용할 수 있으며, 이러한 인터컬레이터는 혼성화된 이중나선 핵산에만 선택적으로 결합(인터컬레이션)하므로 이를 이용하여 핵산의 핵산의 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 인터컬레이터의 종류에 따라 인터컬레이션되는 타입도 달라지는데, 예컨대, DAPI의 경우에는 도 4와 같이 핵산의 마이너 그루브(minor groove)에 선택적으로 결합하게 되므로 타켓 핵산이 혼성화되지 않은 기판과 타켓 핵산이 혼성화되어 있는 기판을 구별할 수 있게 된다. 또한, 상기 전이금속착물로서 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)[tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium(II), Ru(bpy)₃ ²⁺], 트리스(1,10-페난스롤라인)루테늄(II)「tris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II), Ru(phe)₃ ²⁺] 등과 같은 루테늄 유도체 또는 트리스(2,2'-바이피리딜)오스뮴(II)[tris(2,2'-bipyridyl)osmium(II), Os(bpy)₃ ²⁺] 등을 사용할 수 있다. 인터컬레이터가 결합된 상태(혼성화된 이중나선 상태의핵산)의 핵산칩에 전이금속착물인 루테늄 용액(7)을 흘려주고, 적절한 인가전압을 걸어주면 용액 속의 2가 양이온 (예컨대, Ru(bpy)₃ ²⁺)이 산화되어 3가 양이온(예컨대, Ru(bpy)₃ ³⁺) 유도체가 되고, 이는 인터컬레이터와의 산화환원 반응을 통해 여기상태의 2가 양이온(예컨대, Ru(bpy)₃ ^2+*) 유도체가 되는데, 이 유도체가 기저상태인 2가 양이온(예컨대, Ru(bpy)₃ ²⁺)로 되돌아올 때 약 620 nm의 빛을 발생하게 된다. 이 때 발생하는 빛을 광검출 장치로 검출한다.

본 발명에 사용되는 핵산 칩으로서 도 7과 같은 스트립 형태(strip type)의 핵산 칩을 제작하여 사용할 수 있다. 이 때, 핵산을 올릴 수 있는 SPOT의 개수는 사용자의 편의와 작업전극 숫자에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 스트립 형태의 핵산 칩은 실리콘, 유리, 플라스틱류, PCB 등을 사용하여, 그 위에 금을 적절한 모양으로 코팅함으로써 제작할 수 있으며, 사용자 편의 따라 손잡이 부분을 제작하여 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 핵산 칩의 기판을 경사각을 주어 이방성 식각(anisotropic etching)하여 기판을 관통하는 구멍을 만들어 사용하는데 특징이 있다. 이 때, 식각을 통하여 경사각을 만들 수 있는 모든 원형, 삼각형, 사각형 또는 기타 다각형 모양의 구멍이 가능하며, 이러한 경사각의 이방성 식각을 통하여, 핵산 칩의 양쪽 면에 크기가 다른 구멍이 생기게 된다(도 8a 내지 8d 참조).

도 8d와 같이, 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성된 쪽에 작업 전극을 위치시키고, 좁은 구멍이 형성된 쪽에 광측정 장치에 연결된 광입력 부분을 위치시킨다. 작업 전극과 광입력 부분을 이와 같이 위치시킴으로써, 전기화학발광에 의하여 핵산 칩과 전극 사이에서 발생하는 빛이 인접한 핵산 칩의 구멍에서 나오는 빛과 서로 간섭하는 것을 막아주며, 광측정 장치의 작업 영역에 빛을 모아줌으로써 광측정의 편의성과 빛의 손실을 막을 수 있다.

상기 광측정 장치에 연결된 광입력 부분으로서 광섬유(optical fiber)를 사용하며, 각각의 핵산 칩의 구멍 위에 정확하게 위치시킨다. 이 때, 각각의 광섬유는 빛의 투과를 제어하는 제어기(25)를 통하여 제어된다. 제어기는 광섬유를 통한 빛의 투과를 온-오프 제어(on-off control)를 통하여 제어하며, 여러 개의 광섬유를 통하여 들어온 빛은 하나의 광측정 장치에서 측정할 수 있게 된다. 즉, 여러 개의 광섬유를 한 번에 제어함으로써, 하나의 광측정 장치(26)를 사용하여 여러 개의 핵산 칩 구멍의 발광을 측정할 수 있다. 예컨대, 여러 개의 전극에 동시에 인가전압을 가하여 전기화학발광을 일으키게 되면, 측정시간대 별로 여러 개의 전극에서 발생하는 빛을 거의 동시에 측정함으로써, 측정시간대별 발광량 변화를 알수 있으며, 이를 통하여, 여러 개의 핵산 SPOT의 분석이 가능하게 된다.

본 발명에 따른 핵산 혼성화 검출기는 휴대용으로 제작 가능하며, 이러한 휴대용 핵산 혼성화 검출기는 LCD 등을 이용한 디스플레이 판넬(30), 제어버튼이 있는 제어판(29), 컴퓨터 등과의 인터페이스를 위한 접속판(31)을 추가적으로 포함하여 구성되어 있다. 본 발명에 따른 휴대용 핵산 혼성화 검출기는 스트립 형태의 핵산 칩(19)을 투입구(32)에 삽입함으로써 전기화학발광 반응을 측정한다(도 11 내지 13 참조).

본 발명에 따른 슬라이드글라스 형태의 핵산 칩은 작업전극을 얼마나 만들어 줄 수 있느냐에 따라 측정 가능한 핵산 샘플의 수가 결정되므로, 얼마든지 확장하거나 그 숫자를 늘릴 수 있다.

또한, 본 발명은, 핵산을 직접 전극 위에 올리지 아니하고, 별도의 기판(예컨대, 슬라이드 글라스)에 핵산을 올린 후, 근접하여 전류를 흘려주는 방식으로 인터컬레이터와 전이금속착물의 전기화학발광을 유도하여, 핵산을 안정적이고 경제적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하며, 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어진다:

- 기판을 경사각을 주어 이방성 식각하여 기판의 양면에 서로 다른 크기를 갖고 기판을 관통하는 구멍을 형성시키고, 기판을 관통하여 양쪽의 구멍을 잇는 경사면 위에 탐침 핵산을 고정시키고, 여기에 타겟 핵산을 공급하여 혼성화시킨 후, 이중나선 핵산에만 선택적으로 결합하는 인터컬레이터를 공급하여 상기 혼성화된 이중나선에 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 칩 제작 단계:

- 전이금속착물 수용액이 들어있는 암상자에 상기 인터커레이터가 결합된 이중나선 핵산을 포함하는 핵산 칩을 넣고, 작업 전극이 상기 핵산 칩과 일정한 간격을 두고 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성된 쪽에 위치하도록 하여 삼전극계의 전기화학 장치를 위치시키고, 상기 전기화학장치를 암상자 외부의 전원공급장치(포탠시오스탯)에 연결시키는 단계; 및

- 전원공급장치를 이용하여 적정한 인가전압을 가하여, 암상자 내의 인터컬레이터에 의한 전이금속착물의 전기화학발광을 유도하고, 핵산 칩의 좁은 구멍이 형성된 쪽에 위치하는 광입력 부분에 연결된 광측정 장치를 이용하여 발광량을 측정하는 단계.

상기와 같은 핵산 검출방법을 도면을 이용하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

우선, 도 1은 기판(2)위에 탐침 핵산(1)를 올리는 방법을 나타낸 것으로, 먼저 기판(2)을 증류수에 5 분간 세척한 후, 메탄올로 5 분간 세척하고, 다시 증류수에 5분간 세척하여 기판(2)위에 불순물을 완전히 제거한다. 기판(2)위에 탐침 핵산을 올리는 경우, 티올(Thiol)기가 있는 탐침 핵산(1)를 올려서 자기조립법(self assembly)에 의한 모노레이어(monolayer)를 형성시킨다. 일반적으로, 자기조립법에 의한 방법은 티올기가 있는 핵산을 기판(2)위에 올린 후 하룻밤 동안(overnight) 건조하지 않은 습윤 챔버 내에 유지시키면 수행된다.

도 2는 상기와 같이 제작된 탐침 핵산(1)을 올린 기판(2)에 타켓 핵산(3)를 투여하여 혼성화시키는 것을 보여주는 것이다. 이 때, 일정 온도가 유지되는 습윤 챔버에서 3 ~ 6시간 정도 혼성화시킨다.

도 3은 증류수로 혼성화가 끝난 기판(2)을 5번 정도 세척하여 혼성화 되지 않은 타켓 핵산을 완전히 제거한 모습을 보여준다.

도 4는 인터컬레이터로서 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(5)를 사용하여 혼성화된 이중나선 핵산에만 선택적으로 인터컬레이션시키는 것을 보여주는 것으로, 도 4에 서 알 수 있는 바와 같이, DAPI(5)는 핵산의 마이너 그루브에 선택적으로 결합하여, 타켓 핵산(3)이 혼성화되지 않은 기판(2)과 타켓 핵산(3)이 혼성화되어 있는 기판(2)을 구별할 수 있게 된다.

도 5는 인터컬레이션된 핵산이 올려져 있는 기판(2)에 전기화학장치를 이용하여 전류를 가할 수 있는 시스템을 보여주는 것이다. 핵산 칩과 적당한 간격을 두고 넓은 구멍이 형성된 쪽에 작업전극(working electrode)(9)이 위치하고, 기준전극(Reference electrode)(6)와 대전극(counter electrode)(7)이 트리스(2,2'-바이피리틸)루세니움이가이온이 있는 수용액(8) 속에 도 5와 같이 위치하여 담겨 있게 된다. 이 때, 1.19V의 인가전압을 가하면 기판(2)과 작업전극(working electrode)(9)사이에는 전류가 흐르게 되고 전기화학발광이 유도되어 약 610 nm의 빛이 발생하게 된다. 이 때, 작업 전극(9)과 기판(2)과의 사이 간격은 항상 일정하게 유지하여 측정하여야 한다. 작업 전극(8)과 금판(2)사이의 간격에 따라서 전기화학발광의 발광 정도에 있어서 많은 차이가 발생하므로 이를 일정하게 유지하는 것이 매우 중요하다.

도 6은 상기 도 5의 시스템이 암상자(dark box)(10)에 담겨져 있는 상태에서 포탠시오스탯(potentiostat)(11)을 이용하여 인가전압을 가하는 모식도이다.

도 7은 스트립 형태의 핵산 칩을 보여주는 것으로, (A)는 핵산 칩을 비스듬하게 관통하여 경사진 사각형의 구멍(12)이 형성된 것이며, (B)는 (A)의 스트립 형태의 핵산칩을 옆에서 본 모습이다.

도 8a는 실리콘 기판을 경사각을 주어 이방성 식각(anisotropic etching)하여 사각형의 구멍을 만드는 것을 보여주는 것으로, 이러한 방법을 실리콘 벌크 마이크로매칭(silicon bulk micromachining)이라 한다. 이방성 에칭제는 실리콘의 결정면을 다른 속도로 에칭한다. 가장 많이 사용되는 에칭제로는 수산화칼륨(KOH)이 있으며, 이는 사용하기에 안전하다는 장점이 있다. 산화물과 질화물 모두 수산화칼륨에 의해 느린 속도로 식각된다. 따라서 수화산칼륨 에칭제 욕조에 짧은 시간 담그는 경우라면 산화물을 에칭 마스크로 사용할 수 도 있다. 질화물은 수산화칼륨에서 산화물보다 더욱 느리게 식각되므로, 에칭 시간이 보다 긴 경우라면 에칭 마스크로서 질화물을 사용하는 것이 더욱 적절할 것이다.

도 8b는 수산화칼륨을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 일반적인 결정방향인(100) 방향으로 식각한 것을 나타낸 것이다. 도면에 예시된 식각되는 경사각은 54.7°이다.

도 8c는 식각된 웨이퍼에 도 1 내지 도 4까지 방법으로 처리된 핵산 칩에서의 핵산 혼성화 여부를 검출하는 부분을 나타낸 것이다. 광측정 장치와 연결된 광입력 부분은 핵산 칩의 좁은 구멍이 형성된 쪽 위에 고정되며, 기판 상의 혼성화된 핵산과 결합한 인터컬레이터와 전이금속착물과의 반응 결과 발생하는 발광량을 측정한다. 작업 전극은 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성된 쪽에 위치시킨다. 이와 같이 구성함으로써, 핵산 칩과 전극과의 사이에서 나오는 발광량이 근접한 핵산 칩의 구멍에서 나오는 빛과 서로 간섭하는 것을 막아주며, 광측성 장치의 작업영역(working area)에 빛을 모아줌으로써 광측정의 편의성을 도모하고 빛의 손실을 막아준다. 특히, 본 발명에서와 같은 수용액에서의 빛의 발광은 서로간의 상호 간섭을 막아주는 것이 매우 중요하다. 도 8d는 도 8c의 A 부분의 확대도로서, 핵산 칩이 전이금속착물 수용액(8)상에서 전기화학발광을 유도하는 과정과 이에 의하여 발생한 빛이 모아져서 광측정 장치를 통하여 즉정되는 것을 상세하게 묘사한 것이다.

도 9a는 스트립 형태의 핵산 칩의 결과를 읽기 위한 핵산 칩 케이스(case)이다. 핵산 칩의 구멍과 같은 위치와 배열로 작업전극(18)을 구성한다. 도 9b는 9a의 핵산 칩 케이스(case)의 측면도이다. 스트립 형태의 핵산 칩(19)이 들어가는 공간에는 전이금속착물이 있는 수용액(8)이 채워지며, 전기화학발광에 의하여 발생된 빛이 통과되어 나올 수 있는 투명재질의 투명창으로 한 쪽면을 구성한다. 스트립 형태의 핵산 칩을 작업전극과 같은 위치로 배열시킨다. 작업전극은 전원을 제어하여주는 포탠시오스탯(potentiostat)을 연결하여 제어한다. 이 때, 인가되는 전압은 약 1.0 ~ 1.20 V 사이로, 인터컬레이터의 종류의 따라 최적값을 가지는 전압값을 결정하여 인가전압을 가하여준다. 예를 들면, DAPI는 1.19 V의 인가전압으로 제어하여 준다. 이러한 포탠시오스탯은 컴퓨터프로그램을 통하여 제어한다. 각 전극의 인가전압을 동시에 또는 각각 제어할 수 있도록 한다.

도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 광입력 부분을 이루는 광섬유(optical fiber)는 각각의 핵산 칩의 구멍(좁은 구멍)의 위치에 정확하게 위에 놓여진다. 이 때, 각각의 광섬유는 광섬유의 빛의 투과를 제어하는 제어기(25)를 통하여 제어된다. 제어기는 광섬유의 빛의 투과를 온-오프 제어(on-off control)를 통하여 제어하며, 광섬유를 통하여 들어온 빛은 광측정 장치에서 측정된다. 이 때, 여러 개의 광섬유를 동시에 제어함으로써, 한 개의 광측정 장치(26)를 사용하여 여러 개의 핵산 칩 구멍을 동시에 측정할 수 있다. 예를 들면, 여러 개의 전극에 동시에 인가전압을 가하여 전기화학발광을 일으키게 되면, 측정시간대 별로 여러 개의 전극을 거의 동시에 측정함으로써 측정시간대별 발광량 변화를 알게 되며, 이를 통하여, 여러 개의 핵산 칩의 분석이 가능하게 된다.

도 11은 휴대용 핵산 혼성화 검출기의 예시도로서, 스트립 형태의 핵산 칩(19)를 투입구(32)에 삽입함으로써 측정할 수 있도록 구성된 휴대용 핵산 혼성화 검출기를 나타낸 것이다. 휴대용 핵산 혼성화 검출기는 LCD 등을 이용한 디스플레이 판넬(30), 제어버튼이 있는 제어판(29), 및 컴퓨터 등과의 인터페이스를 위한 접속판(31)으로 구성된다.

도 12는 여러 개의 핵산 칩을 동시에 삽입함로써, 한 번에 여러 개의 핵산 칩에서의 핵산 혼성화를 측정할 수 있는 휴대용 핵산 혼성화 검출기를 나타낸 것이다.

도 13은 여러 개의 핵산 칩을 동시에 측정할 수 있는 휴대용 핵산 혼성화 검출기에 스트립 형태의 핵산 칩을 삽입한 상태를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 탐침 핵산의 고정화

스트립 형태의 핵산 칩 구멍 내의 경사면에 금 박막을 형성시키고, 5' 말단에 티올기를 포함하고 다음과 같은 염기서열을 갖는 4 종류의 22mer의 올리고뉴클레오타이드를 탐침 핵산으로 하여 자기조립법(self-assembly monolayer)으로 단분자막을 형성시킴으로써 상기 금 표면 상의 각각의 스팟에 고정시켰다:

10 μ㏖/ℓ(μΜ) A1 (5'GTCCCTCTTGGAAGTCCATGGT, SEQ ID NO:1),

B1 (5'TACCACAGAGTCTAGACTCGTG, SEQ ID NO:3),

QC2 (5'CTGTGAGGAACTACTGTCTTCA, SEQ ID NO:4), 및

QC3 (5'ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC, SEQ ID NO:5)

A1은 간염 바이러스 A(Hepatitis Virus A. HAV)의 5' 비번역 부위(untranslated region, UTR)에서 유래한 염기서열을 가지며, B1은 간염 바이러스 B(HBV)의 표면 항원에서 유래하는 염기서열을 가진다. QC2와 QC3는 간염 바이러스 C(HCV)의 5 ' UTR에서 유래한 염기서열을 가지고 있다.

실시예 2 : 타겟 핵산의 혼성화(Hybridization)

상기 샘플을 1 μ㏖/ℓ(μΜ) RA1 (5'ACCATGGACTTCCAAGAGGGAC, SEQ ID NO:2) 및 RQC3 (5'GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT, SEQ ID NO:6)로 각각 혼성화시켰다. RA1은 A1과 상보적인 염기서열을 가지며, RQC3는 QC3과 상보적인 염기서열을 가지고 있다. 5X SSC 버퍼용액, 45 ℃에서 2시간 혼성화시킨 후, 5X SSC, 0.1% Tween-20으로 30분, 1X SSC, 0.1% Tween-20으로 30분 동안 세척하였다.

실시예 3 : 인터컬레이션

1 mM의 DAPI를 사용하여 1시간 동안 인터컬레이션을 수행한 후, 증류수로 30 분간 세척하였다.

실시예 4 : 혼성화 여부의 측정

5 mM의 트리스(2,2'-바이피리틸)루세니움이가이온 용액에서 전기화학발광을 유도하여{인가전압: 1.19V, RE: Ag/AgCl, CE: Pt, WE: Au (Working area: 1mm²)} 발생된 빛을 측정하였다.

도 14는 타겟 핵산으로서 1 μ㏖/ℓ(μΜ) RA1 (5'ACCATGGACTTCCAAGAGGGAC, SEQ ID NO:2)를 사용하여 나타난 결과를 보여주는 것으로, A1이 자기 조립에 의하여 고정화된 SPOT에서만 강도가 높게 나타났다. 이는 서로 다른 종류의 간염을 판별할 수 있음을 보여주는 것이다.

도 15는 타겟 핵산으로서 1 μ㏖/ℓ(μΜ) RQC3 (5'GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT, SEQ ID NO:6)를 각 스팟에 혼성화 시킨 경우에 나타난 결과를 보여주는 것으로, QC3 스팟부분에서만 강도가 강하게 나타났다. 이는 간염 바이러스 C 유형이 구별되었음을 보여준다.

도 16은 하나의 염기가 정상올리고머에서 변형된 타입을 구별해내는 실험을 수행한 결과를 보여주는 것이다. 이러한 실험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다:

(1) 다음과 같이, QC3 및 그의 하나의 염기가 치환된 올리고머(GQC3 및 AQC3)를 준비하였다:

GQC3 : 5'[ThiSS]ACTCGCAAGCA G CCTATCAGGC (SEQ ID NO:7)

AQC3 : 5'[ThiSS]ACTCGCAAGCA A CCTATCAGGC (SEQ ID NO:8)

QC3 : 5'[ThiSS]ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC (SEQ ID NO:5)

GC3, AQC3, QC3는 5' 말단에 티올기를 포함하는 22mer의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)이며, 이를 이용하여 자리조립법으로 금 표면에 고정화시켰다.

(2) 1 μ㏖/ℓ(μΜ) RQC3 (5'GCCTGATAGGGTGCTTGCGAGT)를 타겟 핵산으로 사용하여 혼성화시켰다. RQC3는 QC3와 상보적인 염기서열을 가지고 있다. 5X SSC 완충용액, 45 ℃에서 2 시간 정도 혼성화시킨 후, 5X SSC, 0.1% Tween-20으로 30분, 1X SSC, 0.1% Tween-20으로 30분 동안 세척하였다.

(3) 1 mM DAPI로 1시간 인터컬레이션하였으며, D.D.W.로 30 분간 세척하였다.

(4) 5 mM TBR 용액에서 전기화학발광에 의하여 발생한 빛을 측정하였다{인가전압: 1.19V, RE: Ag/AgCl, CE: Pt, WE: Au (Working area: 1mm²)}.

도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 단지 하나의 염기만 다른 GQC3 및 AQC3와 구별될 정도로 QC3에서 전기화학발광이 강하게 나타남을 알 수 있다. 이와 같이 전기화학발광 핵산 칩을 이용하여 하나의 점돌연변이(single point mutation)도 구별할 수 있었다.

본 발명에 따른 핵산 혼성화 검출기를 사용함으로써, 핵산의 전기적 손상 없이 안정적인 전기화학발광을 유도할 수 있고, 경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산 칩을 사용하여 구멍 내부의 기울어진 경사면에 핵산을 고정화시키고 여기서 발생하는 빛을 광측정 장치 쪽으로 모아주어서 근접한 핵산 칩의 구멍에서 나오는 빛과 서로 간섭하는 것을 막고, 광측성 장치의 작업영역 내에 빛을 모아주어서 광측정의 편의성과 빛의 손실을 막는다. 또한, 광입력 부분으로 광섬유 등을 이용하여 한 개의 광측정 장치만을 이용하여 여러 개의 핵산 스팟을 한 번에 검출할 수 있고, 여러 개의 핵산칩을 읽기 위한 X-Y stage등이 필요없기 때문에, 소형화가 가능하여 휴대용 핵산 검출장치를 제공할 수 있다.

도 1은 자기조립법에 의하여 기판에 탐침 핵산을 고정시킨 것을 보여주는 것이다.

도 2는 기판 상에 고정된 탐침 핵산에 타겟 핵산을 혼성화(hybridization)시키는 것을 보여주는 모식도이다.

도 3은 기판 상의 탐침 핵산과 혼성화되지 않은 타겟 핵산을 완전히 제거한 것을 보여준다.

도 4는 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 혼성화된 이중나선 핵산(duplex)에 인터컬레이션시키는 것을 보여준다.

도 5는 인터컬레이션된 핵산이 고정되어 있는 기판에 삼전극계의 전극을 이용하여 인가전압을 가할 수 있도록 구성된 시스템을 보여주는 것이다.

도 6은 상기 도 5의 시스템을 암상자에 넣고 전류를 가하는 것을 보여주는 모식도이다.

도 7은 스트립 형태의 핵산칩을 보여주는 것으로, (A)는 경사각의 금 박막이 형성된 구멍을 포함하는 스트립 형태의 핵산칩을 보여주는 것이며, (B)는 이것의 측면도이다.

도 8a 내지 8d는 경사각의 금 박막이 형성된 구멍의 상세한 모습 및 이를 이용한 측정 방법을 보여주는 모식도이다. 8a는 실리콘에 경사각의 금 박막이 형성된 모습이고, 8d는 실리콘에 경사각의 금 박막이 형성된 모습을 옆에서 본 모습이며, 8c는 실리콘에 경사각의 금 박막이 형성된 구멍이 있는 스트립 형태의 핵산칩을 이용하여 측정하는 모습이고, 8d는 8c의 (A) 부분을 확대한 것이다.

도 9의 (a)는 스트립 형태의 핵산칩을 읽기 위한 핵산칩 케이스(case)를 보여주는 것이며, (b)는 상기 핵산칩 케이스의 측면도이다.

도 10은 광섬유를 이용한 광측정 기기를 이용하여 스트립 형태의 핵산칩을 측정하는 모습을 보여주는 것이다.

도 11은 휴대용 전기화학발광 핵산칩 측정기의 예시도이다.

도 12는 여러 개의 핵산칩을 동시에 측정할 수 있는 휴대용 전기화학발광 핵산칩 측정기를 보여주는 것이다.

도 13은 여러 개의 핵산칩을 동시에 측정할 수 있는 휴대용 전기화학발광 핵산칩 측정기에 스트립형태의 핵산칩을 삽입한 상태를 보여주는 것이다.

도 14는 실시예 1에 따른 간염 바이러스 A형, B형 및 C형의 구별 테스트 결과를 나타낸 것이다(A형 검출).

도 15는 실시예 2에 따른 간염 바이러스 A형, B형 및 C형의 구별 테스트 결과를 나타낸 것이다(C형 검출).

도 16은 실시예 3에 따른 하나의 염기가 바뀐 올리고머를 구별해내는 테스트 결과를 나타낸 것이다.

*** 도면 주요부의 설명 ***

1. 탐침 핵산

2. 기판

3. 타켓 핵산

4. 타켓 핵산이 탐침핵산과 혼성화된 이중나선 핵산

5. 인터컬레이터「intercalator, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)」

6. 기준전극(reference electrode)

7. 대전극(counter electrode)

8. 전이금속착물을 포함하는 수용액

9. 작업전극(working electrode)

10. 암상자(dark box)

11. 포탠시오스탯(potentiostat)

12. 작업전극과 금판에 올려진 탐침핵산과의 간격

13. 스트립 형태의 핵산칩

14. 손잡이

15. 핵산 칩을 동일한 경사각으로 식각하여 형성된 구멍

16. 광측정 장치

17. 대전극

18. 스트립형태의 핵산 칩 스팟(SPOT)과 같은 배열과 제작된 작업전극

19 트립형태의 핵산칩

20 투명창

21 핵산칩 케이스

22 포탠시오스탯

23 컴퓨터

24 광섬유(optical fiber)

25 광섬유제어기

26 마이크로 프로세서

27 포탠시오스탯

28 휴대용 전기화학발광핵산칩 측정기

29 제어버튼이 있는 제어판

30 디스플레이 판넬

31 인터페이스를 위한 접속판

32 투입구

<110> LG ELECTRONICS INC. <120> DEVICE AND METHOD FOR DETECTING A NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION USING NUCLEIC ACID CHIPS HAVING SLOPING HOLES <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe A1 <400> 1 gtccctcttg gaagtccatg gt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target oligonucleotide RA1 which is complementary to A1 <400> 2 accatggact tccaagaggg ac 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe B1 <400> 3 taccacagag tctagactcg tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target oligonucleotide probe QC2 <400> 4 ctgtgaggaa ctactgtctt ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe QC3 <400> 5 actcgcaagc accctatcag gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target oligonucleotide RQC3 which is complementary to QC3 <400> 6 gcctgatagg gtgcttgcga gt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe GQC3 in which the 12th base "C" of the QC3 sequence is substituted by "G" <400> 7 actcgcaagc agcctatcag gc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide probe AQC3 in which the 12th base "C" of the QC3 sequence is substituted by "A" <400> 8 actcgcaagc aacctatcag gc 22

Claims

- 비스듬한 이방성 식각(anisotropic etching)에 의하여 양면에 서로 다른 크기로 뚫린 기판을 관통하는 구멍을 갖는 기판, 상기 기판 내의 양면에 형성된 구멍을 잇는 관통 경사면에 고정된 탐침 핵산, 상기 탐침 핵산과 혼성화된 타겟 핵산(3) 및 상기 탐침 핵산과 타겟 핵산이 혼성화된 이중나선 핵산(4)에 선택적으로 결합된 인터컬레이터(5)를 포함하는 핵산 칩;

- 투명창

- 상기 핵산 칩과 일정한 최적 간격을 유지하며 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성되어 있는 쪽에 위치하는 작업전극(working electrode), 작업전극과 적절한 간격을 유지하며 위치하는 기준전극(reference electrode) 및 대전극(counter electrode)을 포함하는 전기화학 장치;

- 상기 핵산 칩, 투명창, 전기화학 장치 및 전이금속착물 수용액을 포함하는 암상자;

- 상기 인터컬레이터(intercalator) 및 전이금속착물을 포함하는 수용액에 인가전압을 가할 수 있는 전원공급장치; 및

- 핵산 칩의 좁은 구멍이 형성된 쪽에 위치하는 광입력 부분과 이를 제어할 수 있는 제어기에 연결된 광측정 장치를 포함하며, 전극과 별도의 기판에 핵산을 고정시킴으로써 핵산의 전기적 손상이 없고, 핵산 칩에 형성된 구멍이 경사면을 포함하여 그 경사면에 핵산을 고정화시키고 반응시킴으로써 인터컬레이터로부터 유도되는 전이금속화합물의 전기화학발광에서 발생하는 빛이 광입력 장치에 집중되어 광측정 시 다른 위치에서 발생한 빛과의 간섭으로 인하여 발생하는 장애가 없는, 경사각이 형성된 구멍을 갖는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 칩의 기판으로서 유리, 실리콘, PCB(printed circuit board) 또는 플라스틱을 경사각을 주어 이방성 식각하여 기판의 양면에 서로 다른 크기로 뚫린 갖는 관통 구멍이 형성되고, 이러한 기판 내부를 관통하여 양 구멍을 잇는 경사면에 금 박막이 코팅된 것을 사용하는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 투명창이 PDMS(polydimethylsiloxane), 유리 또는 투명한 플라스틱으로 되어 있는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 작업전극과 핵산을 올린 핵산 칩의 기판 사이의 간격이 0.31 ~ 1.50 mm인 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 인터컬레이터로서 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 독소루비신(doxorubicin)을 사용하는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 전이금속착물로서 트리스 (2,2'-바이피리딜) 루테늄(II) [tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium(II), Ru(bpy)₃ ²⁺], 트리스 (1,10-페난스롤라인) 루테늄(II) 「tris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II), Ru(phe)₃ ²⁺] 또는 트리스 (2,2'-바이피리딜) 오스뮴(II) [tris(2,2'-bipyridyl)osmium(II), Os(bpy)₃ ²⁺]를 사용하는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산 칩으로서 핵산을 고정시킬 수 있는 스팟(SPOT)의 개수가 사용자의 편의 및 작업 전극의 개수에 따라 적절하게 조절되어 있는 스트립 형태(strip type)의 핵산 칩을 포함하는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 상기 광입력 부분으로서 여러 개의 광섬유(optical fiber)를 사용하고, 여기서 투과되는 빛을 한 번에 제어함으로써, 여러 개의 핵산 칩 구멍에서 발생하는 전기화학발광을 동시에, 또는 시간대 별로 측정할 수 있는 핵산 혼성화 검출기.
제 1 항에 있어서, 디스플레이 판넬, 제어버튼이 있는 제어판, 및 컴퓨터 등의 인터페이스를 위한 접속판을 추가적으로 포함하여, 측정이 간편하고 소형화된, 휴대용 핵산 혼성화 검출기.
- 기판을 경사각을 주어 이방성 식각하여 기판의 양면에 서로 다른 크기로 뚫린 기판을 관통하는 구멍을 형성시키고, 기판을 관통하여 양쪽의 구멍을 잇는 경사면 위에 탐침 핵산을 고정시키고, 여기에 타겟 핵산을 공급하여 혼성화시킨 후, 이중나선 핵산에만 선택적으로 결합하는 인터컬레이터를 공급하여 상기 혼성화된 이중나선에 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 칩 제작 단계:

- 전이금속착물 수용액이 들어있는 암상자에 상기 인터커레이터가 결합된 이중나선 핵산을 포함하는 핵산 칩을 넣고, 작업 전극이 상기 핵산 칩과 일정한 간격을 두고 핵산 칩의 넓은 구멍이 형성된 쪽에 위치하도록 하여 삼전극계의 전기화학 장치를 위치시키고, 상기 전기화학장치를 암상자 외부의 전원공급장치에 연결시키는 단계; 및

- 전원공급장치를 이용하여 적정한 인가전압을 가하여, 암상자 내의 인터컬레이터에 의한 전이금속착물의 전기화학발광을 유도하고, 핵산 칩의 좁은 구멍이 형성된 쪽에 위치하는 광입력 부분에 연결된 광측정 장치를 이용하여 발광량을 측정하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 9 항에 중 어느 한 항에 따른 핵산 혼성화 검출기를 이용하는 핵산의 혼성화 검출방법.