JP2006234685A

JP2006234685A - 微少質量検出チップ

Info

Publication number: JP2006234685A
Application number: JP2005051797A
Authority: JP
Inventors: Motoyasu Hanji; 元康判治; Masako Takada; 雅子高田
Original assignee: Kyocera Crystal Device Corp
Current assignee: Kyocera Crystal Device Corp
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-09-07

Abstract

【課題】励振電極上にリガンドを形成し、その上で発生する反応の状態を、質量の変化として検出する集積型微少質量検出チップの引き出し電極に関するもので、極少量の試料においても精度良くリアルタイムにＤＮＡの検査ができるようにすることを目的とする。
【解決手段】課題を解決するために、所定の間隔で各々分離した複数の凹部を備えた水晶基板と、前記凹部に相当部分の表裏には励振電極を形成し、その上にリガンドとして生化学物質である特定のＤＮＡを固定して構成されたＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップの振動部分の主面に形成する電極の一方を、前記ＤＮＡチップの主面の一部にスルーホールを形成して引き出し電極をＤＮＡチップの一方側に導出した構造にすることで、反応面側を微小セルとして密封することが可能となり極少量試料（検体）でも計測が可能となり目的を達成する。
【選択図】図１

Description

本発明は、励振電極上にリガンドを構成し、その上で発生する反応の状態を、質量の変化としてリアルタイムに検出する集積型微少質量検出チップの引き出し電極に関するものである。

本明細書の使用方法を説明するにあたり、ＤＮＡチップを一例として説明する。近年、人の遺伝子構造がほぼ解明され、テーラーメイド医療などを目的に解明された遺伝子の持つ機能の調査，研究が本格化してきている。この遺伝子の機能解明の一手法として、ＤＮＡチップが用いられている。ＤＮＡは、Ａ（アデニン），Ｔ（チミン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）の４つの塩基により形成された２本の分子鎖が、螺旋状に結合して形成されている。４つの塩基は、それぞれ特定の塩基と結合することが可能で、その組み合わせはＡとＴ、ＣとＧとなっている。

従来、ＤＮＡチップは、平板のガラスやシリコンなどの基板上に、高密度に特定のＤＮＡ分子の１本鎖断片を固定したものである。そして、検体となるＤＮＡを被検者の血液から抽出液中に抽出し、その溶液中のＤＮＡを１本鎖に分離切断した後、抽出溶液を含めてＤＮＡチップの表面に滴下すると、ＤＮＡチップ上に構成されたＤＮＡ配列に対応する様に検体ＤＮＡが結合するので、その結合状態を蛍光変化として判定している。

則ち、開発され一部実用化されているＤＮＡチップを用いた検出方式では、レーザを照射して蛍光の様子を比較測定する蛍光検出方式である。この方式では、検体となるＤＮＡに予め蛍光色素で標識をつけ、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に結合した検体ＤＮＡの有無を、レーザ光照射による蛍光色素の発光により検出する方法で、判定までには多くの時間を必要とし、医療現場など緊急判断には問題である。（非特許文献１参照）。

これに対して本願出願人は、リアルタイム計測を目的として既に出願している特許文献１に示す様な水晶基板を用いたＤＮＡチップを提案している。
このＤＮＡチップは水晶基板に形成された各々分離した複数の例えば凸部、凹部ら成る島部（セル）と、その上に構成された電極膜に構築された特有の塩基配列を持つＤＮＡ群から構成され、このＤＮＡチップを溶液中で交流電圧を印加して励振させ、その励振周波数を確認しながら、検体から検出されたＤＮＡを含む溶液を注入するとＤＮＡ相互間の結合の状態により、電極上の質量が微小変化するため、励振周波数が変化する。また、この結合の様子は周波数を繰り返し計測することでリアルタイムに観測することが可能となる。

このとき、各セルの励振電極はそれぞれ独立した引き出し電極により端子に接続とれており、各セルが独立で励振できるような配線構造をとっている。以上のように、圧電式微小質量計測センサは、例えば水晶振動子表面に電極を形成し、この膜表面上で物質を脱着することにより質量変化を周波数変化として捉える手法であり、この現象をサブレーの式から算出している。

原田学，佐藤高遠，米田英克、「ＤＮＡチップの現状と展望」、応用物理、第６９巻、第１２号（２０００）特開２００３−２８７５３８号公報なお出願人は前記した先行技術文献情報で特定される先行技術文献以外には、本発明に関連する先行技術文献を、本件出願時までに発見するに至らなかった。

しかしながら、前述したような、従来の技術では、レーザ照射装置など大がかりな装置が必要となり、システムが高価なものとなる。また、この様な手法では、反応状態を定量的に検出することが容易ではない。本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、リアルタイムに容易に異なる複数種のＤＮＡの検出ができるようにすることを目的とし、更なるＤＮＡチップの利便性を高めた構造となっている。

その具体的な特徴としては、圧電素子を使用して、ＤＮＡの適合性、抗原、抗体反応などを質量変化で観測する場合センサ部の片側を溶液中に露出する必要がある。このとき、溶液に接する電極（反応側電極）は、センサ素子の外周部を経由して気相側に引き出した後、気相環境においてリード線を介して発振器や計測機器などに接続される。しかし例えばマトリックス状のセルで構成した集積型反応解析では、それぞれのセルを逆メサ構造で構築することが最も有効な構造と考える。このとき、検体溶液の容量を節約するためのセルを被う板（蓋体）を構築することが必要であるが、これを固定するための、接合法は自由度が少なく、主として接着剤が利用され、反応などに影響しない材料の選定に苦慮しているのが現状である。

上述する課題を解決するために本発明は、所定の間隔で各々分離した複数の凹部を備えた水晶基板と、前記凹部に相当部分の表裏には電極を形成し、特有な塩基配列を持つ複数の１本鎖ＤＮＡから構成されたＤＮＡチップにおいて、前記ＤＮＡチップの振動部分の主面に形成する電極の一方の引き出し電極を、前記ＤＮＡチップの対向する主面の一部にスルーホールを形成して引き出し電極をＤＮＡチップの一方側に導出したことを特徴とするＤＮＡチップの構造である。

ＤＮＡチップとしては前記凹部上には金薄膜電極が形成され、その電極表面を親水性にする親水処理を施した領域を形成した後、ＤＮＡ断片の一端をＳＨ基置換し、前記ＳＨ基により前記ＤＮＡ断片が前記金薄膜に固定された構造であることを特徴とするＤＮＡチップである。

上述する本発明のＤＮＡ検査方法の原理としては、所定の間隔で各々分離した凹部を備えた水晶基板を用意し、各々の凹部上に標識された特有の塩基配列から構成されたリガンド（ＤＮＡ）を固定し、そのときの共振周波数を測定して凹部各々の第１の測定周波数とし、次ぎに検体となるＤＮＡを含んだ溶液中に所定時間接触させ、各々の凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第２の測定周波数とし、第２の測定周波数と第１の測定周波数との差が発生することにより、検体となるＤＮＡの中から標識されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列のものを検出するようにしたものである。このＤＮＡ検査方法によれば、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片と結合したＤＮＡの量を具体的に「重さ」として検出することで実現する。

また、反応中に同一セルの周波数を繰り返し計測することにより、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となり、反応の様子と完了を確認することができる。

要するに、圧電基板上に反応セル部分を逆メサ加工し、その部分に厚み方向を挟むように励振電極を形成し、凹部（反応部）の電極をスルーホールを介して対向面に引き出し、更にスルーホール部分はイオン化傾向の小さい金合金などで埋め、凹面上側をガラス板などで被うことで密閉構造を得ることを特徴としたＤＮＡチップである。

以上説明したように、本発明によれば、水晶基板上に複数の凹部を形成し、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの量を検出できるので、複数個のＤＮＡの検査が同時に正確にリアルタイムで行えるようになるという優れた効果が得られる。

また、測定ではセンサ部反応面を溶液中に露出する必要があり、従って、溶液に接する電極（反応側電極）の引き出し電極はスルーホールを介して対向する面に導出する構造となるので、直接接合などを利用して反応面側はガラス板などで密閉することが可能となり、セル内を含め溶液の汚染が格段に減少し、少量の溶液で正確な計測が可能となる。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における微小質量検出チップ（ＤＮＡチップ）の構成を示す斜視図（ａ）と断面図（ｂ）である。このＤＮＡチップは、ＡＴカットの水晶基板１上に、１ｍｍ程度の間隔で，凹部の励振周波数が所定値になるように複数の凹部をマトリクス状に形成し、これら複数の凹部２上に形成された金薄膜３上の表面に、リガンド（ＤＮＡ断片）が各々固定されているものである。

凹部２の上へのＤＮＡ断片の固定は、つぎに示すようにする。まず、反応面側電極を親水処理しておく、所望とするＤＮＡ断片の一端がＳＨ基で置換された状態とする。次いで、ＳＨ基で一端が置換されたＤＮＡ断片が分散している溶媒を反応膜に接触させると、金薄膜３の上にＳＨ基が引き寄せられて固着する。この結果、金薄膜３の表面にＳＨ基を介してＤＮＡ断片が固定された状態となる。この後、水晶基板１はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で置換する。このとき乾燥させてはならない。

上述するＤＮＡチップの本願発明の特徴には、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成しスルーホールを介して対面側に引き出したことを特徴とする微少質量検出チップである。また、複数個をひとつの圧電基板上に複数の励振電極（反応側電極）上に、それぞれ異なる塩基配列のＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片などリガンドを固定することで、複数の成分を同時に測定することもできる。

要するに、図１の断面図に示すように、圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、凹部に形成する励振電極を圧電結晶基板の一部にスルーホール４を形成し、裏面へと引き出すことを特徴するものである。なお、図１では個々の素子を表現するために、圧電結晶基板の全体を二点鎖線で示している。

そして、図２に示すように実際に微少質量検出チップとして動作するときには、電気的特性と気密性を維持するためにスルーホ−ル４をシール材で埋めた構造となっている。ここではシール材５としては金シリコン合金を用いているが、イオン化傾向の小さな材料を使用すれば、金シリコン合金に限るものでは無い。

なお、本願発明の微少質量検出チップでは、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成し、スルーホールを介して反対面に引き出したことを特徴とするこどで、圧電基板上に形成する凹部に試験薬を貯めるために、凹部側に蓋体を被せた構造も実現できることで、試料（検体）の量の節約、汚染防止などの効果がある。

本発明の一実施例を示す斜視図（ａ）と部分断面図（ｂ）である。本発明の微少質量検出チップを個別で見たときの、スルーホール部分をシールで塞いだ概念図を示す模式図である。

符号の説明

１水晶基板
２凹部
３金薄膜（引き出し電極）
４スルーホール
５シール材

Claims

所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの該反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、
形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ルを形成し前記スルーホールを介して対面側に引き出したことを特徴とする微少質量検出チップ。
請求項１記載の微少質量検出チップにおいて、電気的特性・気密性を維持するため、スルーホ−ルをシール材で埋めたことを特徴とする微少質量検出チップ。
請求項１及び請求項２記載の微少質量検出チップにおいて、複数の励振電極（反応側電極）上に、それぞれ異なる塩基配列のＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片が固定されたことを特徴とする微少質量検出チップ。