JP4597711B2 - 微少質量検出チップ - Google Patents

Description

本発明は、微少質量検出チップの凹部に「厚み」を挟んで構築した励振電極上に検出ターゲットを捉えるために適切なリガンドを形成し、その上で起きる結合などにより生じる質量の変化を周波数変化として検出する集積型微少質量検出チップ（集積型ＱＣＭセンサ・チップ）の構造に関する。ＱＣＭ：Quartz Crystal Micro-balance の略。

近年、ヒトの遺伝子構造がほぼ解明され、テーラメイド医療、癌特異細胞の解明、予防医療などへの応用のため、多くの遺伝子機能究明に関する研究がなされている。ヒトの遺伝形態を司るとされる核酸は、ヌクレオチドをつなげて出来た紐状の分子で、そのヌクレオチドは糖を中心にしてリン酸（ＰＯ_４）と、4種類の塩基がそれぞれ結合した分子である。糖の形態には、デオキシリボースとリボースの２種類があり、この違いにより「ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）」と、「ＲＮＡ（リボ核酸）」に分けられる。

塩基の種類は、ＡＴＵＣＧの５つの種類であり、ＤＮＡはＡＴＣＧの４塩基組合せ、ＲＮＡは、ＡＵＣＧの４塩基組合せであり、２者間における塩基の違いは、ＴとＵが置換された構造となっている。ここに、Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ｕ（ウラシル）である。4種類の塩基は、それぞれ一定の法則をもって結合し2重螺旋を形成するが、相互的に結合するのは、Ａ-Ｔ（Ｕ）、Ｇ-Ｃ であり、けっしてＡ-Ｇ、Ａ-Ｃ、Ｔ（Ｕ）-Ｃ、Ｔ（Ｕ）-Ｇ との結合はない。

従来のＤＮＡチップによる核酸の配列検出原理は、この結合の基本的約束のもとに、ガラス基板、或いは、シリコーン基板上に塩基配列の判明している1本鎖のＤＮＡ断片を複数種配列し、これに蛍光処理された検体1本鎖ＤＮＡを溶液中で接触させた後、結合部位にレーザ光を照射して結合の状態を蛍光量の様子として比較測定（定性的測定）することで認知するものである。

則ち、従来のＤＮＡチップを用いた検出方式では、レーザを照射して蛍光の様子を比較測定する蛍光検出方式である。この方式では、検体となるＤＮＡに予め蛍光色素で標識をつけ、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に結合した検体ＤＮＡの有無を、レーザ光照射による蛍光色素の発光により検出する方法で、判定までには多くの時間を必要とし、医療現場など緊急判断には問題である。（非特許文献１参照）。

これに対して本願出願人は、リアルタイム計測を目的として既に出願している特許文献１に示す様な水晶基板を用いたＤＮＡチップを提案している。
このＤＮＡチップは水晶基板に形成された各々分離した複数の例えば凸部、凹部ら成る島部（セル）と、その上に構成された電極膜に構築された特有の塩基配列を持つＤＮＡ群から構成され、このＤＮＡチップを溶液中で交流電圧を印加して励振させ、その励振周波数を確認しながら、検体から検出されたＤＮＡを含む溶液を注入するとＤＮＡ相互間の結合の状態により、電極上の質量が微小変化するため、励振周波数が変化する。また、この結合の様子は周波数を繰り返し計測することでリアルタイムに観測することが可能となる。

このとき、各セルの励振電極はそれぞれ独立した引き出し電極により外部接続端子に接続とれており、各セルが独立して励振できるような配線構造をとっている。以上のように、圧電式微小質量計測センサは、例えば水晶振動子表面に電極を形成し、この膜表面上で物質を脱着することにより質量変化を周波数変化として捉える手法であり、この関係をサブレーの式から算出するものである。

原田 学，佐藤 高遠，米田 英克、「ＤＮＡチップの現状と展望」、応用物理、第６９巻、第１２号（２０００） 特開２００３−２８７５３８号公報 なお出願人は前記した先行技術文献情報で特定される先行技術文献以外には、本発明に関連する先行技術文献を、本件出願時までに発見するに至らなかった。

上述する従来法では、ＤＮＡへの蛍光処理作業、大掛かりなレーザ光装置が必要で測定には多くの時間と費用が掛かることから、治療現場などで早急に判断を必要とする場合や、更には、蛍光状態を相互比較する定性測定であり、定量的な測定が出来ないという問題があった。

本発明の具体的な特徴としては、圧電素子を使用して、ＤＮＡの適合性、抗原、抗体反応などを質量変化で観測する場合センサ部の片側を溶液中に露出する必要がある。このとき、溶液に接する電極（反応側電極）は、センサ素子の外周部を経由して気相側に引き出した後、気相環境においてリード線を介して発振器や計測機器などに接続される。

しかし、例えばマトリックス状のセルで構成した集積型反応解析では、一方面の電極を反応電極としそれぞれのセルを逆メサ構造で構築することが最も有効な構造と考える。このとき、検体溶液の容量を節約するためのセルを被う板（蓋体）を構築することが必要であるが、これを固定するための、そしてこの様な形態の場合には、接合法は自由度が少なく、主として接着剤が利用され、反応などに影響しない材料の選定に苦慮しているのが現状である。

また、正確に検体試料の測定を行うには、セル自体の温度管理も徹底することが必要である。特に検体成分によっては、それぞれの反応速度が環境温度によっても左右することになるため、検体試料の反応に相応しい温度管理が必要となってくる。

加えて、検体試料の反応を適切に行うため、温度の上昇、下降、維持を速やかに行う必要があり、従来技術では温度管理手法には大がかりな温度管理環境（例えば恒温槽を用いるなど）が必要となってしまうのが現状である。更に上述する温度管理環境にあっては、測定部分（セル）の本当の温度把握が不可能なため、精度の高い制御ができない。従って、センサ信号に対する正確な温度補正が出来ず、計測結果に誤差が発生するおそれも考えられる。

上述する課題を解決するために本発明は、圧電単結晶基板の表面及び裏面に互いの底面が対向するようにマトリクス状に形成された凹部と、前記凹部の底面に形成される励振電極と前記励振電極を前記圧電単結晶基板の裏面に引き出す引き出し電極とからなる金属膜と、前記圧電単結晶基板の表面に形成されている前記凹部の底面から前記圧電単結晶基板の裏面側へ設けられた貫通孔にシール材が埋め込まれているスルーホールと、前記圧電単結晶基板の裏面に形成されている前記凹部を塞ぐように配置された温度制御手段である熱交換素子のペルチェ素子と、を備え、反応状態を捉えるリガンドを形成する前記圧電単結晶基板の表面に形成された凹部の底面に形成されている前記励振電極を反応電極としたとき、前記反応電極に接続されている前記引き出し電極の一方の端部がシール材の埋め込まれたスルーホールを介して引き出されており、前記熱交換素子のペルチェ素子がそれぞれの前記凹部ごとに配置されていることを特徴とする微少質量検出チップの構造である。

本発明のＤＮＡ検査方法の原理としては、所定の間隔で各々分離した凹部を備えた水晶基板を用意し、各々の凹部上に標識された特有の塩基配列から構成されたリガンド（ＤＮＡ）を固定し、そのときの共振周波数を測定して凹部各々の第１の測定周波数とし、
次ぎに検体となるＤＮＡを含んだ溶液中に所定時間接触させ、各々の凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第２の測定周波数とし、第２の測定周波数と第１の測定周波数との差が発生することにより、検体となるＤＮＡの中から標識されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列のものを検出するようにしたものである。
このＤＮＡ検査方法によれば、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片と結合したＤＮＡの量を具体的に「重さ」として検出することで実現する。

また、反応中に同一セルの周波数を繰り返し計測することにより、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となり、反応の様子と完了を確認することができると同時に、例えば上述する温度制御手段に熱変換素子であるペルチェ素子を用い、前記ペルチェ素子は該圧電基板面の凹部に合わせて形成することにより、セル単位での温度管理が行えるので正確な測定が可能となり、同時に複数の試薬を独立して扱えるので、試料測定に関してデータ測定の効率化を実現できる。

以上説明したように、本発明によれば、水晶基板表裏に複数の凹部を形成し、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの量を検出できるので、複数個のＤＮＡの検査が同時に正確にリアルタイムで行えるようになるという優れた効果が得られる。

また、測定環境の温度管理を徹底することで、温度補正の精度が向上するため反応検出精度が向上する。温度管理については、セル単位の狭い範囲での温度管理ができめることで、正確な測定が可能となり、同時に複数の試薬を独立して扱えるので、試料測定に関してデータ測定の効率化を向上することができる。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における微小質量検出チップ（ＤＮＡチップ）の構成を示す斜視図（ａ）と斜視図（ｂ）である。このＤＮＡチップは、ＡＴカットの水晶基板１上に、１ｍｍ程度の間隔で，凹部の励振周波数が所定値になるように複数の凹部をマトリクス状に形成し、これら複数の凹部２上に形成された金薄膜３上の表面に、リガンド（ＤＮＡ断片）が各々固定されているものである。

凹部２の上へのＤＮＡ断片の固定は、つぎに示すようにする。まず、反応面側電極を親水処理しておく、所望とするＤＮＡ断片の一端がＳＨ基で置換された状態とする。次いで、ＳＨ基で一端が置換されたＤＮＡ断片が分散している溶媒を反応膜に接触させると、金薄膜３の上にＳＨ基が引き寄せられて固着する。この結果、金薄膜３の表面にＳＨ基を介してＤＮＡ断片が固定された状態となる。この後、水晶基板１は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄して溶媒を純水置換する。このとき乾燥させてはならない。

上述するＤＮＡチップの本願発明の特徴には、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成しスルーホールを介して対面側に引き出し、この引き出した側の圧電単結晶基板面に、温度制御手段を備えたことを特徴とする微少質量検出チップである。また、複数個をひとつの圧電基板上に複数の励振電極（反応側電極）上に、それぞれ異なる塩基配列のＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片（リガンド）を固定することで、複数の成分を同時に測定することもできる。

要するに、上述の温度制御手段を配置することで、外部温度の擾乱に対して安定した温度条件の下で反応中に同一セルの周波数を繰り返し計測することにより、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となり、反応の様子と完了を確認することができることに加えて、例えば上述する温度制御手段に熱変換素子５であるペルチェ素子を用い、セル単位での温度管理が行えるので正確な測定が可能となり、同時に複数の試薬を独立して扱えるので、試料測定に関してデータ測定が行える。

図２は図１（ａ）のＡ−Ａ断面を示した図で、金属膜３を避けた箇所を描画したものである。図２では、本願発明の特徴である圧電単結晶基板のＤＮＡを固定する面と対向する裏側の圧電単結晶基板面に、熱変換素子５のペルチェ素子により温度制御を行うものである。従って、図２に示すように熱変換素子５は実装面である圧電結晶基板に対して、前記圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成することで、熱変換素子の実装面には励振電極を避けるための凹部を設ける。

その結果、図３に示す熱変換素子５を配置する側から見た平面図で描画するように各チップ単位で熱変換素子５を配置する構造となるので、ここのセル単位で細かな温度管理ができる。図３では圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、凹部に形成する励振電極を圧電結晶基板の一部にスルーホール４を形成し、裏面へと引き出した引き出し電極の形態であることから、引き出し電極を避けた格好で熱変換素子５を配置した構造となる。なお、スルーホール４はシール材で埋めた構造となっており、ここではシール材としては金シリコン合金を用いているが、イオン化傾向の小さな材料を使用すれば、金シリコン合金に限るものでは無い。

なお、本願発明の微少質量検出チップでは、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成し、スルーホールを介して反対面に引き出したことを特徴としており、圧電基板上に形成する凹部に試験薬を貯めるために、凹部側に蓋体を被せた構造も実現できることで、試料（検体）の量の節約、汚染防止などの効果がある。

本発明の一実施例を示す斜視図である。 本発明の微少質量検出チップの部分断面図を示したものである。 本発明の微少質量検出チップをマトリックス状で見たときの、熱変換素子側から描画した平面図である。

符号の説明

１ 水晶基板
２ 凹部
３ 金薄膜（引き出し電極）
４ スルーホール
５ 熱変換素子

Claims (1)

1. 圧電単結晶基板の表面及び裏面に互いの底面が対向するようにマトリクス状に形成された凹部と、
   前記凹部の底面に形成される励振電極と前記励振電極を前記圧電単結晶基板の裏面に引き出す引き出し電極とからなる金属膜と、
   前記圧電単結晶基板の表面に形成されている前記凹部の底面から前記圧電単結晶基板の裏面側へ設けられた貫通孔にシール材が埋め込まれているスルーホールと、
   前記圧電単結晶基板の裏面に形成されている前記凹部を塞ぐように配置された温度制御手段である熱交換素子のペルチェ素子と、
   を備え、
   反応状態を捉えるリガンドを形成する前記圧電単結晶基板の表面に形成された凹部の底面に形成されている前記励振電極を反応電極としたとき、前記反応電極に接続されている前記引き出し電極の一方の端部がシール材の埋め込まれたスルーホールを介して引き出されており、
   前記熱交換素子のペルチェ素子がそれぞれの前記凹部ごとに配置されている
   ことを特徴とする微少質量検出チップ。

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