CN104502593B - 一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法，属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本发明首先在二氧化钛纳米颗粒基底上，利用光电化学合成方法，直接在电极上合成了二氧化钛-贵金属复合材料，进而制得了成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测胃癌肿瘤标志物的电化学无标记免疫传感器。

Description

一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测胃癌肿瘤标志物的电化学无标记免疫传感器的制备方法。属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。
背景技术
电化学免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床分析和环境检测领域，一般可分为有标记和无标记两种，由于标记物的特性，前者比后者对检测环境要求更严格，操作也相对繁琐，因此无标记电化学免疫传感器具有更广阔的应用前景。构建无标记电化学免疫传感器，关键的技术是提高修饰电极对抗体的固定量和对测试底液的信号响应速度和大小。二氧化钛纳米粒子TiO2 NPs是一种光敏材料，在光照条件下，会导致电子-空穴对进行分离，进而具有一定的氧化还原性。本发明，利用TiO2 NPs的这一特性，直接在电极上实现了核壳结构的金银钯合金纳米棒材料AuAg-Pd NDRs，使之与TiO2 NPs的复合材料共同修饰的电极，一方面增加了电极比表面积，增强电极导电能力，另一方面二者可以产生协同催化作用，更大的增强对过氧化氢溶液H2O2的催化响应速度和电流响应信号大小。由此，成功的发明了无标记电化学免疫传感器的制备方法。
胃癌肿瘤标志物的检测可反映胃癌的生物学特性，对胃癌患者的早期发现、临床治疗及诊断的具有重要意义。目前，检测胃癌肿瘤标志物的方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、气相色谱-质谱联用法等。这些方法操作复杂，而且化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发灵敏度高、特异性强、检测速度快的胃癌肿瘤标志物传感器具有重要意义。
应用电化学免疫传感器检测胃癌肿瘤标志物的研究正处于上升态势，但一般都需要对电极进行多层修饰，操作相对繁琐。因此，开发一种既制备简单、又能快速灵敏检测胃癌肿瘤标志物的无标记电化学免疫传感器，将具有广阔的应用前景和重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强的可用于胃癌肿瘤标志物检测的电化学无标记免疫传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于胃癌肿瘤标志物的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明先后使用二氧化钛纳米粒子溶胶TiO2 NPs和金银纳米棒溶胶AuAg NRs对电极进行修饰，然后利用光电化学合成方法，在电极上直接快速地制备了AuAg-Pd NDRs，为更好的形成增强电极的电子响应速度和稳定性等性能，在电极上滴加硫堇溶液TH和壳聚糖溶液CHS并成膜，利用EDC/NHS的交联作用固定胃癌肿瘤标志物抗体，在进行检测时，利用抗体与抗原的特异性定量结合，使得电极对H2O2的电流响应信号相应降低，从而实现了采用无标记的电化学方法检测胃癌肿瘤标志物的免疫传感器的构建。
本发明采用的技术方案如下：
1. 一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为：
（1）以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5~10 uL 二氧化钛纳米粒子溶胶TiO2 NPs，室温下晾干后，滴涂5~10 μL的金银纳米棒溶胶AuAg NRs，并在室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂5~10uL 0.01 mol/L 的氯钯酸溶液H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射30~90秒，制得TiO2 NPs负载的金银钯合金纳米棒材料AuAg-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，表面滴涂5~10 uL硫堇溶液TH，室温下晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用超纯水清洗，表面滴涂5~10 uL壳聚糖溶液CHS，室温下晾干；
（5）将步骤（4）中得到的电极用超纯水清洗后，将电极浸入到EDC/NHS溶液中，1小时后取出；
（5）在电极表面滴涂5~10 μL 10 μg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（6）将步骤（5）中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5~10μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 ℃ 冰箱中晾干成膜，制得电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器；
所述的TiO2 NPs为1mg/mL 的二氧化钛纳米粒子水溶液；
所述的AuAg NRs为金银核壳纳米棒与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金银核壳纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以银纳米粒子为壳层的核壳结构的棒状纳米粒子，所述棒状纳米粒子的长度为20~50nm；
所述的H2PdCl4为pH值为1~2的氯钯酸水溶液；
所述的AuAg-Pd NDRs 为金银钯合金纳米棒，所述的金银钯合金纳米棒为金银钯核壳枝晶状的纳米棒，所述金银钯核壳枝晶状的纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以枝晶状银钯合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米棒的长度为20~50nm；
所述TH为硫堇的水溶液，所述水溶液中硫堇的浓度为5mmol/L；
所述CHS为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成的壳聚糖水溶液；
所述的EDC/NHS为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS的混合溶液，所述混合溶液中EDC的浓度为0.01mol/L，NHS的浓度为0.002mol/L。
2. 本发明所述的制备方法所制备的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器，所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器应用于胃癌肿瘤标志物的检测，其特征在于，检测步骤为：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作电极修饰：将本发明所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和20uL 3~6 mol/L的H2O2；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；空白标样的响应电流记为I 0，含有不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液的响应电流记作I i，响应电流降低的差值为ΔI = I 0-I i，ΔI与胃癌肿瘤标志物标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；
（4）胃癌肿瘤标志物的检测：用待测样品代替步骤（1）中的胃癌肿瘤标志物标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中胃癌肿瘤标志物的含量。
3. 本发明所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于所述胃癌肿瘤标志物选自下列之一：CA-199、CA-242或CA-724。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的胃癌肿瘤标志物免疫传感器制备简单，操作方便，实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前景；
（2）本发明首次采用光电化学方法制备了AuAg-Pd NDRs并将其应用于电化学免疫传感器的制备中，通过TiO2 NPs与AuAg-Pd NDRs的协同催化作用，显著提高了电极对H2O2的响应速度和重现性，大大提高了电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1  电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法：
（1）以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 uL 二氧化钛纳米粒子溶胶TiO2 NPs，室温下晾干后，滴涂5 μL的金银纳米棒溶胶AuAg NRs，并在室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂5uL 0.01 mol/L 的氯钯酸溶液H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射30秒，制得TiO2 NPs负载的金银钯合金纳米棒材料AuAg-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，表面滴涂5 uL硫堇溶液TH，室温下晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用超纯水清洗，表面滴涂5 uL壳聚糖溶液CHS，室温下晾干；
（5）将步骤（4）中得到的电极用超纯水清洗后，将电极浸入到EDC/NHS溶液中，1小时后取出；
（5）在电极表面滴涂5 μL 10 μg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（6）将步骤（5）中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 ℃ 冰箱中晾干成膜，制得电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器；
所述的TiO2 NPs为1mg/mL 的二氧化钛纳米粒子水溶液；
所述的AuAg NRs为金银核壳纳米棒与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金银核壳纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以银纳米粒子为壳层的核壳结构的棒状纳米粒子，所述棒状纳米粒子的长度为20nm；
所述的H2PdCl4为pH值为1的氯钯酸水溶液；
所述的AuAg-Pd NDRs 为金银钯合金纳米棒，所述的金银钯合金纳米棒为金银钯核壳枝晶状的纳米棒，所述金银钯核壳枝晶状的纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以枝晶状银钯合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米棒的长度为20nm；
所述TH为硫堇的水溶液，所述水溶液中硫堇的浓度为5mmol/L；
所述CHS为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成的壳聚糖水溶液；
所述的EDC/NHS为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS的混合溶液，所述混合溶液中EDC的浓度为0.01mol/L，NHS的浓度为0.002mol/L。
实施例2  电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法：
（1）以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂8 uL TiO2 NPs，室温下晾干后，滴涂8 μL的AuAg NRs，并在室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂8uL 0.01 mol/L 的H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射60秒，制得TiO2 NPs负载的AuAg-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，表面滴涂8 uL TH，室温下晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用超纯水清洗，表面滴涂8 uL CHS，室温下晾干；
（5）将步骤（4）中得到的电极用超纯水清洗后，将电极浸入到EDC/NHS溶液中，1小时后取出；
（5）在电极表面滴涂8 μL 10 μg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（6）将步骤（5）中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂8μL 100 μg/mL的BSA溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 ℃ 冰箱中晾干成膜，制得电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器；
所述的AuAg NRs所使用的棒状纳米粒子的长度为40nm；
所述的H2PdCl4为pH值为1.5；
所述的AuAg-Pd NDRs所使用的棒状纳米粒子的长度为40nm。
实施例3  电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法：
（1）以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂10 uL TiO2 NPs，室温下晾干后，滴涂10 μL AuAg NRs，并在室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂10uL 0.01 mol/L 的H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射90秒，制得TiO2 NPs负载的AuAg-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，表面滴涂10 uL TH，室温下晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用超纯水清洗，表面滴涂10 uL CHS，室温下晾干；
（5）将步骤（4）中得到的电极用超纯水清洗后，将电极浸入到EDC/NHS溶液中，1小时后取出；
（5）在电极表面滴涂10 μL 10 μg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（6）将步骤（5）中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂10μL 100 μg/mL的BSA溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 ℃ 冰箱中晾干成膜，制得电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器；
所述的AuAg NRs所使用的棒状纳米粒子的长度为50nm；
所述的H2PdCl4为pH值为2；
所述的AuAg-Pd NDRs所使用的棒状纳米粒子的长度为50nm。
实施例4  实施例1制备的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器，用于胃癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作电极修饰：将本发明所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入10mL pH=7.0的PBS缓冲溶液和20uL 3 mol/L的H2O2；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；空白标样的响应电流记为I 0，含有不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液的响应电流记作I i，响应电流降低的差值为ΔI = I 0-I i，ΔI与胃癌肿瘤标志物标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；
（4）胃癌肿瘤标志物的检测：用待测样品代替步骤（1）中的胃癌肿瘤标志物标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中胃癌肿瘤标志物的含量；
所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的线性检测范围为：0.02~25 ng/mL，检出限为：8 pg/mL；所述的胃癌肿瘤标志物为CA-199。
实施例5  实施例2制备的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器，用于胃癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作电极修饰：将本发明所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入15mL pH=7.4的PBS缓冲溶液和20uL 4 mol/L的H2O2；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；空白标样的响应电流记为I 0，含有不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液的响应电流记作I i，响应电流降低的差值为ΔI = I 0-I i，ΔI与胃癌肿瘤标志物标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；
（4）胃癌肿瘤标志物的检测：用待测样品代替步骤（1）中的胃癌肿瘤标志物标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中胃癌肿瘤标志物的含量；
所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的线性检测范围为：0.02~37 ng/mL，检出限为：8 pg/mL；所述的胃癌肿瘤标志物为CA-242。
实施例6  实施例3制备的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器，用于胃癌肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液，底液为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作电极修饰：将本发明所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器作为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接电化学工作站，在电解槽中先后加入25mL pH=8.0的PBS缓冲溶液和20uL 6 mol/L的H2O2；通过计时电流法检测组装的工作电极对H2O2的响应；空白标样的响应电流记为I 0，含有不同浓度的胃癌肿瘤标志物标准溶液的响应电流记作I i，响应电流降低的差值为ΔI = I 0-I i，ΔI与胃癌肿瘤标志物标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔI－C工作曲线；
（4）胃癌肿瘤标志物的检测：用待测样品代替步骤（1）中的胃癌肿瘤标志物标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应电流降低的差值ΔI和工作曲线，得到待测样品中胃癌肿瘤标志物的含量；
所述的电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的线性检测范围为：0.02~28 ng/mL，检出限为：8 pg/mL；所述的胃癌肿瘤标志物为CA-724。
实施例7  人血清中胃癌肿瘤标志物的检测
准确移取人血清样品，加入一定质量浓度的胃癌肿瘤标志物抗原标准溶液，以未加入胃癌肿瘤标志物抗原的人血清为空白，进行加标回收实验，按照实施例4~6的步骤进行检测，测定样品中胃癌肿瘤标志物的回收率，检测结果见表1。
表1 人血清中胃癌肿瘤标志物的检测结果
表1检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.5 %，回收率为95.0 ~ 108%，表明本发明可用于人血清中胃癌肿瘤标志物的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。

Claims (2)

1.一种电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为：
（1）以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5~10 μL 二氧化钛纳米粒子溶胶TiO2 NPs，室温下晾干后，滴涂5~10 μL的金银纳米棒溶胶AuAg NRs，并在室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂5~10 μL 0.01 mol/L 的氯钯酸溶液H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射30~90秒，制得TiO2 NPs负载的金银钯合金纳米棒材料AuAg-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，表面滴涂5~10 μL硫堇溶液TH，室温下晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用超纯水清洗，表面滴涂5~10 μL壳聚糖溶液CHS，室温下晾干；
（5）将步骤（4）中得到的电极用超纯水清洗后，将电极浸入到EDC/NHS溶液中，1小时后取出；
（5）在电极表面滴涂5~10 μL 10 μg/mL的胃癌肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（6）将步骤（5）中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5~10 μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 ℃ 冰箱中晾干成膜，制得电化学胃癌肿瘤标志物无标记免疫传感器；
所述的TiO2 NPs为1 mg/mL 的二氧化钛纳米粒子水溶液；
所述的AuAg NRs为金银核壳纳米棒与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金银核壳纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以银纳米粒子为壳层的核壳结构的棒状纳米粒子，所述棒状纳米粒子的长度为20~50 nm；
所述的H2PdCl4为pH值为1~2的氯钯酸水溶液；
所述的AuAg-Pd NDRs 为金银钯合金纳米棒，所述的金银钯合金纳米棒为金银钯核壳枝晶状的纳米棒，所述金银钯核壳枝晶状的纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以枝晶状银钯合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米棒的长度为20~50 nm；
所述TH为硫堇的水溶液，所述水溶液中硫堇的浓度为5 mmol/L；
所述CHS为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成的壳聚糖水溶液；
所述的EDC/NHS为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS的混合溶液，所述混合溶液中EDC的浓度为0.01 mol/L，NHS的浓度为0.002 mol/L。
2.如权利要求1所述的无标记电化学胃癌肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于所述胃癌肿瘤标志物选自下列之一：CA-199、CA-242或CA-724。
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