JP2009222636A - 生体物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことの出来る生体物質の測定方法を提供する。
【解決手段】対極と抗体が固定された作用極とを持つ容器に生体サンプルが含まれる第１の溶液を添加し、目的となる生体物質を電極上に集積する集積工程と、前記容器に電気化学発光物質（金属錯体）により標識された抗体を含む第２の溶液を添加し、抗体と生体物質と標識抗体とが複合体を形成する複合体形成工程と、前記作用極と前記対極との間に前記電気化学発光物質（金属錯体）を発光させるための電圧を加え、前記電気化学発光物質（金属錯体）の発光量を測定する測定工程と、を備えた生体物質の測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、蛋白質やペプチドのような生体物質を測定する方法に関するものである。より詳細には、電気化学発光を用いた免疫測定の技術に関する。

現在、臨床診断、食品衛生、環境衛生等の多岐にわたる方面で、目的となる特定物質の分析や検査が行われている。

前記分析や検査に利用される測定法には、化学反応を利用した測定系が多く用いられている。代表的な例としては、目的となる特定物質に対して特異的に結合する酵素標識した物質を反応させ複合体を形成し、その標識酵素と該酵素の基質となる物質との反応により該標識酵素活性を測定し、目的となる特定物質を検出や定量する酵素免疫学的測定（ＥＩＡ）系があげられる。

このような測定系に使用される試薬の成分として、酵素や抗体や抗原等の蛋白質成分が多く挙げられる。このような蛋白質成分は、一般的に、温度、光、ｐＨ、酸化等の外的因子により、容易にその機能を失ってしまう。そのため、測定の正確性や精度を高めるために、蛋白質を含む試薬を安定化させておく必要がある。

これまでに、蛋白質成分が機能を失うことを抑制し、測定の正確性、精度を高めるための方法がいくつか報告されている。このひとつにアミノ酸エステル及び／又はポリアミンを凝集抑制剤として利用する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。

一方、従来の電気化学発光を用いた免疫測定の技術では、目的となる特定物質の測定は、酵素標識の変わりに電気化学発光物質（金属錯体）を標識し、生体反応を行ったのち、電気化学発光させて測定する。

標識に利用する電気化学発光物質（金属錯体）は電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質であり、標識電気化学発光物質（金属錯体）によって放出された電気化学発光量の測定によって、目的となる特定物質に結合した標識電気化学発光物質（金属錯体）の存在を検出することができる。この発光は可視光領域にピーク波長を有するものであり、光電子増倍管等の光検出器で検出可能である。したがって、結合した電気化学発光物質（金属錯体）の量を正確に定量することができる。

前記のような電気化学発光物質（金属錯体）は酸化される時に還元剤となる物質が必要であり、還元剤となりうる物質には、アミンまたはアミン部分を持つ化合物があげられる。すなわち、電気化学発光量の測定には還元剤を緩衝液中に添加しておく必要がある。

しかしながら、前述したように、多くの生物学的な分析や検査に応用するためにはｐＨのような生理学的溶液条件を要求される。このため、生理的ｐＨで目的とする特定物質の検出や定量を行うのに適した還元剤を選ぶ必要がある（例えば、特許文献２および３参照。）。
特開２００４−１０８８５０号公報 特表平６−５０９４１２号公報 特表平４−５０２９６４号公報

しかしながら、前記従来の構成では、生体反応に利用する凝集抑制剤と、電気化学発光に利用する還元剤とが別の物質であるため、生体反応用の溶液と測定用の溶液とを入れ替える必要があった。そのため、生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことができないという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことの出来る生体物質の測定方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の生体物質の測定方法は、対極と抗体が固定された作用極とを持つ容器に生体サンプルが含まれる第１の溶液を添加し、目的となる生体物質を電極上に集積する集積工程と、前記容器に電気化学発光物質（金属錯体）により標識された抗体を含む第２の溶液を添加し、抗体と生体物質と標識抗体とが複合体を形成する複合体形成工程と、前記作用極と前記対極との間に前記電気化学発光物質（金属錯体）を発光させるための電圧を加え、前記電気化学発光物質（金属錯体）の発光量を測定する測定工程と、を備えたことを特徴としたものである。

本発明の生体物質の測定方法によれば、蛋白質成分を含む試薬の安定性を損なうことなく生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことができる。

以下に、本発明の生体物質の測定方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。なお以下の実施の形態における生体サンプルとは、例えば、血液、髄液、血清、血漿、尿、鼻汁、唾液、皮膚などが挙げられるが、この限りではない。

（実施の形態１）
以下の実施の形態では、請求項に記載した第１の溶液と第２の溶液とをそれぞれ検体反応溶液と検体測定溶液とする。対極と抗体が固定された作用極とを持つ容器を反応容器とする。容器とは、免疫反応を行うための液だめがあり、底面に作用極とその周囲に対極を有しているものであり、さらに電気化学発光を検出するための光透過性の検出部があればよい。これらの作用極上に抗体を固定化することにより反応容器を作成する。なお、作用極上への抗体の固定様式は、直接固定してもよいし、微粒子に固定し作用極上に展開することにより固定してもよい。作用極と対極の電極パターンとしては、例えば市販品であるＢＡＳ株式会社のリングディスク電極や有限会社バイオデバイステクノロジーのＤＥＰ−Ｃｈｉｐでも良い。本発明に用いられる対極と作用極とは、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭化物や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物や、Ｓｉ、Ｇｅ、 ＺｎＯ、 ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体等が挙げられる。

まず、集積工程では、反応容器に生体サンプルが含まれる検体反応溶液を添加し、目的となる物質を作用極上に集積させる。

作用極上に固定した抗体は、生体サンプル内に含まれる目的となる特定物質を特異的に捕捉する性質を有している。そのため、目的となる特定物質を含む検体反応溶液を反応容器に添加すると、固定した抗体が目的となる特定物質を捕捉し、作用極上に目的となる特定物質を集積させる。

検体反応溶液は、ｐＨ６〜８の範囲を緩衝できる通常使用される緩衝液類を使用できる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられるが、この限りではない。その他、蛋白質成分の凝集や非特異吸着を抑制するためポリアミン類や界面活性剤を添加してもよい。

次に、複合体形成工程では、集積工程で目的となる特定物質を作用極上に集積した反応容器に電気化学発光物質（金属錯体）により標識された標識抗体を含む検体測定溶液を添加し、免疫複合体を形成させる。

本発明の特徴は検体測定溶液に、凝集抑制および還元剤として働くポリアミン類を添加することにある。なお、検体測定溶液は、検体反応溶液同様にｐＨ６〜８の範囲を緩衝できる通常使用される緩衝液類を使用できる。その他、非特異吸着を防止するため界面活性剤を添加してもよい。

前記ポリアミンとして、生体内ポリアミンまたは人工的に得られる生体内ポリアミン誘導体が挙げられ、より具体的には、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、イミノビスプロピルアミン 、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノブチルカダベリン、ノルスペルミン 、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ’ − ビス（ アミノプロピル） カダベリン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミンあるいはそれらの誘導体が挙げられる。

また、前記標識抗体は、電気化学発光物質（金属錯体）により標識され、かつ目的となる特定物質を特異的に捕捉する性質を有しているため作用極上に捕捉された目的となる特定物質に結合し免疫複合体を形成する。

本発明に用いられる電気化学発光物質（金属錯体）とは、電気化学発光が検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、酸化還元反応時に可視光領域にピーク波長をもつ電気化学発光を生じる化合物が挙げられる。このような酸化還元反応時に電気化学発光を生じる化合物としては、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体があり、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができる。特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。

さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有している。このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。

かかる電気化学発光物質（金属錯体）は抗体に直接または一つもしくはそれ以上の分子を介して連結されている。電気化学発光物質（金属錯体）が一つもしくはそれ以上の分子を介して連結される場合の結合形式は周知であり、例えば、蛋白質Ａや蛋白質Ｇ、アビジン／ビオチンなどが挙げられる。

測定工程とは、前記免疫複合体を検出するため、前記作用極と前記対極との間に前記電気化学発光物質（金属錯体）を発光させる電圧を加え前記電気化学発光物質（金属錯体）の発光量を測定する工程である。

電圧の印加は、電極配置パターン及び前記検体測定溶液である緩衝液の種類など系によって様々であるが、本実施の形態では１秒かけて０Ｖから３．５Ｖまでリニアに電圧を上げ、その後５秒かけて３．５Ｖから０Ｖにリニアに電圧を下げ電気化学測定を行う。電気化学発光量の測定には、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定する。

電圧印加の方法として、実施の形態１においては、直流電源を用い電極間に直流電圧を投入しているが、新たに参照電極を設け３電極法にてポテンシオスタットを用い印加する方法でもよい。

以上のように、実施の形態１においては検体測定溶液としてポリアミンを含む緩衝液を用いることにより、凝集抑制作用と還元作用を同一の物質が行うようになり生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことができる。

また、実施の形態１では、還元剤をポリアミンとしたことにより測定条件下においても蛋白質の安定効果が期待でき、より測定の正確性や精度を高めた測定ができる。

次に、本発明の具体的な実施例としてＴＮＦ−αの検出の方法を説明する。本実施例では電気化学発光物質（金属錯体）としてルテニウム錯体、ポリアミンとしてスペルミンを用いた。但し、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

図１に本発明の実施例における反応容器の図を示す。図１（ａ）に反応容器の側面図を、図１（ｂ）に反応容器作成前の電極プレート、シリコンシートおよびカバーガラスの斜視図を示す。図１（ａ）および（ｂ）の１は電極プレート、２はシリコンシート、３はカバーガラスである。図１（ｃ）に電極プレート１のパターン図を示す。図１（ｃ）の４は作用極、５は対極である。

図２に本発明の実施例における電極上で形成された免疫複合体形成のモデル図を示す。図２の６は作用極４上に固定された第１の抗ＴＮＦ−α抗体であり、７がＴＮＦ−αである。８は電圧印加により発光する特性を持つルテニウム錯体を修飾した第２の抗ＴＮＦ−α抗体となる。

さて、図１に示した本実施例の電極プレート１は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで作製した。電極プレート１の作用極４上に、リン酸緩衝液にけん濁した抗体６を添加し、物理吸着により固定化した。抗体６の濃度は７０ｍｇ／ｍｌとし、作用極以外の部分はマスクして固定化した。固定後、純水により、固定されていない抗体６を洗浄した。次に前記電極プレート１上に中央部がカットされた厚さ１ｍｍのシリコンシート２およびφ２ｍｍ穴のサンプル注入口が設けられたカバーガラス３を設置することで反応容器を作成した。さらに、上記容器は、非特異吸着を抑えるための処理を施した。

次に、ＴＮＦ−α７を０、１０，１００，１０００ｐＭの濃度になるよう１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にけん濁しそれぞれを上記容器に添加した。添加後、室温にて約２時間静置し、界面活性剤を含む洗浄水により、抗体６に結合しなかったＴＮＦ−α７を除去した。

洗浄後、ルテニウム錯体標識抗体８を下記緩衝液にけん濁して上記容器に添加し、室温にて約２時間静置した。使用した緩衝液は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ５０ｍＭスペルミンから成る。

２時間経過後、作用極４と一方の対極５との間に０Ｖから３．５Ｖまで走査し、５秒かけて３．５Ｖから０Ｖに電圧を下げ、最大発光量を測定した。電気化学発光量の測定には、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。表１に本実施の形態に方法（本発明測定）と従来の方法で測定した場合（従来測定）との測定結果を示す。

ＴＮＦ−αが存在する場合には、図２に示すような免疫複合体形成反応が起こるが、ＴＮＦ−αが存在しない場合には、ルテニウム錯体標識抗体８が結合できず複合体は形成されない。したがって、電気化学発光量は、サンプル中に存在するＴＮＦ−αの濃度に依存して増加する。表１に示すように、本発明による方法においても、従来の方法で測定した場合と同等の効果があることが分かる。

本発明にかかる生体物質の測定方法は、生体反応から電気化学発光までの工程を連続して行うことのできる効果を有し、蛋白質成分を含む試薬の安定性を損なうことなく、臨床診断、食品衛生、環境衛生等の多岐にわたる方面で、目的となる特定物質の精度の良い分析や検査等の用途に適用できる。

本発明の実施例における反応容器の図 本発明の実施例における電極上で形成された免疫複合体形成のモデル図

符号の説明

１ 電極プレート
２ シリコンシート
３ カバーガラス
４ 作用極
５ 対極
６ 第１の抗ＴＮＦ−α抗体
７ ＴＮＦ−α
８ ルテニウム錯体標識の第２の抗ＴＮＦ−α抗体

Claims (5)

1. 対極と抗体が固定された作用極とを持つ容器に生体サンプルが含まれる第１の溶液を添加し、目的となる生体物質を電極上に集積する集積工程と、
   前記容器に電気化学発光物質（金属錯体）により標識された抗体を含む第２の溶液を添加し、抗体と生体物質と標識抗体とが複合体を形成する複合体形成工程と、
   前記作用極と前記対極との間に前記電気化学発光物質（金属錯体）を発光させるための電圧を加え、前記電気化学発光物質（金属錯体）の発光量を測定する測定工程と、を備えた生体物質の測定方法。
2. 前記生体サンプルは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトの生体から採取される組織または液状物である請求項１に記載の生体物質の測定方法。
3. 前記第２の溶液は、緩衝液とポリアミン化合物とからなる請求項１に記載の生体物質の測定方法。
4. 前記緩衝液は、ｐＨ６〜８の範囲を緩衝できるものである請求項３に記載の生体物質の測定方法。
5. 前記ポリアミン化合物は、以下の一般式（化１）で表されるアルキレンポリアミンである請求項３に記載の生体物質の測定方法。
   

   

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