KR101958741B1 - 란탄족 킬레이트의 전기 여기를 위한 일체형 카본 전극칩과 이런 칩들을 사용한 분석방법 - Google Patents

Abstract

카본 페이스트와 표지화합물인 테르븀 킬레이트로 만든 전극이 있는 분석 및 진단에 사용하기에 적합한 저렴한 전기화학발광 기술과 장치.

Description

란탄족 킬레이트의 전기 여기를 위한 일체형 카본 전극칩과 이런 칩들을 사용한 분석방법{INTEGRATED CARBON ELECTRODE CHIPS FOR THE ELECTRIC EXCITATION OF LANTHANIDE CHELATES, AND ANALYTICAL METHODS USING THESE CHIPS}

본 발명은 전기화학발광 검출에 적합한 분석방법과 도구에 관한 것이다. 본 발명은 특히 저렴한 전극 재료, 셀, 일회용 진단 칩 및 카트리지가 필요할 때, 빠른 정량적 진단을 위한 분산분석에 사용된다.

꽤 오랫동안 빠르고 민감한 정량적 진단 기술에 대한 거대한 상업적 수요가 존재해왔다. 이런 기술들은 의료, 연구, 농업, 환경보호, 수의학 및 일부 산업생산 부문을 포함하여 매우 광범위한 시장 영역에서 사용하기에 적합하다. 향상된 민감도, 높은 처리량, 쉬운 사용, 견뢰성, 테스트당 낮은 비용이라는 요소가 이런 진단 기술로 실현될 수 있다면 새로운 시장의 영역을 개척할 수 있게 될 것이다.

어떤 진단 기술은 민감도는 매우 높지만 비용이 많이 든다. 다른 방법들은 상업적으로 경쟁력은 있지만 다양한 시장 영역의 필요를 충족시킬 수 있을 만큼 광범위하게 적용할 수 없다. 높은 민감도에 대한 요구와 상업적 타당성 및 폭넓은 적용성이 결합된 기술은 앞으로 진단 시장에서 중요한 위치와 큰 가능성을 지니게 될 것이다.

현자의 진단기기는 몇 가지 다른 분석방법을 사용한다. 그런 분석방법의 예로는 방사선 표지법, 효소면역분석법, 비색정량법, 형광, 화학발광 및 양극이나 열전자 유도 전기화학발광(ECL) 등을 들 수 있다. 열전자 유도 화학발광(HECL)은 Kulmala S. 등의 미국 특허번호 6251690에 상세히 설명되어 있다. 이들 각 기술에는 저마다 특별한 민감도 수준, 쉬운 사용, 견뢰성, 속도 및 사용 비용의 요소가 결합되어 있는데 바로 이런 요소들이 시장성을 결정한다. 이런 특성들의 차이는 방법의 물리적 제약에 의해 결정된다. 예를 들면, 많은 방사선 표지법 사용의 단점은 방사능 분열의 결과로 시간이 지나면 표지가 약해지고 안전 및 환경보호의 관점에서 볼 때 방사성 폐기물로 인해 추가 비용이 들어간다는 점이다. 분산 진단에서 민감도 높은 여러 기술을 사용하는 것은 테스트와 측정도구가 매우 복잡하여 전문가만 사용할 수 있다는 한계가 있다. 측정의 복잡성은 또한 대개 측정도구와 테스트의 비용과 직접적인 관계가 있다. 예에서 볼 수 있는 바와 같이, 특히 양극 전기화학발광(ECL)이 상업적으로 인기있는 검출방법이 되었다고 말할 수 있겠다. 양극 ECL을 기반으로 하는 측정도구들은 사용하기 복잡한 기능이 있는 실험실 로봇이기 때문에 그런 기기를 사용하려면 전문적인 지식이 필요하다. 또한 이들의 측정 프로세스에는 반복하여 되풀이해야 하는 복잡한 세척 및 준비 단계가 포함된다. 따라서 그런 분석방법들은 상기에 언급된 모든 요소들이 측정 비용을 증가시키고 폐기물의 양을 증가시키는 요인이 되기 때문에 실제적으로 필요한 분산분석에 사용할 수 없다.

상업적으로 중요한 기술들은 소위 표지화합물(labeling compound)을 사용하여 혼합물 속의 분석물질들을 확인하고 측정하는 방법을 사용한다. 면역분석 같은 생물학적 분자의 특성에 기초한 측정에서는 여러 분자들의 혼합물 중에서 측정 대상이 되는 분석물질(X)을 선택적으로 고체상(solid phase)의 항체에 부착되도록 할 수 있고 부착된 분자들을 표지된 즉 접합한 표지화합물로 표지한 다른 어떤 화합물(X)의 특정한 항체를 이용하여 측정할 수 있다. 표지화합물의 예로는 방사성 동위원소, 효소, 광흡수 분자, 형광성이나 인광성 분자, 일부 금속 킬레이트 등을 들 수 있다. 표지(label)는 화학결합에 의하여 항체에 부착된다. 정제된 화합물(X)에 표지할 수 있으며 경쟁반응에 의해 미지시료(unknown sample)에서 표지되지 않은 (X)을 확인하는데 사용된다. DNA와 RNA에 대한 측정 기술에서도 선택적 생체친화성을 이용하고 있기 때문에 유사한 방법으로 측정한다. 이런 방법으로 몇 가지 다른 화학적 및 생화학적 분석도 실시할 수 있다. 요즈음, 비용을 낮추고 측정의 정확도를 높이기 위해, 시료에 대해 동시에 몇 가지 파라미터를 측정하는 방법에 대한 요구가 점차 커지고 있다. 동시 측정을 가능하게 하는 한가지 방법은 서로 다른 파장의 발광성(형광성 또는 인광성)을 지니는 표지나 서로 다른 라이프타임을 가지는 표지를 사용하는 것이다. 면역진단에 사용할 수 있는 다양한 측정 방법과 전략은 The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994의 1-618 페이지에 설명되어 있다. 즉 표지화합물을 표지로 사용하지 않을 때만 그 화합물을 분석할 수 있다는 것이다.

분석에서 표지화합물로 사용하기에 적합한 유기화합물과 금속 킬레이트는 광선이나 전기화학적으로 여기 상태가 되게 하여 표지화합물 고유의 발광을 일으킬 수 있다는 것은 이미 알려진 사실이다. 축광이나 전기화학발광 기반 기술은 보통 민감도가 매우 높아 표지화합물의 여기(excitation)에 매우 적합하다. 그러나 측정 농도가 매우 낮을 때는 경우에 따라 어려움이 발생할 수 있다. 형광을 사용하는 것은 특히 Tyndall, Rayleigh 및 Raman 산란 때문에 복잡해질 수 있다. 생물학적 시료를 측정할 때는 여기펄스 후에 강도는 거의 잃지 않지만 배경의 형광이 오래가지 못한다. 액체상에서 인광은 주로 란탄족 이온을 특별히 합성된 유기분자 킬레이트와 함께 사용할 때만 사용할 수 있다. 오래 지속되는 표지화합물의 축광을 이용하는 이런 기술들의 문제점은 측정도구가 복잡하고 값이 비싸다는 것이다.

일반적으로 ECL의 특별한 장점은 전기 여기의 비용이 낮고 축광에 비하여 구조가 보다 간단하기 때문에 복잡한 여기 광학(excitation optics)이 필요없다는 것이다. 또한 상기에서 설명한 바와 같은 축광의 많은 문제를 피할 수 있다는 장점이 있다. 보통 불활성 금속 전극이 사용되는 소위 양극 전기화학발광을 사용하는 방법은 비수성 용매 안의 비교적 간단한 장비를 사용하여 유기발광단 표지로 실시하는 것이 가능하다. 그러나 주요 상업적 관심점인 생체친화성 분석은 대부분 수용액에서만 작용한다. 생체친화성 분석을 위한 시료는 거의 항상 수용액이기 때문에 표지에 대한 측정 기술은 물속에서나 적어도 미셀러 수용액(micellar aqueous solution)에서 이루어져야 한다. 게다가 특정한 천이금속 킬레이트만 수용액이나 미셀러 수용액 속에서 양극 ECL의 ECL 표지로서 기능할 수 있다.

따라서 분석화학에서 상업적으로 가장 중요하게 사용되는 양극 ECL 활용 기술은 Ru(bpy)₃ ²⁺ 킬레이트 유도체를 표지로 활용하여 미셀러 수용액에서 그 표지를 검출하는 기술이다. 미셀러 용액은 조절이 어려운 미셀러 균형(micellar equilibria)의 복잡성 때문에 항상 다양한 교란 요인에 대해 민감하다.

따라서 미셀(micelles)에 의존하지 않는 열전자 유도 ECL은 양극 ECL에 비해 몇 가지 중요한 장점이 있다. 그래서 본 발명의 실시예는 주로 음극 ECL을 이용한다. 또 양극 방식은 면역분석과 DNA 하이브리드화 분석에는 사용할 수 없다(Blackburn, G., et al., 1991, Clin. Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., et al. 1992, Clin. Chem. 33: 873-879). 현재 이 방법은 Roche Diagnostics으로 상업적 이용되고 있다. 실험실 로봇은 자성입자를 이동시키는 방법으로 이 자성입자와 함께 분석물질의 정량적 측정을 위한 표지를 영구사용 금 작업 전극으로 옮겨서 면역분석과 DNA나 RNA 탐침 검사를 실시한다(Massey, Richard J., et al. US 5746974; Leland, Jonathan K., et al. US 5705402). 자성 라텍스 입자를 반복하여 처리하는 것이 여러면에서 어렵기 때문에, 이 기술은 복잡하고 정확한 액체 처리장치가 있는 고가의 실험실 로봇(예: Elecsys 1010, 2010)이 있어야만 사용할 수 있다. 게다가 영구사용되는 무거운 금 작업전극은 각 분석 사이에 장황한 세척 및 전처리 과정이 필요하다(Elecsys Service Manual, p. 70).

미국 특허번호 5705402가 보여주는 것처럼, 표지물질의 여기 작용은 금 전극과 접촉하는 미세입자의 표면에서 일어나기 때문에 전계발광에서 미세입자를 사용하는 것이 꼭 최선인 것은 아니다. 설사 미세입자가 아무리 작다 할지라도(예를 들면, 직경 2800nm), 둥근 입자 표면의 매우 작은 부분만 전극과 접촉될 수 있다. 따라서 미세입자에 의해 운반되는 표지입자의 아주 작은 부분만이 여기에 이용된다. (광학적으로 투명하지 않은) 작업 전극의 반대 방향의 검출기에서는 광자의 일부분만 보이기 때문에 라텍스 입자를 포함하는 자성재료의 나쁜 광학적 투명성으로 인해 작업의 효율성은 더 떨어진다. 이 방향은 일반적으로 전통적인 분석기에서 검출기가 보이는 방향이다.

전통적인 전기화학 기반의 보통의 양극 ECL은 불활성 금속(예: 백금 또는 금)이나 카본을 작업 전극으로 사용해야 한다. 그러나 이런 전극 재료은 물분해(양극에서 발생되는 산소와 음극에서 발생되는 수소)로 인한 좁은 전위창(potential window) 때문에 제한적으로 사용된다. 따라서 ECL 표지처럼 사용하기에 적합한 발광단은 좁은 전위창으로 인해 여기 반응을 일으킬 만큼 충분히 높은 양극 및 음극 전위에 도달할 수 없기 때문에 일반적인 방법으로는 이들 전통적인 불활성 전극을 전기적으로 여기 상태로 만들 수 없다. 이것은 또한 양극 ECL로는 멀티파라미터 분석에 꼭 필요한 동시 여기 작용이나 몇 가지 다른 표지에 대한 시간 분해 검출(time-resolved detection)이 불가능한 이유이기도 하다. 양극 ECL은 매우 큰 중앙집중식 연구소에만 적합하다. 측정장치의 복잡성과 높은 비용의 결과로 양극을 사용하는 장치와 기술은 이전에 알려진 형태로는 작은 건강 클리닉이나 환자의 집에서 이루어지는 의사의 진료 등 분산분석이 필요한 시장 영역에서 사용하기에는 적합하지 않다.

상기에서 논의한 문제 외에도 생체친화적 분석에서 양극 ECL과 HECL의 중요한 단점 한가지는 반응 분자들이 동적 평형에 도달하는데 걸리는 인큐베이션 시간이 길다는 것인데 그런 동적 평형은 분석의 정확도를 높이기 위해서는 필수적이다. 이런 문제는 다공성 디스크 장치를 이용하여 꽤 효과적으로 해결할 수 있다(US 2009178924 (Al), Ala-Kleme, T. et al.). 그러나 이들 장치의 문제는 현재까지는 이런 장치들에는 오직 하나의 작업 전극만 있고, 카운터 전극은 일렉트로케미루미노미터(electrochemiluminometer)의 영구사용되는 셀 안쪽에 있다는 것이다. 그래서 셀을 세척할 때는 매우 신중하게 다루어야 하는데 이런 세척 작업은 때로 매우 어렵다. 또한 특별히 카운터 전극을 형성하는 양극막(anodic film)을 제거하는 것은 시간이 많이 소모되는 매우 어려운 작업이다. 대안으로 카운터 전극을 어렵사리 작업 전극 근처 측정 카트리지에 배치할 수도 있겠지만 그렇게 하면 그것이 방해물이 되어 전극에서부터 발생하여 도달하게 되는 빛을 지나치게 방해하게 된다.

열전자 전기화학을 이용하여 절연체로 덮인 실리콘 전극이나 절연체로 덮인 알루미늄 전극을 작업 전극으로 사용하고(FI 20100246, Kulmala, S., et al.) 도체를 양극으로 사용하는 평평한 표면을 사용했다. 열전자 전기화학의 문제점은 동일한 전극 재료로 양극/음극 시스템을 통합한 평면을 이루어 산화물로 덮은 실리콘이나 알루미늄 음극과 동일하게 훌륭한 결과을 얻을 수 있는 전극 형태는 현재 존재하지 않는다는 점이다. 실리콘과 알루미늄의 문제는 몇 번의 첫 번째 여기펄스를 통해서만 표지를 여기할 수 있기 때문에 이런 재료로 만든 음극/양극 칩들이 통합된 평판을 이용할 수 없다는 것이다. 그 다음에 나온 것이 매우 빠른 양극 산화층 형성을 통해 전류가 셀을 통과하는 것을 막아 완전한 산화층의 형성 동안 매우 높은 강도의 고체 상태로 전계발광이 일어나게 하는 방법이다(예전에는 갈바노루미네선스(galvanoluminescence)라고도 함). 그러나 갈바노루미네선스의 단점은 오래 지속되는 발광 부품이 포함되어 있어서 시간 분해 전기화학발광 측정을 란탄족 킬레이트 표지와 함께 사용할 수 없다는 것이다. 유기고분자로 알루미늄이나 실리콘 음극/양극 칩의 표면을 보호하여 그런 문제를 줄일 수는 있지만 표지화합물의 여기 작용을 통해 평판 음극/양극 칩을 생체친화성 분석에 성공적으로 사용할 수 있는 전극 재료를 찾는다는 것은 불가능해 보인다.

우리가 음극/양극 칩의 개발을 위해 힘쓸 때, 알루미늄 전극의 양극 부분에서 유리 기반 칩을 사고에 의한 양극의 산화를 막기 위해 카본 페이스트로 덮고 양극과 음극 부분 모두를 카본 페이스트로 덮어야만 했다. 칩을 다 만든 다음, 측정에서 칩을 테스트했을 때 놀랍게도 Tb(III) 킬레이트가 큰 진폭의 전기펄스와 함께 빛을 발생시켰다. 우리는 비록 카본 전극과 다른 도체의 터널 방출은 가능하지 않다 해도, 이런 현상은 열전자 전기화학으로 인한 것이라 가정했다. 비교를 위해, 유리 형광체(8-하이드록시 퀴놀론과 7-아미노-4-메틸 쿠마린)도 여기시키려고 해보았으나 카본 전극으로 측정가능한 ECL를 발생시키지는 못했다. 그로써 카본 전극쌍의 테르븀 킬레이트에 적합한 이전에 알지 못했던 카본 전극과 관련된 현상을 발견한 것이라는 사실을 알게 되었다. 최근에야 풀러린, 카본 나노튜브 및 현재의 새로운 카본 기술의 유사한 기반 재료가 발견되었고 탄소화합물에 대해서는 많은 것이 밝혀지지 않았고 연구되지 않은 부분이 많다. 우리가 설명한 여기(excitation)는 리간드를 통해 발생한 여기가 아니라 전극 표면과 테르븀 이온과의 직접적인 접촉으로 인한 것일 수 있다. 또 전극 표면의 기체 형성(수소와 산소, 특히 그 기체들의 원자 형태)이 반응 메커니즘에서 중요한 부분을 차지한다고 추측할 수도 있다. 어쨌든 본 발명에서 제시한 전기화학발광은 아직 반응 메커니즘이 분명하지는 않으나 생체친화성 분석에 효과적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따라, 음극/양극 칩을 대체할 전극/전극 칩(EE칩)을 생산할 수 있다. EE칩에서는 칩의 두 개의 전극 중에서 어떤 전극을 음극으로 사용하고 어떤 전극을 양극으로 사용할지는 문제가 되지 않는다. 프린팅 방법으로 카본 페이스트 전극을 생산하는 기술은 아마도 전극 생산 기술 중에서 가장 저렴한 기술이기 때문에, 이런 혁신 기술은 일회용 전기화학발광 기반 진단 칩과 카트리지라는 점에서 볼 때 획기적인 기술이라 할 것이다. 따라서 본 발명에서 설명한 종류의 EE칩을 사용하여 가장 경쟁력 있는 전기화학발광 기술을 완성할 수 있다. 그리고 이 기술은 HECL을 사용할 때 보다 훨씬 저렴하다. 상기의 내용을 가능하게 하는 방법과 장비는 청구항 제1 내지 제5항에 기개되어 있다. 본 발명에 따라, 전해질 용액에서 란탄족 킬레이트를 전기적으로 여기시키는 방법에 있어서, 상기 여기는 카본 페이스트로 제조된 두 개의 전극들로 구성되는 전극 칩에서 1나노초와 1000초 사이의 시간, 0.001Hz-1200Hz 사이의 주파수, 1V-400V 사이의 진폭을 가지는 전압 펄스로 수행되고, 상기 두 개의 전극들 모두는 양극 또는 음극으로 사용될 수 있고, 상기 란탄족 킬레이트는 음극 전극에서 여기되는 것을 특징으로 하는 방법을 개시한다.

고분자 카트리지의 절반에서 본 발명에 설명한 카본 전극쌍을 직접 만들고 나면 전술한 절반은 그 자체가 보통의 EE칩보다 커진다는 것도 주목할 만하다. 이 절반 위에서 종합적인 유체의 작용과 시료를 취하고 더하고 여과하며 시약을 첨가하는 작업이 진행될 수 있다. 이 절반은 광학적으로 투명할 필요는 없다. 카본 전극이 없는 절반은 완전히 광학적으로 투명한 것이 좋긴 하지만 광학적으로 투명한 창 부분만을 포함시키는 방법도 있다. 또한 이 창은 필요할 경우, 적절한 재료만 사용한다면 광학 필터의 기능을 할 수도 있다.

도 1. 간단한 EE칩. 베이스는 19mm x 10mm 크기의 유리 또는 플라스틱 칩(1)이며 그 위에 양면테이프로 전극 (2)와 (3)을 붙이고 브러시로 페인트칠하거나 프린트한다. 건조된 전극 위에 구멍을 낸 접착 플라스틱 시트로 만든 링(4)을 붙였다. 이 링을 그 자체의 접착제로 칩에 붙여 내부 직경이 7mm인 셀 영역(5)을 만들었다. 이 셀에 80-150μL의 시료나 기타 솔루션을 페핏으로 넣을 수 있었다.
도 2. 플라스틱 셀 베이스 (a), 카본 전극을 알루미늄이나 실버 잉크층 위에 만들어서 전극의 전기 접촉 표면이 카본 페이스트 없이 남겨진 EE칩 (b), 천공기로부터 바닥에 보호막으로 테핑(c), 사각 테이프와 자가점착 표지를 위한 준 천공 도구 (d), 시료의 피펫을 기다리는 측정 셀에 놓여진 EE칩.
도 3. 어렵게 제작한 카본 페이스트 전극에 대한 Tb(III) 킬레이트 보정 곡선, (a) 실시예 2의 전극. (b) 실시예 3의 전극, (c) 실시예 4의 전극과 (d) 시료 5의 전극.
도 4. 전기화학발광의 강도에 미치는 가황산염의 영향.
도 5. EE칩과 연결된 PDMS 칩. (1) 베이스 부분, 대개 고분자, 종이, 판지나 유리, 또는 그런 재료들을 함께 사용하여 만든다. (2)와 (3)은 카본 전극과 동일한데 선택적으로 다르게 코팅할 수 있다. (5) 하부 표면 위의 인큐베이션 챔버와 측정 챔버가 있는 (4) PDMS 칩과 시료 주입과 시약 첨가를 위해 칩을 통과해서 도달하게 되어 있는 열린 챔버 (6), (7)이 인큐베이션 영역으로 연결되는 미세관과 공기 제거관. PDMS 칩과 EE 칩을 작은 클렘프로 함께 눌렀다. 카트리지는 균일하게 접착제로 함께 붙일 수 있었지만 미세관이 막히는 것을 막기 위해 클램핑으로 연결하는 방법을 사용했다. 클램프 대신에 칩을 단단하게 함께 고정시키는 플라스틱 틀을 사용하는 방법도 사용할 수 있을 것이다.
도 6. EE 칩과 PDMS 칩으로 만든 카트리지에서의 면역분석.
도 7. EE 칩에서의 하이브리드화 분석.
도 8. EE 칩에서의 두 가지 동시 면역분석.

본 발명은 면연분석이나 DNA 하이브리드화를 일회용 EE칩에서 실시하거나 EE칩위의 다공성층을 사용하여 실시할 때, 간단하고 저렴한 장치를 앞에서 설명한 복잡한 측정도구만큼 효율적으로 다양한 분석에 사용하는 방법을 보여준다. 이 방법으로 측정장치와 측정 셀 모두 분산분석에 사용할 수 있을 만큼 저렴하다.

본 발명은 다양한 다른 칩 재료 위에 EE 셀을 만드는 여러가지 방법을 설명한다. 이 재료에는 특히 다양한 종류의 플라스틱, 고분자, 종이, 다양한 방식으로 코팅된 종이, 판지가 포함된다. 이런 종류의 재료들은 미세분석 장치나 카트리지에 사용하기 쉬워서 기타 분석에 필요한 모든 기능을 하도록 만들 수 있다. 저렴한 가격으로 고품질의 상품을 제조하려고 할 경우, 프린팅 방법은 대량 생산에서 선택할 수 있는 매우 훌륭한 생산 방법이다. 본 발명에서 설명하는 전극은 프린팅 기술을 사용하여 제조하기에 매우 적합하기 때문에 시장에서 상당한 경쟁우위를 차지할 수 있게 해 준다.

카본 전극을 루테늄의 전기화학발광이라는 맥락에서 일회용 양극으로 사용할 수 있다는 사실(FI981568 (A), Kulmala, S., et al.)은 이미 알려진 사실이다. 그러나 일회용 카본 양극은 테르븀 킬레이트를 여기시키는데 사용할 수 없다. 이 영역의 전문가는 한쌍의 카본-백금 전극에서 카본 전극을 백금 전극으로 대체하여 최소한 전극들이 서로 거의 동일한 모습일 때(지금까지 우리는 서로 다른 기하학 형태를 경험하지 못했다) 특별하게 작용하는 특별한 전극 시스템을 만들 수 있다는 사실을 상상할 수 없을 것이다. 우리는 아직 전극이 언제 양극이나 음극으로 작용하여 빛을 만들어 내는지 또는 그 반응이 서로 다른 극성에서 생성되는 중간 생성물의 결합된 효과의 결과로 인한 것인지 확실히 알지는 못한다. 실험 결과로 볼 때 최소한 빛의 주요한 부분은 음극에서 생성되는 것으로 보인다.

본 발명은 분산분석 시장에 의미있는 상당히 향상된 측정도구와 방법을 제시하였고 그로 인해 저렴하고 정량적이며 빠른 테스트가 가능해졌다. 상기의 효과는 가장 간단한 형태로 EE셀을 셀 영역을 한정하는 소수성 링에 끼워 사용하거나 보다 복잡한 분석 카트리지의 중요한 구성요소로 사용함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 목적은 생체친화성 분석에서 EE칩의 표면에서 바로 또는 EE칩 장치의 다공성층(다공성 박막)을 이용하여 표지를 여기시키는 방법과 장치이다. 이 방법은 면역화학적 또는 빠른 DNA 탐침 분석에 사용할 수 있다. 이제는 테르븀 킬레이트 외에 일부 다른 표지를 본 발명에서 설명하는 EE칩과 방법으로 여기시키는 것이 가능하다.

본 발명은 주요 부분이 EE칩인 하나의 장치로 이루어진다. EE칩의 전극 표면을 이미 알려진 방법으로 항체나 DNA로 코팅할 수 있으며 코팅에 부착되는 표지분자는 전기펄스로 여기시킬 수 있다. 본 발명에 따라, 전극 부분(또는 전극 부분과 접촉하게 되는 선택사항인 다공성층의 표면)을 랭뮤어-블로드젯막이나 기타 특별한 장점이 있는 쉽게 만들 수 있는 막으로 코팅할 수 있다.

때때로 생체친화성 분석에 다공성 박막을 사용하면 큰 이점이 있다. 다공성층을 이용하여 항체로 코팅된 복잡한 전극에 시료를 균일하게 퍼지게 할 수 있다. 다공성층은 또한 액체의 흐름을 균일하게 하는 컴펜세이터(compensator) 역할을 하고, 미세유체 시스템에서 거품형성, 열발산 및 표면력을 막으며, 미세유체의 미세흐름 셀이나 미세한 층을 이루는 셀 등으로 인해 발생하는 문제들을 제거하는 기능을 하는 것으로 보인다.

본 발명에서 가끔 전극 표면에 사용되는 막(다공성층, 다성성막이라고도함)은 미세다공성과 100μm이 안 되는 얇은 두께가 특징이다. 이런 종류의 재료는 Millipore, MSI, Sartorius, Pall, Sigma, DuPont 등 여러 곳에서 상용으로 구매가 가능하다. 이런 박막은 등방성이거나 이방성일 수 있다. 이런 막을 제조하는 기술에는 여러가지가 있는데, 압착이나 스트레칭 등의 방법이 사용될 수 있다. 구멍은 화학적으로나 물리적으로 형성할 수 있고 비등방성막에서는 상이동을 통해 만들기도 한다. 적합한 재료로는 PTFE, 폴리비닐라이딘 플로오라이드, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 나일론, 셀룰로오스 에스테르 등이 있다. 이런 재료들은 다양한 구멍 크기와 두께 그리고 다양한 물리화학적 특성을 지닌 재품을 상용으로 구매할 수 있다. 사용할 수 있는 섬유 재료로는 섬유 필터, 여과지, 여과포 등이 있다.

제조를 위해서는 EE칩은 건조 상태를 유지하는 것이 가장 좋다. 그리고 장치는 액상 시료나 완충용액을 EE칩이나 칩의 다공성층에 더할 때 정상적으로 작동된다. 따라서 생체친화성 반응에 적합한 조건이 전극에서 직접 또는 박막과 전극 사이에서 형성된다.

본 발명에서 설명한 EE칩을 위해 대신 선택하여 사용할 수 있는 많은 다양한 요소들이 있다. 기본적으로 선택할 수 있는 것은 칩의 전극을 제조하는데 충분한 전도성을 지닌 카본 페이스트를 직접적으로 사용하는 것이다. 그리고 칩은 대개 플라스틱, 종이나 유리로 된 칩이나 조각으로 만들 수 있으며 대개 프린팅 기술로 제조된다.

카본 페이스트의 전도성이 충분하지 않다면, 카본 페이스트 아래에 실버 잉크나 얇은 금속층으로 전도성이 높은 층을 만든 다음 그 위에 카본 페이스트를 넓게 펼쳐 덮을 수 있다. 따라서 카본 페이스트 저항막 내부에서는 먼거리의 전위 강하가 일어나지 않기 때문에 비교적 낮은 전압도 ECL를 생성하기에는 충분하다.

EE칩은 대개 다양한 재료의 최상의 특성을 활용하여 여러가지 기술을 사용하여 진단 카트리지의 일부분에 부착한다. 그 목적은 고분자 등과 주입로나 배출로 및 셀로 이루어진 카트리지의 일부분을 준비하여, 시약을 첨가한 후 드라이 케미스트리(dry chemistry)에 의해 진단 측정에 필요한 모든 작용이 일어나게 하고 사용 중이나 후에 일회용 카트리지가 절대 열리지 않게 하기 위해서이다.

다음으로 다이어그램과 비제한적 실시예와 그 실시예와 관련된 도면을 통해 본 발명에 대해 더 자세히 설명할 것이다.

실시예 1. 셀 영역의 전극 재료가 카본 페이스트로만 이루어진 EE 칩 제작.

도 1에 나타난 한쌍의 전극을 템플릿을 사용하여 10 x 19mm 플라스틱 칩 위에 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)를 칠해서 만들었다. 밀링할 때 세로 0.2mm 가로 0.5mm의 숄더(shoulder)를 칩의 가운데에 남겨두어, 이 숄더를 전극간의 저항으로 사용했다(도 2 (b)). 카본 페이스트가 건조된 후, 그 위에 실버 잉크(Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands)로 한층을 더 칠하여 이 실버층이 거의 셀 영역에 닿게 했다(도 2). 구멍을 뚫은 테프론 테이프(Irpola Oy, Turku, Finland)나 원래 구멍이 뚫린 테이프 조각(도 1에 나타난 둥근 조각과 다른 7mm나 8mm의 사각형 조각으로 가운데에 구멍이 있음)을 도 1에 나타난 것처럼 전극의 왼쪽 끝에 붙여서 셀 영역을 만들었다. Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트와 Tb(III)-N¹-4-이소티오시안산벤질)다이에틸렌트리아만-N¹ ,N² ,N³ ,N³-테트라아세트산 킬레이트를 모두 이 셀에서 여기시켜 시간 분해로 측정할 수 있다. 그러나 실시예 2의 EE 칩으로 상당히 더 높은 강도에 도달할 수 있으나 다른 란탄족 이온의 유사한 킬레이트로는 테르븀보다 매우 강도가 낮다.

실시예 2. 카본 페이스토 덮은 실버 잉크로 하는 EE칩 제작.

도 1에 나타난 한쌍의 전극을 템플릿을 사용하여 10 x 19mm 플라스틱 칩 위에 실버 잉크(Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands)를 칠해서 만들었다. 밀링할 때 세로 0.2mm 가로 0.5mm의 숄더(shoulder)를 칩의 가운데에 남겨두어, 이 숄더를 전극간의 저항으로 사용했다. 실버 잉크가 건조된 후에 (5시간), 그 위를 카폰 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) 층으로 덮고 하룻밤 동안 실온에서 건조되도록 두었다. 구멍을 뚫은 테프론 테이프(Irpola Oy, Turku, Finland)나 원래 구멍이 뚫린 테이프 조각을 도 1에 나타난 것처럼 전극의 왼쪽 끝에 붙여서 셀 영역을 만들었다. Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트의 보정 곡선은 도 3 (a), 흰색 원에 제시되어 있다. 측정 도구는 스탠포드 리서치 SR400 광자계수기, 정전기 펄스 발생기, 퍼킨엘머 CPM(Channel Photomultiplier) 튜브 모듈이 부착된 검은색 플라스틱 전극 챔버로 구성했다. 측정에서 파라미터는 펄스 전압 -67V, 펄스 충전 30μC/펄스, 펄수 주파수 20Hz였다. ECL 강도는 1000 여기 사이클 이상을 기록했고, 지연 시간은 0.05ms, 측정창 6.0 ms였다. 그리고 0.05 M, pH 9.2 사중붕산염 나트륨 완충제를 사용했다.

실시예 3. 카본 페이스트로 종이 위에 EE칩 제작.

처음에 유산지(기름이 배지 않는 종이)를 실버 잉크(Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands)로 코팅한 후에 실버층 위에 카본 페이스트(Creative Materials 1 10-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) 층을 코팅했다. 코팅할 때 탬플릿을 실크스크린 프린트 본으로 사용했다. 카본 페이스트를 실온에서 2시간 동안 건조시킨 후에 도 2 의 베이스에서 사용하기에 알맞게 조각을 종이에서 잘라내었다. 베이스의 숄더 옆 종이 가장자리를 카본 페이스트로 칠하여 실버가 전해질 용액에 직접 닿지 않도록 한다. 마지막으로 그 종이를 양면테이프(3M)로 플라스틱 베이스에 붙이고 셀 영역을 형성하는 테이프 링을 칩에 붙였다.

Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트의 보정 곡선은 도 3 (b), 검은색 원에 제시되어 있다. 측정 파라미터는 실시예 2와 동일했다.

실시예 4. 카본 페이스트 코팅한 금속 호일 조각으로 하는 EE칩 제작.

먼저 10 x 19mm 플라스틱 칩 위에 알루미늄 호일 조각을 접착제로 붙여 하나의 전극쌍을 만들었다. 밀링할 때 칩의 가운데에 세로 0.2mm(세로0.3mm나 0.4mm 도 가능) 가로 0.5mm의 숄더(shoulder)를 남겨두어 전극간의 저항 역할을 하도록 했다(도 1). 알루미늄 호일 조각들을 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)로 코팅하되 오른쪽 가장자리에 스프링이 장착된 스터드/핀(칩을 장치의 펄스 발생기에 고정시켜줌)의 접촉 부분은 코팅에 덮이지 않도록 드러난 채 두었다. 구멍을 뚫은 테프론 테이프(Irpola Oy, Turku, Finland) 조각이나 원래 구멍이 뚫린 테이프 조각을 도 1처럼 전극의 왼쪽 끝에 붙여서 셀 영역을 만들었다. Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트의 보정 곡선은 도 3 (c), 검은색 사각형에 제시되어 있다. 실시예 8에서처럼 유사한 전극을 알루미늄판을 이용하여 증착법으로 만들 수도 있다. 측정 파라미터는 실시예 2와 동일했다.

실시예 5. 카본 페이스트 덮은 상용으로 구입가능한 금속 스티커로 하는 EE칩 제작.

먼저 10 x 19mm 플라스틱 칩 위에 구리 폴리오 스티커(Screen House, Turku, Finland)를 자체 접착력으로 붙여 전극쌍을 만들었다. 밀링할 때 조각의 가운데에 세로 0.3mm, 가로 0.5mm의 숄더(shoulder)를 남겨두어 전극간의 저항 역할을 하도록 했다(도 1). 그리 폴리오 조각들을 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)로 코팅하되 조각 오른쪽 가장자리의 펄스 발생기에 대한 스프링이 장착된 핀의 접촉 부분은 칠하지 않고 그대로 두었다. 구멍을 뚫은 테프론 테이프(Irpola Oy, Turku, Finland) 저각나 원래 구멍이 뚫린 테이프 조각을 도 1처럼 전극의 왼쪽 끝에 붙여서 셀 영역을 만들었다. Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트의 보정 곡선은 도 3 (d), 검은색 원에 제시되어 있다. 실시예 8에서처럼 유사한 전극을 알루미늄판을 이용하여 증착법으로 만들 수도 있다. 측정 파라미터는 실시예 2와 동일했다.

실시예 6. ECL강도에 미치는 과황산염(persulfate)의 영향

먼저 실시예 2의 방법으로 충분한 양의 EE칩을 만들었다. 전기화학발광에 미치는 여러가지 첨가물의 영향을 연구할 때 황산화염을 첨가하면 전기화학발광이 증가한다는 것을 알게 되었다. 이것은 아마도 황산 라디칼(sulfate radical)을 생성하는 과정에서 과황산염이 감소되었다는 것을 의미하는 것이다. 황산 라디칼은 수용액의 Tb(III) 이온과 킬레이트로부터 화학발광을 일으키는 것으로 알려져 있다(S. Kulmala et al., Anal. Chim. Acta 294 (1994) 13-25.).

신호 강도에 미치는 과황산칼륨 농도의 영향을 더 연구했을 때, 과황산염의 농도를 증가시키면 Tb(III) 킬레이트 (1 x 10⁶ M Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐)의 ECL의 강도를 크게 강화시킨다는 사실이 연구한 농도 범위 전체를 통해 밝혀졌다.

강도의 증가는 과황산칼륨의 최대 용해량(약 50 mM)에 이르기까지 계속 증가할 수 있으며 과황산 나트륨을 사용하면 더 높은 농도에 이르는 것도 가능하다. 측정 파라미터는 실시예 2와 동일했다.

실시예 7. 산과 염기 처리의 영향.

전극의 안정성을 산성 조건와 염기성 조건에서 연구했을 때 전극을 염기성 조건 하에서 사용했을 때 성능이 더 낫다는 것을 발견했다. 이러한 발견 때문에 실시예 2에서 설명한 과정으로 만든 EE칩을 1M NaOH 용액, 1M H₂SO₄ 용액, 1M HC1 용액에 15분 동안 처리하여 서로 비교했다. 처리 후에 전극을 증류수로 세척한 후 1μΜ Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트를 사용하여 측정했다. 측정 파라미터는 실시예 2와 동일했다. 아래에 제시된 측정 결과에서 보듯이 산성 처리와 염기성 처리했을 때 두 경우 모두 분명히 전극의 효율이 향상되었다.

1 μM Tb(III) 킬레이트	ECL 강도 / 광자
	무처리	1M NaOH로 처리	1M H2SO4 로 처리	1M HCl로 처리
측정	337532	956184	697300	538215
반복측정	317307	921739	615300	481643

실시예 8. PDMS 칩과 전체 하나의 셀로 만든 EE칩을 이용한 면역분석.

PDMS 칩을 패트리 접시 형태를 이용하여 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머(경화제 1 : 10)로 몰딩하여 만들었다. 젖은 상태의 PDMS을 진공상태에서 가스를 제거하고 50°C에서 2시간 동안 굳혔다. 응고된 PDMS를 형틀에서 분리하고 조각으로 잘랐다.

PDMS은 왼쪽 가장자리에 시료와 시약 공급 챔버(도 5의 6번 부분)가 있는데 분석 전에는 생체친화성 분석을 위해 시약을 말려야 한다. 이 시료 주입 챔버는 미세관(도 3의 7번 부분)을 통해 인큐베이션 챔버 및 측정 챔버(도 5의 5번 부분)과 연결된다. 모세관압과 유체정압에 의해 액체가 인큐베이션/측정 챔버로 이동하는 동안 챔버의 공기는 미세관(도 5와 8번 부분)을 통해 배출되었다. 인큐베이션/측정 챔버에는 PDMS 칩의 챔버를 일정한 크기로 유지하고 압착되지 않도록 작은 기둥들이 있다. 인큐베이션/측정 챔버의 높이는 0.35mm이고 용량은 ca.15 μL이며 PDMS 칩의 전체 두께는 5mm였다.

먼저 유리칩의 위쪽 표면(19.0mm x 10.0mm)을 플라스마로 간단히 처리했다. 다음으로 ca.0.3mm 두께의 알루미늄 층을 마스크 아래에 부착된 유리칩의 마스크를 통해 진공증착했다. 칩의 두 개의 전극(도 1의 2와 3)을 모두 만들었다. 그런 다음 알루미늄 전극들을 완전히 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)로 코팅하되 조각 오른쪽 가장자리의 펄스 발생기에 대한 스프링이 장착된 핀의 접촉 부분은 칠하지 않고 그대로 두었다.

인간 TSH를 모델 분석물질로 채용했다. 안티-TSH (MOAB, lot: M-21310, catalogue number MIT0406, cone. 6.87 mg/mL; Medix Inc, USA)를 달라붙게 하는 α-서브유닛을 일차(포획)항체로 사용하고 이차(표지)항체로는 안티-TSH (clone 5404, lot SPC099, cone. 5.5 mg/mL, Medix Biochemica Oy Ab, Finland) 특정적 β-서브유닛을 사용했다. hTSH의 보정기준은 Wallac의 농축 원액(DELFIA hTSH kit, 324 mlU/mL TSH)을 희석하여 사용했다.

Tb킬레이트(Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트)의 이소티오시아네이트 유도체를 80배 과잉 몰(molar excess)에서 항체와 반응하도록 하여 표지된 이차 항체(안티-hTSH, 클론 5404, 5.5mg/mL, Medix Biochemica Oy Ab)를 만들었다. 하룻밤 동안 pH 9.5에서 반응이 진행되도록 두었다. 표지된 항체를 직경이 1cm이고 52cm 세파오로스 6B의 위에 5.5cm 세파덱츠 G-50가 들어있는 원통에서 분리했다.

카본 페이스트가 건조되고 나서 아래의 방법을 따라 EE칩의 측정 셀 영역에서 테이프로 만든 웰에서 항체를 코팅했다:

150μL의 용액에는 30 μg/mL의 포획항체(0.1M MES, 0.2 M 붕산염, 0.025% 보바인 감마글로불린 pH 6.5)가 포함된 150μL의 용액을 인큐베이션 웰에 더하고 스텐드 아래 바닥에 아지드를 함유한 물이 있는 닫힌 플라스틱 상자에서 3시간 동안 두었다. 코팅 후에 셀 영역을 세척용액(0.05M Tris-H₂SO₄ 완충제, pH 7.75, 0.1% 보바인 알부민, 0.1% 트윈 20, 0.1% NaN₃)으로 세척했다.

다음으로 PDMS 칩(25 mm x 14 mm, 5 mm 두께; 도 5의 4번 부분)을 클램프로 EE칩에 부착시키는데 이때 서로 알맞게 단단하게 눌리도록 했다. 그런 다음 20 μL의 용액을 PDMS-EE 카트리지의 왼쪽 가장자리에 위치한 시료 유입 챔버(도 5의 6번 부분)에 추가했다. 용액에는 0.05M Tris-H₂SO₄ 완충제(pH 7.75, 0.1% 보바인 알부민, 0.1% 트윈 20, 0.1% NaN₃)에 100ng의 표지된 이차항체가 포함되었다.

0.2M 사중붕산염 완충제(H₂SO₄ 로 pH7.8로 조정, 0.5% 보바인 알부민 0.05% 보바인 감마글로불린, 0.01% 트윈 20, 0.1% NaN₃)를 면역분석 및 측정 완중제로 사용했다. 처음에 25μL의 hTSH 표준물질을 175μL의 면역분석/측정 완충제에 추가했다. 이 혼합물을 시료 주입 챔버(도 5의 6번 부분)에 피펫으로 넣으며 주입 챔버에서는 표지가 이미 건조된 형태로 있었다. 시료가 표지를 녹였고 그 혼합물이 모세관압과 유체정압에 의해 미세관(도 5의 7번 부분)을 통해 인큐베이션/측정 챔버(도 5의 5번 부분)로 이동하는 동안 셀의 공기는 다른 미세관(도 5의 8번 부분)을 통해 배출되었다.

15분의 인큐베이션 후에, ECL강도를 측정기기를 사용하여 각 PDMS-EE 카트리지에서 측정했다. 이때 사용된 측정기기는 시험실에서 만든 정전기 펄스 발생기, 스탠포드 리서치 도구SR400 광자계수기, 뉴클리어스 MCS-II 멀티체널 카드, 검은 플라스틱으로 만든 닫힌 셀 측정 스페이스, 퍼킨 엘머 CPM(Channel Photomultiplier)으로 구성되었다.펄스 진폭은 -6-45V, 펄스 충전은 15 μC/펄스, 펄스 주파수는 20Hz였다. ECL 강도는 200 여기 사이클 이상을 기록했고, 지연 시간은 0.05ms, 측정창 6.0 ms였다. 측정 결과는 도 6에 제시되어 있다.

실시예 9. EE칩에서의 하이브리드화 분석

EE칩을 실시예 6에서와 동일한 방식으로 증착 알루미늄으로 만들었다. 칩의 셀 영역은 실시예 1에서와 동일한 방식으로 테이프로 만들었다.

측정된 서열은 120 뉴클레오티드 파편으로서 인간의 내장 및 리노바이러스에 공통적으로 존재한다. 이 파편을 RT-PCR(Lonnrot et al., J. Med. Vir. 56 (1999) 378-84.)로 복제했다. 이 서열은 내장 및 리노바이러스를 측정하는 중앙집중식 진단 시험소에서 일상적으로 측정된다.

측정되는 서열의 5' 엔드에 대한 보완물인 탐침 1(TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-AA-C₆-NH₂; MedProbe AB, Sweden)을 카본 페이스트 전극에 코팅했다. 코팅을 위해, (APTES) 아미노 그룹을 산화층으로 덮인 전극에 실란화를 통해 (3-아미노프로필) 트라이에톡시실레인과함께 첨가하였다. 폴리에이테일(poly-A tail), 식스 카본 알리파틱 카본 체인(six-carbon aliphatic carbon chain), 엔딩 아미노 그룹(ending amino group)을 탐침 1의 3' 엔드에 첨가했다. 마지막 공유결합(covalent bonding)은 생산자의 지시에 따라 DSS 이중 시약(disuccinimidyl suberate) 으로 이루어졌다.

두 번째 탐침 "탐침 2"(NH2)4-GA-AAC-ACG-GAC-ACC-CAA-AGT-A)는 탐침을 0.5 M 탄산나트룸 완충제(pH 9.5)의 80배 과잉 킬레이트와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하여 Tb킬레이트(Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트)의 이소티오시아네이트 유도체로 표지했다. 인큐베이션 후에 표지된 탐침을 세파덱스 G50 칼럼(NAP-5 column, GE Healthcare)으로 세척했다.

하이브리드화는 다음과 같은 방법으로 실시했다. RT-PCR 증식DNA 시료(20 μL, 1 :50, 1 : 100 and 1 : 1000 희석)에 180 μL, NaOH (50 mmol/L)을 첨가하여 변성시키고 37°C에서 5분간 인큐베이션했다. 그런 다음 이 시료에 200μL의 중성완충제(6 x SSC, 0.3% 트윈 20, 20 mmol/L 구연산)를 첨가하여 중화시켰다. 10μL의 중화된 시료와 10μL표지된 탐침 2(0.6 ng/μL, 50 mmol/L Tris-HCl 완충제 pH 7.8, 600 mmol/L NaCl, 1% 트리톤 X 100과 1% 블로킹 시약(Roche))을 새로운 하나의 시험관으로 옮겼다. 혼합 후에 테스트 스트립의 박막 부분에 3.5μL의 혼합물을 피펫으로 떨어뜨렸다. 하이브리드화(5분) 후에, 실리콘 전극에서 박막을 떼어내고 EE 칩을 3회 세척한 후 ECL을 측정했다. 시료 희석 그래프는 도 7에 제시되어 있다. 측정 파라미터는 실시예 8과 동일했다.

실시예 10. 하나의 EE 칩에서의 두 가지 면역분석물질의 동시 측정.

C-반응성 단백질(CRP)과 갑상샘 자극 호르몬(TSH)을 동시에 측정하기 위해 전극 중 하나의 전극을 CRP 포획항체로 코팅하고 다른 전극은 TSH 포획항체로 코팅했다.

EE 칩의 전극을 테이프로 만든 직사각형 웰에서 포획항체로 코팅했다. 테이프에 템플릿을 이용하여 메스로 직사각형 구멍을 만들었다. 각 웰이 도 1에서처럼 둥근 구멍이 있는 다른 테이프를 추가하여 전처리하여 만든 칩의 끝에 있는 최종적인 둥근 셀 영역 보다 약간 더 큰 대응 전극 영역을 덮었다.

테이프 웰의 각 전극에 두 항체를 모두 동시에 코팅했다. 0.1 M MES, 0.03M H₃BO₃, 0.5 mM 구연산칼륨, 0.025% 글루타르알데히드, 0.05% 보바인 감마글로불린이 포함된 용액에서 실온에서 2시간 동안 항체(25μg/mL, 150μL)를 인큐베이션하여 전극에 안티-hTSH (안티-hTSH, MIT0406, Medix Biotech Inc., USA)을 코팅했다. 인큐베이션 후에 테이프 웰을 세척용액(0.9% NaCl, 0.09% NaN₃, 0.05% 트윈 20이 함유된 50 mM Tris-HCl 완충제 pH7.8)으로 3회 세척했다. 세척한 후에, 테이프 웰에서 30분 동안 포화용액(0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.1% BSA, 6% D-솔비톨이 함유된 50 mM Tris-HCl pH 7.8)에 인큐베이션하여 코팅한 전극을 적셨다. 전극을 적신 후, 전극 영역에서 테이프 웰을 제거(안티 CRP 코팅에서 하나를 동시에)하고 EE 칩을 30°C에서 2.5시간 동안 건조시켰다.

유사한 방식으로 항체(20 μg/mL, 150 μL)를 2시간 동안 실온에서 50 mM Tris-HCl 완충제(pH 7.8, 0.05% NaN₃와 0.9% NaCl함유)로 인큐베이션하여 안티-CRP을 코팅했다. 인큐베이션 후에 테이프 웰을 세척용액(50 mM Tris-HCl 완충제 pH7.8, 0.9% NaCl, 0.09% NaN3, 0.05% 트윈 20 함유)으로 3회 세척했다. 세척한 후에, 테이프 웰에서 30분 동안 포화용액(0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.1% BSA, 6% D-솔비톨, 1mM CaCl₂이 함유된 50mM Tris-HCl pH 7.8)에 인큐베이션하여 코팅한 전극을 적셨다. 전극을 적신 후, 전극 영역에서 테이프 웰을 제거(안티 TSH 코팅 단계에서 하나를 동시에)하고 EE 칩을 30°C에서 2.5시간 동안 건조시켰다.

표지된 항체를 다음과 같은 방법으로 박막에서 건조시켰다. Tb(III) 킬레이트(Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐)로 표지한 안티-hCRP항체(74 μg/mL, Medix Biochemica Oy Ab 안티-hCRP 클론 6404)와 동일한 Tb(III)로 표지한 안티-hTSH 항체(80 μg/mL, 클론 5404, Medix Biochemica Oy Ab)를 50mM Tris-HCl 완충제(pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 0.05% 보바인 감마글로불린, 0,01% 트윈 20, 1mM CaCl₂*H₂O)에 용해시켰다. 항체-완충제 0.5μL를 박막(10 x 10 mm, Nuclepore Membrane 112110, Whatman)에 피펫으로 떨어뜨린 후, 실온의 실내 공기에서 하룻밤 동안 건조시켰다.

시험관에서 CRP 표준용액(Scripps, cat.no.C0124)을 50mM Tris-HCl 완충제(pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 1mM CaCl₂*H₂O)로 희석하여 면역분석(CRP 내용물 1, 10, 100 ng/mL)에 필요한 hCRP 표준시료를 만들었다. 유사하게 TSH 표준물질(324 mlU/mL, Wallac, DELFIA hTSH kit)을 50mM Tris-HCl 완충제(pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl)로 희석하여 TSH 표준시료(1, 10, 100 mlU/mL)를 만들었다.

면역분석을 실시하고 처음에 EE 칩과 다공성 박막을 건조시켰다. EE 칩의 셀 영역을 한정하는 테이프 웰의 위를 박막으로 정확하게 덮고 다른 쪽 끝은 제자리에서 움직이지 않도록 테이프로 고정했다. 다공성막의 가운데에 두 표준 분석물질 3.5μL을 더하여 분석을 시작했다(CRP 0 ng/mL와 TSH 0 mlU/mL, CRP 1 ng/mL와 TSH 1 mlU/mL, CRP 10 ng/mL와 TSH 10 mlU/mL, CRP 100 ng/mL와 TSH 100 mlU/mL). 실온에서 10분간 인큐베이션한 후, 박막을 제거하고 EE 칩의 셀 영역을 80μL의 측정 완충제(0.05 M Na₂B₄O₇ and 2xl0^-4 M K₂S₂O₈)로 세척했다. 두 분석물질을 측정하였다. 측정에서 먼저 안티-TSH 전극을 음극으로 하여 10회의 여기 주기를 측정한 다음, 극성을 변화시켜 다른 10회의 주기를 위해서 안티-CRP 전극을 양극으로 하여 측정했다. 측정을 5회 반복하여 두 전극의 신호의 합계를 내었다. 측정결과에서 TSH 반응을 왼쪽 전극에서 받았기 때문에 빛은 주로 음극에서 발생하며, 설사 이런 특정한 혼함물, TSH과 CRP을 동시에 측정하는 것이 항상 민감하지는 않다해도 그러한 이중 분석은 쓸모가 있는 것으로 결론을 내렸다. 측정 결과는 도 8에 제시했으며 파라미터는 실시예 8과 동일했다.

Claims (10)

1. 전해질 용액에서 란탄족 킬레이트를 전기적으로 여기시키는 방법에 있어서,
   상기 여기는 카본 페이스트로 제조된 두 개의 전극들로 구성되는 전극 칩에서 1나노초와 1000초 사이의 시간, 0.001Hz-1200Hz 사이의 주파수, 1V-400V 사이의 진폭을 가지는 전압 펄스로 수행되고, 상기 두 개의 전극들 모두는 양극 또는 음극으로 사용될 수 있고, 상기 란탄족 킬레이트는 음극 전극에서 여기되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 전극들의 극성은 측정 동안 최소한 한번 바뀌는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 란탄족 킬레이트는 Tb(III) 킬레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 카본 페이스트 전극들은 프린팅 기술에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 카본 페이스트 전극들은 실버 잉크 위에 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
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