KR20130136956A - Pon 분석을 위한 정확한 통합 저가 전자 칩 및 열 전자 유도 ecl시스템의 활용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명품은 열 전극유도 전자화학발광 방법에 사용되는 통합된 전자칩 카트리지 장치 및 특히 생체친화성 분석에서 그리고 특히 중앙 실험실 외부에서 분석물 농도의 수량을 평가하기 위해 발광의 후속적 측정으로서 표식 분자의 전기 자극을 기반으로 한 기기장치와 관련된 것이다.

Description

PON 분석을 위한 정확한 통합 저가 전자 칩 및 열 전자 유도 ECL시스템의 활용 방법{ACCURATE INTEGRATED LOW-COST ELECTRODE CHIPS FOR POINT- OF-NEED ANALYSIS AND A METHOD OF UTILIZATION IN HOT ELECTRON-INDUCED ELECTROCHEMILUMINESCENT SYSTEMS}

현 발명은 ECL현상을 이용하는 분석방법과 장치와 관련하며 특히 POC와 같은 NOP분석에 적합하다.

신속하고 만감한 정량 진단 기술에 대한 일반적인 부담스런 요구사항이 현재 따르고 있다. 이들은 공공보건, 연구, 농업, 환경 관리, 수의학, 일정 산업 생산 구역을 포함한 여러 시장 분야에 적합하다. 개선된 민감도, 속도, 강도, 안정성, 분석당의 감소된 비용이 요소로서 이들은 진단 기술에서 성립되어진 이후 매우 여러 많은 새로운 분야에서 적용될 수가 있다.

고민감도는 일정 진단 도구에서 받아들여질 수 있으나 매우 고가에 해당되게 된다. 반면 일정 방법으로 저렴하면서도 예로서 면역크로마토그래피가 있는데 시장의 일정 요구사항에 적합하지 않게 된다. 이러한 요구사항이 받아들여질 수 있는 어떠한 기술이라도 향후의 진단상에 주요한 위치를 이루게 되고 및 거대한 시장의 잠재력을 가지게 될 것이다.

진단 실용상의 여러 다른 분석 원칙이 있다. 예로 방사능 기반의 분석, 효소-연결면역흡수측정검사, 비색분석, 형광발광 기반 분석, 열전자유도(음극)ECL 양극을 비롯한 화학발광이 있다.

열 전자 유도 ECL은 미특허 6251690 Kulmala S. 등에 기술되어 있다. 각기 이들 기술은 민감도, 강도, 안정성, 속도, 가격 전체에 있어의 역할을 지니게 된다.

기술간의 차이는 물리적 제한성의 기능이나 방법의 잇점을 나타내어주고 있다.

예로 적용 기반의 방사선 화합물의 결점은 안전 및 환경 측면에 있어 기간내의 표식의 부식이자 방사선 폐기물의 기타의 비용이 된다.

진단에 대한 가장 민감한 분석의 적용 사항은 시험 및 도구의 복잡한 성격으로 하여 제한되게 되며 전문가만이 분석을 시행할 수 있다.

분석의 복잡성은 일반적으로 도구 및/혹은 시험의 가격에 직접적으로 비례하게 된다.

복잡한 도구상에 있어 양극 전자화학발광 기술이 이제 보다 인기를 더해가고 있음을 언급할 수 있다: 도구는 복잡한 실험실 로봇이며 이의 처리 방식은 전문 지식이 따르고 측정 과정에 있어 반복되는 세척과 준비 단계가 수반되어지게 된다.

이들은 폐기물 뿐 아니라 분석 비용을 증대시키는 요소들이 된다. 그리하여 소형 실험실, 의사 사무실 등( 침상 혹은 POC 분석)의 필요 사항에 대해 불가능한 형식의 방법이 되고만다.

상업적 이득을 이루는 방법은 분석 물질이 소위 표기 물질에 의하여 혼합물내에서 인식되고 측정되는 원칙을 기반으로 한다.

면역화학성 분석과 같은 생물학적 분자의 유일한 성질을 기반으로 하는 측정에 있어 측정되는 분해물질(X)은 선택적으로 분자 혼합물에서 고체상 결합 항체로 흡수될 수 있고 그 이후 결합 분자는 (X)에 결합되는 다른 표식의 항체로 측정된다.

표식 물질은 방사성 동위원소, 효소, 빛 흡수 혹은 형광성 혹은 인광 분자, 일정한 금속 킬레이트 등이 될 수 있으며 이는 항체에 공유 결합으로 연결되게 된다.

또는 정화물(X)은 표기될 수 있고 미지의 미표기의 샘플양(X)은 경쟁 반응에 의해 측정될 수 있다.

DNA와 R A의 분석은 또한 선택적인 결합(생체친화성)을 기반으로 할 수 있다.

또한 다른 여러 화학적 및 생화학적 분석은 동일한 원칙으로 수행될 수 있다.

비용을 감소하고/혹은 측정 정확도를 증가시키기 위하여 현재 샘플에서 동시에 몇몇 다른 매개변수를 측정하는 경향이 존재한다.

하나의 가능성으로서 뉴오레센스 혹은 누오스프노레슨스를 파장에서 압도하는 혹은 다른 발광 수명을 소유하는 로 유즈 라오에이스가 된다.

다른 측정 원칙 및 전략으로서 이뮤노다이어그노스틱스에서 사용될 수 있는 것으로 1995년 뉴욕 스톡튼 언론사의 데이빗 와일드의 수정본인 면역학적 검정 핸드북의 저서(1-618 페이지)에서 기술되어 있다.

이전의 기술면에서 유기물과 금속 킬리아트는 표식 물질로서 이득을 이루며 또한 빛에 의하여 자극되거나 전기화학적으로 표식에 대하여 특정적으로 발광을 생성할 수 있다.

이들 방법은 특히 민감적이고 매우 적합하게 된다.

그러나 측정된 농도가 극히 낮으므로 또한 사례마다에 따라 어려움이 있게 된다; 형광 발광의 사용은 다른 것에 있어 Tyndall, Rayleigh and Raman분산에 의하여 변형될 수 있다.

생물학적 물질의 측정시에 거의 예외없이 자극 파동 이후 빠른 방전의 높은 배경에 형광 발광이 있다. 용액상의 인광은 거의 킬리아트만으로 란탄족 원소 이온 특히 합성 유기분자 사이에 활용될 수 있다. 광루미네선스 표기와 자극 기술의 결점은 도구의 복잡성과 민감한 광학 구성품의 고가가 된다.

일반적으로 ECL의 잇점은 전기 자극 구성품과 보다 간단한 광학의 저가에 해당된다.

광루미네슨스와 비교하여 몇몇 결점이 간과될 수 있다.

불활성 금속 전극과 기존의 양극 전자화학발광은 유기 발광단으로 솔벤트에서 비교적 간단한 장치로서 수행될 수 있다.

그러나 최대의 상업적 기대치가 집중되어지는 생체친화성 분석에서 수용액이 적용된다. 생물학적 샘플이 거의 항상 비유기용액에서 취해지므로 측정 시스템은 수용액 혹은 최소한 교질입자 물 용액에서 작동되어야 한다. 아주 제한된 수의 전환 금속 킬리아트만이 물 용액 혹은 교질입자 용액의 양극 ECL에서 ECL-표기로 작동된다.

그리하여 양극 ECL의 상업적으로 가장 중요한 분석 화학 적용은 Ru(bpy)32+-킬리아트의 파생물을 사용하는 방법으로 표식의 감지상이 교질입자상에서 발생되게 된다.

교과서 그대로 교질입자 혼합물은 교질입자 균형의 통제되어지지 않은 복잡성으로 하여 항상 다른 교란 효과일 수 있다.

모세관 전기이동시스템에서 유사한 시스템이 또한 아주 작은 감지 전지에서 사용될 수 있다.(A. Aurora 등, Anal. Comm. 34 (1997) 303-395.)

열 전자유도 ECL은 교질입자에 의존하지 않으며 양극 ECL에 비하여 여러 주요 잇점을 갖춘다. 이는 면역 및 DNA 교배 방법에 모두 적용될 수 있다. (Blackburn, G. 등., 1991 , Clin. Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., et al. 1992, Clin. Chem. 33: 873-879 참조).

로쉬 진단사에 의한 면역측정 및DNA 혹은 RNA 검사 적용은 자기 입자를 사용한다. 이로서 표식 물질은 작동 금 전자에 들여지게 된다 (Massey; Richard J., 등. US 5746974; Leland; Jonathan K. 등. 미국 5705402).

그러나 자기 라텍스 입자의 재생 가능 처리는 여러 측면에서 어려운 것으로 하여 이 방법은 복잡하고 정밀한 액체 처리 시스템을 갖춘 고가의 실험실 로봇(예. Elecsys 1010 및 2010 )에서만 활용적이다.

또한 영구 거대 작동 금전자는 각 분석간의 오랜 세척과 사전 처리가 요한다 (Elecsys 서비스 사용서, p. 70).

여러 측면에서 우수하나 생체친화성 분석상의 열 전자 유도 ECL의 결함은 반응 분자를 균형되어지게 하기 위한 오랜 잠복 시간을 요하는 점으로서 이는 분석 정확도의 최적화를 위하여 요하는 사항이 된다.

이후 수행 기능의 크나큰 개선 사항은 얇은 다공성 필름을 작동 전자에 배치하고 CIPF-장치를 생성함으로서임을 알 수 있었다. (미2009178924 (Al), Ala-Kleme 등).

기존의 전기 화학에서 전극은 동일한 평면에서 가끔 통합되어지게 되나 이론상으로 열 전자 전기화학의 사용에서는 해당되지 않는다. 이는 HECL이 반대 전극에 가장 가까운 작동 전극(음극)의 외부 가장자리에서만 방출되어야하기 때문이다.

그러나 검사 중 발견한 사항은 어떠한 이유로서 매우 높은 양의 전해질 용액을 갖춘 전해기에서 반대 전극이 보통 유리, 세라믹 혹은 유기 중합체와 같은 절연 물질로 만들어지는 전극 칩(통합된 전극 칩, IE칩)의 동일한 평면에 위치하더라도 HECL은 전체 작동 전극 표면상에 고루 방출되는 점이 된다.

핀란드 투쿠의 랩마스터사는 거의 10년간 진단 띠로 작업을 하여 이들의 개발 용액은 생체친화성 분석에서 샘플과 시약을 투입하기 위하여 플라스틱에 안치된 단일의 산화물 피복 실리콘과 필수의 다용도 막을 포함하는 다소 구식의 장치가 된다(미2009178924, Ala-Kleme 등). 이들 끈의 주요 결함사항은 잔여물을 방지하기 위하여 전 측정이 측정간에 주의하여 세척되어야 하는 도구 전지에서 수행되는 점이 된다. 도구내에 장착된 반대 전극의 저하점도 또한 문제점이 된다.

현 발명품은 지극히 정확하고 재생이 가능한 전극으로서 진정한 1회용 카트리지를 구축하는 수단을 제공한다. 이로서 또한 실질 분석상에 있어 매우 정확한 결과를 자아내게 된다.

현 발명품은 실리콘과 여러 절연 기질로부터 IE칩을 구축하는 매우 정교하고 정확한 방법을 나타내고 있다.

현 발명품은 랩마스터의 CIPF 장치로 연계하여 사용되어 품질(실리콘 기반 IE칩)을 높여주거나 유지하여줌과 동시에 생산비(유리 및 플라스틱 기반 IE칩) 를 감소시킬 수 있다.

그러나 무엇보다 중요한 것은 여러 다른 카트리지 유형은 손쉽게 생체친화성 반응을 높이기 위하여 성가신 막을 요하지 않도록 고안될 수 있다.

특히 IE칩 변형물을 실리콘에서 구축하는 기발한 솔루션은 HECL을 활용한 분석의 PON 유형의 정확도와 재생 가능성에 대한 혁신을 일으켜주게 된다.

PON 시장에서 낮은 감지 제한성으로서 현재의 IE칩 혁명을 사용한 향후의 카트리지로서 이같은 신속하고 정확한 분석 결과를 제공하는 방법은 현존하지 않는다.

현 발명품은 CIPF 장치의 기능의 크나큰 개선 사항 및 또한 IE칩을 포함하는 매우 정확한 1회용 HECL 카트리지의 새로운 유형을 비롯하여 청구항 1-10에서 기술한 카트리지를 활용한 새 분석 방법 또한 획득될 수가 있게 된다.

현 발명품은 실지 면역 측정이나 DNA 교배가 다공성 필름으로 IE칩(CIPF-IE칩 장치) 표면상에서 행해질 경우 단순하고 저렴한 장치로서 복잡한 장치와 같이 동일하게 잘 여러 분석을 수행할 수가 있게 된다.

그리하여 이전의 CIPF에 대한 크나큰 개선 사항이 이루어질 수 있고 측정 도구와 측정 카트리지는 PON 분석을 위한 저렴한 가격이 되어져 완벽한 1회용으로서 제조가 가능하게 된다. 그러므로 분석간에 남는 잔존물이 없고, 카트리지에 별도의 작동 전극과 상대 전극이 도입되지 않아야할 경우 CIPF-IE칩 카트리지의 제조는 보다 손쉽게 될 수 있다.

그림 1. 실리콘(a)과 유리(b) 장치의 횡단면. 세로, 가로 치수는 확대되지 않는다.
그림 2. 실리콘 장치에서 시험된 전극 기하학적 특징의 일부. 흑백 영역은 작동 전극 및 상대 전극을 각기 나타내어준다. 회색 부분은 절연 처리에 해당한다. 칩은 상대 전극의 전극 유형(WIRE, MESH, CIRC, 혹은 RING), 선 넓이(첫 세부분은 200㎛ 및 메쉬 장치의 상대 전극 선 간격(1000 ㎛ 버젼을 나타냄)을 나타내고 있다.
그림 3. PDMS 모세관 주입 샘플실
그림 4. 모세관 주입 PDMS실과 실리콘 기반 IE칩(좌), 소수성 피압 샘플 유적과 IE칩(우)
그림 5. 최종 전기 전해기 중간의 원형 작동 전극과 실리콘과 유리 기반 IE칩
그림 6. 상단에서 하단까지 링 500 장치(IE칩 상의 3 미리미터 용액 공간), 소수성 샘플 피압과 메쉬200/1000 장치, PDMS유체소자와 메쉬200/1000 장치, IE칩 상의 3 미리미터 용액 공간의 유리 장치를 사용하는 Tb(III) 킬리아트의 측정 곡선
그림 7. (a) 실리콘 기반 IE칩, 사각형, (b) 유리 기반 IE칩, 원형, 시약외에 소수성의 주위 전지 구역과 실리콘 기반 및 유리 기반의 IE칩, 막 슬라이드를 사용한 외래 TSH 면역 측정. 각 농도에 대한 측정 3배
그림 8. 실리콘 기반 IE칩과 PDMS 뚜껑을 사용한 외래 TSH 면역 측정
그림 9. 실리콘 기반 IE칩상의 바이러스성 RNA의 검사 분석
그림 10. 여러 유형의 카트리지를 위한 IE칩 용액. (a) 실리콘, (b)유리로 만들어진 다른 카트리지 유형을 위한 특정 IE칩

현 발명품은 실지 면역 측정이나 DNA 교배가 다공성 필름으로 IE칩(CIPF-IE칩 장치) 표면상에서 행해질 경우 단순하고 저렴한 장치로서 복잡한 장치와 같이 동일하게 잘 여러 분석을 수행할 수가 있게 된다.

그리하여 이전의 CIPF에 대한 크나큰 개선 사항이 이루어질 수 있고 측정 도구와 측정 카트리지는 PON 분석을 위한 저렴한 가격이 되어져 완벽한 1회용으로서 제조가 가능하게 된다. 그러므로 분석간에 남는 잔존물이 없고, 카트리지에 별도의 작동 전극과 상대 전극이 도입되지 않아야할 경우 CIPF-IE칩 카트리지의 제조는 보다 손쉽게 될 수 있다.

또한 크나큰 대량물이 생산될 경우 전극 재료가 저렴하다. IE칩, 최종적으로 CIPF-IE칩 카트리지와 다른 유형의 IE칩 카트리지의 생산이 매우 단순하고 비교적 손쉽다.

현 발명품은 CIPF-IE칩 카트리지와 다른 유형의 IE칩 카트리지를 수반하는 여러 변형의 CIPF-IE칩 장치 유형과 카트리지를 갖추게 된다.

현 발명품에서 상대 전극은 예로서 실리콘 칩상의 작동 전극의 표면위에 제작되었고 샘플 전지실은 칩상에 주조 성형 PDMS 뚜껑을 전극 칩에 결합하여 형성되었다.

이는 완전 통합형 HECL 샘플 전지를 형성하여 사용이 편리하고 완벽한 형태의 1회용으로서 또한 샘플 상호 오염의 위험을 제하여준다. 그리하여 이같은 장치는 POC 분석 적용시에 사용될 수 있다. 광학 감지 장치에서 PDMS는 240-1 100 nm의 넓은 파장 범위상에서 높은 광학 투명성으로 하여 이상적인 재료가 된다. 또한 전기적으로 절연을 이루며 수용액 시약에 대하여 화학적으로 비활성화적인 이유로 인한다.

무늬의 소수성 필름을 활용하는 대체적 형태의 샘플 견제안 또한 갖추어진다.

PDMS 유체소자는 손쉽게 마스터 성형을 사용하여 대량으로 손쉽게 제작되나 PDMS 커버의 HECL 칩으로의 결합은 또 하나의 제작 단계가 되어 칩이나 웨이퍼 스케일상에서 행해진다.

반면 소수성 표면 수정은 단순한 웨이퍼 스케일 융착 단계이며 정형화는 손쉽게 하나의 사진 석판술 단계와 양력으로 효과를 내게 된다. 소수성 표면 수정은 또한 IE칩상의 다공성막을 사용하여 생체친화성 분석을 수행하는 단순한 방식을 이룰 수 있게 한다. 이로서 잠복 기간이 매우 짧아지고 분석이 신속하여지게 된다.

현 HECL 장치는 작동 전극과 얇은 상대 백금 필름 전극으로서 열적 산화실리콘을 사용하여 제작된다. 이는 모형 분석물로서 사용된 Tb(III) 킬리아트에 대한 서브나노몰 민감도를 획득하게 된다. 원자층 용착 알루미나로 덮인 얇은 흑연 알루미늄 막의 유리 장치가 또한 있어 절연 기질상의 용착 전극으로서의 가능성을 이루고 있다.

본 발명품은 저가이나 고정밀의 정량속성 검사 및 시험 카트리지의 가능한 제조로서 PON 시장을 겨냥한 이전의 CIPF 장치 및 방법의 기술측에 있어서의 주요한 개선을 형성하게 된다.

일찌기 동일한 원칙이 보다 저렴한 재료로서의 수동 제작에 의하여 활용될 수 있음을 알 수 있었으나 현 방법론이 적용되고 매우 대량의 생산량이 일어날 경우 최종 카트리지 가격이 높지 않으나 이러한 장치의 정밀도는 현 발명품의 장치와는 매우 다른 형태가 된다.

범례 8은 특정 용도로서의 여러 유형의 카트리지 해결안을 선보인다. 현 혁신품은 기 실질적인 범례로서 가장 손쉽게 이해되어질 수 있다.

다음, 발명품은 도표와 무제한적 예시와 도면을 통하여 설명되어지게 된다.

예시 1. IE칩 장치의 제조 및 Tb(III) 표기의 측정 배치

실리콘 장치 제조

산화 표면 실리콘 작동 전극을 갖춘 장치는 0.005-0.018 Ω-cm 저항력과 ( 1 1 1) 지향의 rc 유형 실리콘 웨이퍼로부터 제조되었다.

웨이퍼는 먼저 SC-1 (80C에 NH4OH/H202 용액)로 RCA 세척, 희석 HF 이후 SC2( 80C에 HC1/H202 용액) 및 90분간 950에서 침윤 산화로서 380 nm 필드 산화물 두께를 형성하였다.

산화물은 표준 광학 석판 인쇄 및 침윤 에칭으로 무늬를 형성하여 작동 전극 구역을 규정하였다.

천연 산화물을 제거하기 위한 HF 침전으로 RC 세척 이후 작동 전극의 얇은 터널링 산화물은 마른 산화물에 의해 10% 산소에서 -850C에 증대되었다.

산화물의 약 4 nm이 20분만에 증대되었다. 사진 석판술 이후 50 nm의 백금이 박막증착에 의해 침전되었고 제거로 하여 무늬를 형성하게 되었다.

상대 백금 전극에로의 전기적 접촉이 웨이퍼 앞쪽의 접촉 패드(평행으로 연결)를 통해 이루어졌다. 디때 실리콘 작동 전극은 웨이퍼 뒷면을 통해 접촉되었다. 항상 요구되는 형태는 아니더라도 뒷면 접촉은 무산화물의 웨이퍼 뒷면의 침윤 에칭과 약 100 nm의 알루미늄상의 스퍼터링을 통해 보다 잘 이루어질 수 있다. 도면 1 (a)는 와이어 유형 장치(아래 상세히 설명)에 걸친 도식 단면도를 나타내어준다.

유리 장치 제작

파이렉스 유리 웨이퍼는 SC-1으로 먼저 세척되고 400 nm의 알루미늄이 스퍼터링을 이루어 작동 전극을 형성하며 백금 무늬 제작에서 전긱방식용 층의 역할을 하게 된다.

우선 상대 전극 구역은 표준 광학 석판 인쇄로 규정되고 알루미늄은 이들 구역에서 침윤 에칭을 통해 제거되었다.

알루미늄 필름은 100%까지 고의적으로 지나친 에칭을 이루어 포토레지스트의 돌출부 구조를 형성하였다. 이는 이 단계에서 제거되지 않았다.

백금은 이후 제거를 통해 스퍼터링과 무늬를 형성하였으며 돌출부 레지스트로 촉진되었다.

다음 알루미늄 작동 전극은 석판 인쇄와 침윤 에칭으로 확정되었다.

약 4 nm의 산화 알루미늄이 ALD에 의해 트리메틸알루미늄과 물 전구물에서부터 침전되었다.

이 층은 상대 백금 전극과 접촉 패드에서 사진 석판술과 에칭에 의해 제거되었다.

에칭은 2분 과도 현상동안 알칼라인 포토 레지스트 현상 용액에 의해 유발되었다. 이는 포토 레지스트 패턴이 손쉽게 견디어낼 수 있는 형태가 된다.

최종적으로 포토 레지스트가 제거되었다.

웨이퍼 전면에 각기 접촉 패드를 통해 작동 전극 및 상대 전극 모두에 전기 접촉이 형성된다.

유리 장치의 도식 단면도가 그림 1(b)에 나타나 있다.

전극 기하학적 특징과 PDMS 유체공학

몇몇 상대 전극 기하학적 특징이 유리 장치 및 실리콘 장치 모두에 조사되었다. 그림 2는 실리콘 디자인의 일부를 나타내고 있다. 그림의 검정 구역은 실리콘 터널링 유전체에 의해 덮혀진 실리콘 작동 전극을 나타낸다. 백색 구역은 상대 전극의 백금 금속 전환을 나타낸다. 반면 회색 구역은 전기 절연체의 두꺼운 필드 산화물을 나타낸다.

전극 디자인은 작동 전극을 가로지르는 단순한 전선(그림 2, 와이어), 작동 전극상에 전선망(그림 2, 메쉬), 작동 전극 구역내 원형 작동 전극(그림 2, CIRC), 둥근 작동 전극을 완전히 둘러싸는 고리형의 상대 전극(그림 2 링)을 포함하였다. 상대 전극의 선 넓이를 비롯하여 메쉬 디자인의 선의 밀도는 다양하였다. 전체 디자인에서 최소한 100-㎛간격(두꺼운 필드 산화물에 의해 절연처리됨)이 작동 전극 및 상대 전극 사이에 이루어졌다. 이의 유사한 기하학적 특징이 유리 장치에서 검사되었다.

주조 PDMS의 대표 거푸집이 실리콘 웨이퍼상에서 표준 사진석판술 기술로서 본 표면상의 SU-8 구조물을 처리하여 제작되었다.

SU-8 50 의 50-㎛혹은 SU-8 100 의 350-㎛층이 이 장치에 사용되었다.

SU-8의 다양한 층이 보다 두껍거나 다단계 구조물의 형성을 위해 사용될 수 있다.

완성 이후 대표 거푸집은 옥스포드 플라즈마랩-80+ 반응 이온 에칭 시스템에서 CHF3 플라즈마로부터 30 nm막의 들어붙지 않는 테플론과 같은 불소 중합체로 100 심 유량률과 50W RF 전력을 이용하여 덮혔다.

이는 대표 거푸집으로부터 보다 손쉽게 저장된 PDMS를 벗겨내고 PDMS의 결합 성질을 유지한채 대표 거푸집의 수명을 늘리게 한다.

PDMS 유동칩은 실가드 184 실리콘 탄성 중합체, 기처, 10.T율로서 혼합된 저장제를 페트리 접시에 대표 거푸집상으로 주조하여 제작되었다.

젖은 PDMS는 이후 진공 상태에서 출구 가스상태가 되고 2시간 동안 50 C에서 저장되었다.

저장된 PDMS는 대표 거푸집에서 벗겨내어지고 각기 칩으로 절단된 후 HECL 전극 칩으로 결합되었다.

결합은 먼저 PDMS 유체칩과 HECL 전극 칩을 테크닉스 플라즈마 테플라-400 반응기에서 800 심 산소 흐름과 800 W RF 전력을 사용해 30초간 산소 플라즈마에 노출시켜 개선시켜주었다.

이 플라즈마 처리는 또한 PDMS 표면을 친수성 있게 하고 샘플실을 모세 관력으로 채우는 것을 가능하게 하여준다.

그림 3은 PDMS 뚜껑의 기하학적 특징을 보여준다: 칩의 한 끝 부분의 유입구 경로는 칩의 표면을 샘플 용액에 담그어 샘플실을 채우기 위해 사용된다. 반면 여러 통로로 하여 공기가 채우는 과정동안 빠져나가게 하도록 한다.

소형 기둥은 샘플실의 PDMS 천장을 지지하게 된다. 현재 디자인에서 기둥은 유체실에 고루 분포되어 작동 전극이나 상대 전극의 기하학적 특징에 따라 최적화되지 않은 형태가 된다.

PDMS 뚜껑은 HECL 칩의 전극 구역만을 덮어 전기 접촉 패드가 노출되게 한다.

소수성 샘플 유치

HECL 전극 칩의 소수성 샘플 유치는 소수성 불소 중합체 필름을 전극 주위의 구역에 침전하여 생성되었다. 전기 접초고 패드뿐 아니라 작동 및 상대 전극 구역을 포토 레지스트로 가린 이후 불소 중합체막은 2.4 조항의 SU-8 대표 거푸집에서와 같이 동일한 플라즈마 과정으로 침전되고 아세콘에서 제거하여 무늬를 형성했다. 전극은 이후 코팅되지 않고 친수성으로 하고 반면에 주위 영역은 강한 소수성으로 이루게 하였다.

Tb(III) 표기로 HECL- 측정

2,6-bis[N,N-비스(카복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페놀로 착염된 Tb(III) 용액은 모형 표기로서 사용되었다.

HECL 측정은 광학적 감지를 위해 포토 증배관과 파장 40 nm 대역폭 광학 개입 필터로 Tb(III) 킬리아트에 의해 방출된 전체 분광선을 통과하기 위해 샘플 보유기에서 수행되었다.

전면 및 후면 전기 접촉이 샘플 보유기에 이루어져 HECL 칩과 내장 펄스 생성기를 접점하엿다.

20 헤르쯔 비율에서 온칩 전극사이에 정전기량 펄스가 적용되었다. 총 천 펄스에 걸쳐 발광 자료가 측정되었다.

선택의 개선사항을 위해 펄스 끝에서 50 \ 연기 이후 6 ms동안 발광을 통합하면 광학적 감지가 시간 분해 방식으로 수행되었다.

PDMS 유체 공학의 장치(도면 4, 좌)는 칩의 유입구 끝을 유리 플레이트 표면상에 샘플 용액 방물에 담그어 샘플 용액으로 찼다.

신속히 모세관력으로 찬 PDMS실, 모두 채워진 것을 "손쉽게" 눈으로 확인될 수 있다.

총 샘플량은 PDMS실량(350 ㎛고유체실에 대해서 약 15 ㎛)에 의해 제한되었다.

거의 명백한 반구형 방울(그림 4, 우)이 소수성 고리내에 형성될 때까지 소수성 제한의 샘플이 전극칩상에 직접 피펫되었다. 샘플 용액100 ㎛ 이 사용되었다.

몇몇 IE칩 변형을 사용해 Tb(III) 킬리아트 표기의 구획 측정은 그림 6에 나타내었다.

예시 2. 실리콘 기반 및 유리 리반 IE칩을 사용한 이기종TSH 면역 측정

사용 IE칩은 그림 5의 좌측에 나타내었다.

IE칩의 전극 구역은 이 위의 소수성 고리를 이용해 코팅되었다.

:0.1 M MES, 0.03 M H3B03, 0.5 mM K-구연산염, 0.025% 글루타르알데히드, 0.05% BGG, ㎍/mL 의 항체(MIT0406 MOAB 반대 hTSH Medix Biotech Inc. 미국)로 구성된 코팅 용액(150 마이크로케이)

폐쇄된 플라스틱 상자의 실온에서 2시간의 잠복 이후 코팅 용액은 흡입되었고 광천은 2회에 걸쳐 세척 용액(0.9% of NaCl, 0.09% NaN3, 0.05%을 포함하는 50 mM Tris-HCL, pH 7.8) Tween 20으로 세척되었다.

광천은 이후 300iL의 포화용액(50 mM Trizma 기저, 0.1 % BSA, 0.1 % NaN3, 0.1 % Tween 20, H2S04로 조정된pH 7.5)을 추가하여 포화되었다. IE칩은 포화 이후 2.5시간동안 섭씨30도에서 건조되었다.

테리비윰(III) 킬리아트의 이소티오시아네이트 유도체가 실온에서 pH 9.5 에서 밤새 80회 질량 접촉에서 반응되기 위하여 표식된 항체(단일클론의 anti-hTSH, 클론 5404, 5.5 mg/mL, Medix Biochemica Oy Ab) 가 준비되었다.

세파덱스 G-50로 5.5 cm까지 채워지고 세파로즈 6 B로 기타의 52 cm를 위한 지름 기둥 1 cm이 과잉 시약으로부터의 활용된 프로틴 부분을 분리하기 위해 사용되었다.

면역 측정이 다공성막(두께6-1 1 um, lxl 05 - - 6x10 구멍들/cm , Whatman)의 사용을 기반으로 되었다.

.05% NaN3, 0.9% NaCl, 0.5 % BSA, 0.05% BGG, 0.1% 트윈 20을 포함하는 50 mM Tris-HC1 버퍼의 표식된 항체(0.5 ㎛, 80 ㎍/mL)가 10 ㅌ 10 nm 막 부분에서 피펫되었고 밤새 실온으로 건조되게 하였다.

표준 샘플(:FSl I-농도-O. I ,-1 .0.-1 0.0_and_1.0.0.0_mlL7L)이 시험관에서 TSH 표준 용액(Wallac, DELFIA hTSH kit, 324 mlU/mL TSH) 을 희석액 (50 mM Trizma 기저, 0.05% NaN3, 0.9% NaCl, 0.5 % BSA, 1 mM CaCl2*H20, HC1로 조정된 pH 7.7)으로 묽게 하여 준비되었다.

면역 측정을 위해 건조된 표식 2차 항체를 포함하는 막 부분이 전해질 용액 방울로 전해질 세포를 형성하기 위해 소수성 전극 부분에 첨부되었다.

샘플의 A는 IE칩의 다공성막의 중앙에 피펫되었다. 샘플은 표식된 항체를 용해하고 막과 전극 네트워크 사이의 공간을 빨리 채웠다.

7분 이후 면역반응은 균형점에 충분히 가까웠으며 막은 족집게를 사용하여 제거되었다.

:IE칩은 3회 세척/측정 용액(50 mM Na2B407, 0.1 % NaN3, 0.003% Tween 20, H2S04로 조정된 pH 7.8)으로 세척되었다.

이후 100의 측정 버퍼가 추가되었고 TR-HECL 강도가 일렉트로체밀루미노미터로 측정되었다.

측정 도구는 표준 연구 도구SR 400 게이트 광자 카운터, Nucleus MCS 다중 계수기 카드, 자가제조 정전기량 펄스 생성기, 자가제조 전지부(검정 플라스틱), PerkinElmer 광자 계산CPM 모듈로 구성되었다.

표준 샘플의 측정 곡선은 그림 7(a)에 나타났으며 사각형으로 표시된 부분이며 각 농도마다 3배 측정이 된다. CV:는 2% 미만으로 HECL 사용에 의한 수행된 생체 친화성 분석에서 이전에 볼 수 없었던 현상이다.

동일한 절차가 유리 리반의 IE칩(그림 5, 우)을 사용하여 반복되었다. 이로부터의 결과가 그림 7(b)에 나타나 있으며 원으로 표시된 부분으로 각 농도마다 3배 측정이 된다. CV:가 또한 우수하였으며 2% 미만이였다.

예시 3. 실리콘 기반 IE칩과 PDMS 뚜껑을 사용한 표준 샘플로의 이종의 TSH 면역 측정

와이어 유형의 실리콘 기반 IE칩이 사용된 것을 제외하고 예시 2에서 유사한 방식으로 면역 측정이 수행되었다.(그림 4, 좌)

다른 예외로서 다공성막이 사용되지 않았으며0.05 M 사중 붕산염-H2S04 버퍼(0.1 % aN3, 0.5 % BSA, 0.05% BGG, 0.01% Tween 20을 포함하는 pH 7.7)에서 표식 항체(0.5 ㎛, 80 ㎍/mL) 가 PDMS 뚜껑의 빈 부분에 피펫되었고 id가 밤새 실온으로서 건조되었다.

다음날 PDMS 뚜껑이 적절한 위치에 배치되었고 각 IE칩에 조여졌다. 이후 샘플이 in 150 ㎛,(0.1 % NaN3, 0.5 % BSA, 0.05% BGG, 0.01% Tween 20을 포함한 0.05 M 사중붕산염-H2S04 버퍼, pH 7.7, )에서 희석되었고 PDMS-IECP 카트리지 원형의 유입구에서 피펫되었다.

모세관력만으로 또한 빈 공간이 잘 채워질 듯하였다.

정확히 20,0분 잠복 시간 이후 TR-HECL 강도가 측정되었다(펄스 진폭은 -25 V, 펄스 장약15 펄스 빈도 20 헤르쯔, TR-HECL 강도는 200 자극 주기, 연체 시간 0.05 ms, 게이트 시간 6.0 ms에 걸쳐 통합되었다).

표준 샘플의 측정 곡선을 그림 8에 나타내었다.

예시 4. 실리콘 기반 IE칩상의 바이러스성 RNA의 분석 조사

예시 3의 유사한 IE칩이 사용되었으나 이번 소수성 국한 소형 "세포"와 사용되었다. 120-nt PCR 부분이 바이러스성 RNA를 대상으로서 사용되어 증폭되었다(Lonnrot 등, J. Med. Vir. 56 (1999) 378-84.)

본 구역은 중요한 호흡기 및 CNS병원균인 장내 및 코감기 바이러스의 일반 분석을 위한 집중화된 진단 실험실의 진단 대상이다.

피코르나-RNA의 5 '-끝의 템플릿 가닥의 보충적인 전염성 검사(C-검사, TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-AA-C6-NH2, MedProbe As)가 산화 코팅된 실리콘 전극에 고정화되었다(IE칩, 그림 2. 예시 3).

C-검사가 변질된 PCR 제품이 강화되도록 하는 특정 프라이머에 뒤이은 다형핵구 A-뒷면을 보유하도록 고안되었다. 전염성 검사가 제조 지시사항에 따라DSS-시약(디서시니미딜 수베르산염)을 통해 6개 탄소 지방족 탄소와 말단 아미노 기에 의해 IE칩의 실리안 처리된(APTES) 실리콘 산화 표면에 결합되었다.

감지 검사(NH2-X)4-GA-AAC-ACG-GAC-ACC-CAA-AGT-A)가 0.5 질량 탄산 나트륨 버퍼(pH 9.5)에서 킬리아트의 80배 높은 질량 접촉으로 검사를 가온하여 이소트니오시아네이트 유도물 o erbinm-(TIT)chelate-(Tb-2;6-bisfN7N' bis(carboksymethyl)aminomethyl]-4-bentsoylphenol chelate)로 표기되었다.

밤새 가온 이후 표식된 검사가 세파덱스 G50 컬럼 (NAP-5 컬럼, GE Healthcare) 로 정화되었다.

인체 장내 및 코감기 바이러스의 교배 분석은 다음과 같이 수행되었다. RT-PCR 증대 이후 DNA 샘플(1 :50, 1 : 100 and 1 : 1000, 20 ㎛로 희석된PCR 증대 샘플)이 50 mmol/L NaOH ㅇ의 addingl 80 ㎛,(섭씨 37 및 5분) 에 의해 변질되고 200의 중화 버퍼(6xSSC, 0.3% Tween 20, 20 mmol/L 구연산)의 추가로 중화되었다.

이후 이 중화된 샘플 10과 TB 표식 검사, 0.6 ng/㎛., 50 mmol/L Tris-HCl 버퍼, pH 7.8, 600 mmol/L NaCl, 1 % 트리톤 x 100, 1% 차단 시약(로쉬)이 새 관에 도입되었고 혼합 후 최종적으로 이 용액5 ㎛, 이 IE칩의 막에 보내졌다.

주위 온도에서 8분 이내로 반응이 균형점이 충분히 가까워지고 막을 IE칩에서 제거한 후 IE칩은 3회에 걸쳐 세척되었고 TR-CECL이 측정되었다. 샘플 희석 곡선이 그림 9에 나타나 있다.

예시 5. 다른 유형의 카트리지를 위한 EE- 용액

각 카트리지 유형은 적용된 IE칩의 특정 용액을 요한다. 분석에 요하는 전해질 용액층 두께와 전해질, 버퍼 용액 구성물을 고려하는 부분이 된다.

현재의 전극 구역이 적절한 어느 유형의 카트리지에서고 실리콘 칩 기반의 정확한 용액 이 그림 10(a)의 예시 고안물에서 선택될 수 있으며 그림 10 (b)에서 유리 및 기타 절연 기질 기반 칩이 선택되어질 수 있음을 확신하는 바이다.

그림 10 (a)에서 거울과 같은 구역은 상대 전극으로 사용이 가능한 백금과 같은 금속막으로 만들어졌다. 회색 구역은 작동 전극 구역으로 이는 아주 얇은 ca. 4-nm 실리카막으로 코팅되었다. 녹색 구역은 두꺼운 절연막/막들로 코팅되었다.

그림 10 b)에서 (청색) 플라스틱막은 절단시에 칩을 보호하기 위해 필요하다. 그러나 최종 칩에서 손쉽게 제거가 가능하게 된다.

투명 구역은 유리뿐이며 보다 가벼운 비투명 구역은 작동 전극 구역이며 보다 어두운 구역은 상대 전극 구역이 된다.

그림 5의 우측의 이들 IE칩의 한 유형을 자세히 살펴보도록 한다.

Claims (10)

1. 전기화학발광 분석 장치:
   -양극과 응금이 절연재로 만들어졌거나 부분적으로 전도 및 절연 재료로부터의 모두 동일한 전극 지원칩에 통합된다.
   -작동 전극의 재료는 전도체나 강한 피탁 반도체이다. 이들 모두 매우 얇은 (0,5 50 nm) 전기 절연체 층에 의해 덮여있다.
   - 상대 전극은 스퍼터링이나 진공 증발에 의해 금속으로 만들어졌다.
   - 작동 전극과 상대 전극은 전극 칩의 다른 끝 부분이나 코너 부분과 같은 칩의 적절한 부분상에 접촉끈을 보유한다. 이를 통하여 전극은 발광 측정 도구의 자극 전자기기에 연결될 수 있다.
   - 작동 전극은 장치의 음극으로 작동한다.
   -상대 전극은 장치의 양극으로 작동한다.
   - 자극 펄스 동안이나 이후 분석될 샘플은 발광 신호를 보낸다. 이는 해당의 분석물량에 비례한다.
   
2. 청구항 1에 따라 작동 전극은 실리콘이나 알루미늄으로 구성되고 표면은 매우 얇은 산화층(0.5-50nm)을 포함하며 칩의 양극은 먼저 비교적 두꺼운 절연막(200 nm 이상의 순서)을 칩의 해당 양극 구역에 추가하고 장치의 해당 양극 구역상에 추가의 금속막을 증발시키거나 스퍼터링하며 진공으로 전도막으로 코팅되어 제작되는 장치
   
3. 청구항 1-2에 따른 장치로서
   - 100 ㎛ 미만 두께의 다공성막은 에이에크로아에스에 보내진다.
   - 분석할 샘플은 다공성막/막에 보내진다.
   - 다공성막/막 및/혹은 음극에 보내진 샘플 및 기타 시약은 서로 반응하게 된다.
   -자극 펄스 중 혹은 이후 분석할 샘플은 발광 신호를 보내게 된다. 이는 해당 분석물량에 비례한다.
   
4. 청구항 1-3에 따른 장치로서
   - 양극과 음극을 포함하는 전극칩은 중합체 카트리지에서 통합되어 이로서 카트리지의 빈 공간 부분이 모세관력, 압력 혹은 흡입에 의하여 채워지게 된다.
   - 샘플이나 희석 샘플이 칩의 빈 공간을 채우는 동안 장치의 입구의 빈 공간 부분에서 필요 시약들을 용해하게 된다.
   -자극 펄스 중이나 이후 분석할 샘플은 발광 신호를 보내게 된다. 이는 해당 분석물량에 비례한다.
   
5. 청구항 1 내지 6에 따른 장치로서
   -양극, 음극을 포함하는 전극 칩은 플라스틱 카트리지에서 통합되어 이로서 카트리지의 빈 공간 부분이 모세관력, 압력 혹은 흡입에 의하여 채워지게 된다.
   - 샘플 장취나 희석 샘플이 칩의 공간을 채우는 동안 장치의 입구의 빈 공간 부분에서 필요 시약들을 용해하게 된다.
   - 자극 이전에 전극 칩의 빈 공간은 측정 버퍼로 1회 세척된다.
   - 자극 펄스 중이나 이후 분석할 샘플은 발광 신호를 보내게 된다. 이는 해당 분석물량에 비례한다.
   
6. 생체친화성 분석이 통합된 전극 칩의 전극에서 수행되는 방법으로 이때 양극, 음극 모두가 전도, 반도 혹은 절연 기질상에 전도체, 반도체, 절연체의 후속층에 의해 구성된다. 그리하여 최종적으로 양극, 음극은 서로간 전기적 접촉에 있지 않으며 비전자 유인 일렉트로네밀루메센스를 생성하는데 사용된다.
   
7. 청구항 6의 통합된 전극칩상의 생체 친화성 분석이 수행되는 것으로서하여 통합된 전극 칩이 중합체 카트리지에 완전히 삽입되었거나 혹은 분석에서 사용되는 전자화학발광의 자극을 위하여 샘플의 빈 공간, 시약, 결합된 반응, 열 전자 유인 전자화학발광실을 제공하는 중합체 뚜껑으로만 덮히게 된다.
   
8. 청구항7의 방법으로서 생체친화성 분석이 혈액 세포를 제거하고/혹은 생체친화성 반응을 가속화하는 추가 시약 및 /혹은 샘플을 위한 전극상에 다공성막/세포막의 도움으로 소수성 국한 세포 구역에서 통합된 전극칩이나 혹은 다공성 막/세포막의 도움없이 보다 간편하고 직접적으로 소수성 국한 세포 구역에서 수행된다.
   
9. 청구항 7의 방법으로서 혈액 세포를 제거하고/혹은 생체친화성 반응을 가속화하는추가 시약 및/혹은 샘플을 위한 다공성막/세포막은 카트리지의 기능성 부분으로서 통합된다.
   
10. 전자화학발광을 기반으로 한 방법으로서 청구항 1-7의 장치 혹은 청구항 6-9의 방법이 분석에 사용된다.
    

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