JP4597710B2

JP4597710B2 - 微少質量検出チップ

Info

Publication number: JP4597710B2
Application number: JP2005051798A
Authority: JP
Inventors: 元康判治; 雅子高田
Original assignee: Kyocera Crystal Device Corp
Current assignee: Kyocera Crystal Device Corp
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: JP2006234686A

Description

本発明は、励振電極上にリガンドを形成し、その上で発生する反応の状態を、質量の変化としてリアルタイムに検出する集積型微少質量検出チップの薬液を注入する流路形状に関するものである。

本明細書の使用方法を説明するにあたり、ＤＮＡチップを一例として説明する。近年、人の遺伝子構造がほぼ解明され、テーラーメイド医療などを目的に解明された遺伝子の持つ機能の調査，研究が本格化してきている。この遺伝子の機能解明の一手法として、ＤＮＡチップが用いられている。ＤＮＡは、Ａ（アデニン），Ｔ（チミン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン）の４つの塩基により形成された２本の分子鎖が、螺旋状に結合して形成されている。４つの塩基は、それぞれ結合することが可能で、その組み合わせはＡとＴ、ＣとＧとなっている。

従来、ＤＮＡチップは、平板のガラスやシリコンなどの基板上に、高密度にＤＮＡ分子の断片を固定したものである。そして、検体となるＤＮＡを被検者の血液から抽出液中に抽出し、その溶液中のＤＮＡを１本鎖に分離切断した後、抽出溶液を含めてＤＮＡチップの表面に滴下すると、ＤＮＡチップ上に構成されたＤＮＡ配列に対応して検体ＤＮＡが結合するので、その結合状態を蛍光変化として判定している。

則ち、現在実用化されているＤＮＡチップを用いた検出方式で、レーザを照射して蛍光を測定する蛍光検出方式である。この方式では、検体となるＤＮＡに予め蛍光色素で標識をつけ、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に結合した検体ＤＮＡの有無を、レーザ光照射による蛍光色素の発光により検出する方法で、判定までには多くの時間を必要とし、医療現場など緊急判断には問題である。（非特許文献１参照）。

これに対して本願出願人は、リアルタイム計測を目的として既に出願している特許文献１に示す様な水晶基板を用いたＤＮＡチップを提案している。
このＤＮＡチップは水晶基板に形成された各々分離した複数の例えば凸部、凹部ら成る島部（セル）と、その上に構成された電極膜に構築された特有の塩基配列を持つＤＮＡ群から構成され、このＤＮＡチップを溶液中で交流電圧を印加して励振させ、その励振周波数を確認しながら、検体から検出されたＤＮＡを含む溶液を注入するとＤＮＡ相互間の結合の状態により、電極上の質量が微小変化するため、励振周波数が変化する。また、この結合の様子は周波数を繰り返し計測することでリアルタイムに観測することが可能となる。

このとき、各セルの励振電極はそれぞれ独立した引き出し電極により端子に接続とれており、各セルが独立で励振できるような配線構造をとっている。以上のように、圧電式微小質量計測センサは、例えば水晶振動子表面に電極を形成し、この膜表面上で物質を脱着することにより質量変化を周波数変化として捉える手法であり、この現象をサブレーの式から算出している。

原田学，佐藤高遠，米田英克、「ＤＮＡチップの現状と展望」、応用物理、第６９巻、第１２号（２０００）特開２００３−２８７５３８号公報なお出願人は前記した先行技術文献情報で特定される先行技術文献以外には、本発明に関連する先行技術文献を、本件出願時までに発見するに至らなかった。

しかしながら、前述したような、従来の技術では、レーザ照射装置など大がかりな装置が必要となり、システムが高価なものとなる。また、この様な手法では、反応状態を定量的に検出することが容易ではない。本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、定量的測定、リアルタイムに容易に異なる複数種のＤＮＡの検出ができるようにすることを目的とし、更なるＤＮＡチップの利便性を高めたＤＮＡチップ構造となっている。

その具体的な特徴としては、圧電素子を使用して、ＤＮＡの合致性、抗原、抗体反応などを質量変化で観測する場合センサ部の片側を溶液中に露出する必要がある。このとき、溶液に接する電極（反応側電極）は、センサ素子の外周部を経由して気相側に引き出した後、気相環境においてリード線を介して発振器や計測機器などに接続される。しかし例えばマトリックス状のセルで構成した集積型反応解析では、それぞれのセルを逆メサ構造で構築することが最も有効な構造と考える。

上述する微少質量検出チップを用いた場合、計測時の試薬、媒質溶液が少量である場合、試薬の流れにムラがあったり、また凹部を備えた圧電単結晶基板の微少質量検出チップの場合にあっては、溶液を入れ替える過程において、凹部の角部に試薬が残存することも考えられ、試薬溶液中の反応が均一に行き渡らないなどの課題がある。

上述する課題を解決するために本発明は、所定の間隔でそれぞれの分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、前記凹部の底面側の励振電極を反応電極とし、前記反応電極に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、前記凹部内への試薬の注入または前記凹部内からの前記試薬の排出を行う溝部の流路が隣接する前記凹部を連結するように形成されており、前記溝部の流路の前記凹部に接続している端部が前記凹部側に２稜線に１２０°に拡がっており、前記凹部の底面側の前記励振電極がシール材の埋め込まれているスルーホールを介して前記凹部の前記底面に対向する面に形成されている引き回し電極に接続されており、前記凹部の前記底面に前記励振電極と同形状に形成されたへこみに励振電極が形成され前記凹部の底面側の前記励振電極の一方の主面が露出された状態となり、露出されている前記励振電極の一方の主面と前記凹部の底面とが同一平面上に位置していることを特徴とする微少質量検出チップである。

そして、その微少質量検出チップにおいては、個々の微少質量検出チップの前記圧電単結晶基板に形成する溝部の流路の凹部内側の一方には、２稜線に１２０°に拡がる流路があり、他方の流路にも２稜線に１２０°に拡がる流路により他方の前記流路に連結した微少質量検出チップが連続した形態を有している。

ＤＮＡ検査方法の原理としては、所定の間隔で各々分離した複数の凸部や凹部などからなるセルを備えた水晶基板を用意し、例えば各々の凹部上に標識された特有の塩基配列から構成されたリガンド（ＤＮＡ断片）を固定し、溶液中でＤＮＡ断片が固定された状態の各々凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第１の測定周波数とし、次ぎに検体となるＤＮＡ（狙いとするＤＮＡ）を含んだ溶液中に所定時間接触させ、各々の凹部の共振周波数を測定して凹部各々の第２の測定周波数とし、第２の測定周波数と第１の測定周波数との差が発生することにより、検体となるＤＮＡの中から標識されたＤＮＡ断片と同じ塩基配列のものを検出するようにしたものである。このＤＮＡ検査方法によれば、各凹部における第１の測定周波数と第２の測定周波数との差により、各凹部上に固定されているＤＮＡ断片に結合したＤＮＡの重量を検出することで実現する。

また、反応進行中に繰り返し周波数を計測することにより、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となるほか微少質量検出チップ同士を連続して接続した流路を形成することで、異なる特有の塩基配列のＤＮＡを用意しておき、同一検体ＤＮＡ溶液を流路を介して流すことで、複数の反応結果を得ることができる。

以上説明したように、本発明によれば、試薬溶液の乱流を防止することが出来、溶液残が発生しないので、確実に反応に対して溶液を分離して扱うことができるので計測信頼性が向上する。その結果サブレーの理論に基づいて測定結果を忠実に再現できることにより、公式をそのまま利用して精度良く計測が可能となる。また、凹部の液導入出口壁面を１２０°に開く形態を有する微少質量検出チップは、凹部角部に残留する試薬を無くすことにより、使用する試薬の変換量が少量でも液の置換が確実になり、精度の良い計測が可能となるため測定効率を向上することができる。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における微小質量検出チップ（ＤＮＡチップ）の構成を示す斜視図（ａ）と断面図（ｂ）である。このＤＮＡチップは、一辺が２０〜２５ｍｍ程度、板厚０．１ｍｍ程度のＡＴカットの水晶基板１上に、直径１ｍｍ程度，深さ５０〜６０μｍ程度の複数の凹部２が、２ｍｍ間隔でマトリクス状に形成され、これら複数の凹部２上に、励振電極として金を表面を表面とするが、チタン−金合金の薄膜を形成し、励振時の周波数別に２５〜４０ＭＨｚ程度になるように凹部を加工し、形成された金薄膜３の表面に、リガンド（ＤＮＡ断片）が各々固定されているものである。

凹部２の上へのＤＮＡ断片の固定は、つぎに示すようにする。まず、所望とする１本鎖ＤＮＡ断片の一端をＳＨ基で置換された状態とする。次いで、ＳＨ基で一端が置換されたＤＮＡ断片が分散している溶媒中に、金薄膜３が各凹部２の表面に形成された水晶基板１を浸漬する。このことにより、金薄膜３の上にＳＨ基が引き寄せられて固着する。この結果、金薄膜３の表面にＳＨ基を介してＤＮＡ断片が固定された状態となる。この後、水晶基板１上の溶液はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で置換しておく。

上述するＤＮＡチップの本願発明の特徴には、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部２を備えた圧電単結晶基板の凹部２の表裏に励振電極を形成し、凹部の底面側に形成された励振電極がシール材の埋め込まれたスルーホールを介して凹部の底面に対向する面に形成されている引き出し電極に導出されていることを特徴とする微少質量検出チップである。また、複数個のひとつの圧電単結晶基板上に複数の励振電極（反応電極）に、それぞれ異なる塩基配列ＤＮＡ、或いは、ＲＮＡ断片（リガンド）を固定することで、各種成分を同時に測定することができる。

要するに、図１の断面図に示すように、圧電単結晶基板１の凹部２の表裏に励振電極３を形成し、凹部２に形成する励振電極３を圧電単結晶基板１の一部にシール材（図示せず）が埋め込まれたスルーホール４を形成し、裏面へと引き出している。なお、図１では個々の素子を表現するために、圧電単結晶基板１の全体を２点鎖線で示している。

ここで、図１については、リガンドを形成する箇所が圧電単結晶基板１の凹部２の底面側に励振電極を形成したものであり、かつ、凹部２の底面であって励振電極が形成される電極形成部をさらに削りリガンドが底面の表面と同一面（高さ）になるようにしたものである。
この微少質量検出チップで使用する電極膜厚は数百ｎｍ程度のものが使用され、計測しようとするＤＮＡ分子数層分の厚みとなる。ここで、重量−質量数変換のためのＳａｕｅｂｒｅｙの式（１式）は、以下に示す式となっている。

ｄＦ＝−（ｄＭＦ^２）／（Ａρｋ_ｆ）・・・（１式）
ｄＦ^２：周波数変化
ｄＭ：質量変化
Ｆ：励振周波数
Ａ：電極面積
ρ ：水晶の密度
ｋ_ｆ：水晶のＴＳ−ｍｏｄｅでの音速
であり、電極膜側面部（膜厚）に付着反応した場合は膜厚部分に測定誤差が発生することになる。従って、リガンドの形成表面と凹部底面の表面と同一（平坦になる）にすることで、本願発明の主眼でもある、計測精度の向上と流路６から試料を注入した場合の試料の流れが更に円滑になることで、測定効率を高めることができる。

しかしながら、凹部底面に形成するリガンドの全体高さは僅かであるために、図１で示す形態であっても、図２で示す形態であっても同様に試料の流れの円滑性と、リアルタイムで検体を測定できることには変わりは無い。

そして、微少質量検出チップとして動作するときには、電気的特性と気密性を維持するためにスルーホール４をシール材で埋めた構造となっている。ここで、シール材としては金シリコン合金を用いているが、イオン化傾向の小さな材料を使用すれば、金シリコン合金に限るものでは無い。

なお、本願発明の微少質量検出チップでは、所定の間隔でそれぞれ分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、一方面の電極を反応電極としそれぞれの反応側電極上に反応状態を捉えるリガンドを形成し、形成された励振電極の引き出し電極の一方を、前記チップの主面にスルーホ−ル４を形成し、スルーホールを介して反対面に引き出したことを特徴として記述しているが、圧電基板上に形成する凹部に試験薬を貯めるために、凹部側に蓋体を被せた構造と、試料（検体）の量の節約、汚染防止などの効果がある。

図２に示す模式図は蓋体を割愛した図で、本願発明の特徴である流路６の構成と、凹部２内の流路の入口と出口との形態を説明する図である。図２では矢印で示す方向で溶液を流すことを表示したものである。この形態によりその微少質量検出チップにおいては、個々の微少質量検出チップの前記圧電単結晶基板１に形成する溝部の流路６の凹部２内側の一方には、２稜線に１２０°に拡がる流路６があり、他方の流路にも２稜線に１２０°に拡がる流路６により他方の前記流路６に連結した微少質量検出チップが連続した形態を有することができ、リアルタイムに反応状態を観測することが可能となる。なお、１２０°に拡がる流路６により、その周辺部の試料の溜まりを防止することができる。

そして同時に、微少質量検出チップ同士を連続して配置し、各々のチップを流路６により接続することで、異なる特有の塩基配列のＤＮＡを用意しておき、同一検体ＤＮＡ溶液を流路６を介して流すことで、複数の反応結果を得ることができる。

本発明の一実施例を示す斜視図（ａ）と部分断面図（ｂ）である。本願発明の要部を説明する拡大図である。

符号の説明

１水晶基板
２凹部
３励振電極
４スルーホール
６流路

Claims

所定の間隔でそれぞれの分離した複数の凹部を備えた圧電単結晶基板の凹部の表裏に励振電極を形成し、前記凹部の底面側の励振電極を反応電極とし、前記反応電極に反応状態を捉えるリガンドを形成した微少質量検出チップにおいて、
前記凹部内への試薬の注入または前記凹部内からの前記試薬の排出を行う溝部の流路が隣接する前記凹部を連結するように形成されており、
前記溝部の流路の前記凹部に接続している端部が前記凹部側に２稜線に１２０°に拡がっており、
前記凹部の底面側の前記励振電極がシール材の埋め込まれているスルーホールを介して前記凹部の前記底面に対向する面に形成されている引き回し電極に接続されており、
前記凹部の前記底面に前記励振電極と同形状に形成されたへこみに励振電極が形成され前記凹部の底面側の前記励振電極の一方の主面が露出された状態となり、露出されている前記励振電極の一方の主面と前記凹部の底面とが同一平面上に位置している
ことを特徴とする微少質量検出チップ。