KR20130139832A - 저비용 전극칩의 변형과 음극전계발광을 이용한 다성분 분석 및 참조를 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 열전자 유도 전기화학발광(HECL) 및 전계발광(EL) 방법에 사용되는 전자칩(E칩) 카트리지 장치와 특히 중앙 연구실 이외에서 실시되지만 빠르게 실시되어야 하는 스크리닝 테스트인 생체친화성 분석에서 분석물질의 농도를 측정하기 위해 발광 후에 실시하는 측정법과 표지 분자의 전기 여기를 이용하는 도구 사용법에 관한 것이다.

Description

저비용 전극칩의 변형과 음극전계발광을 이용한 다성분 분석 및 참조를 위한 방법{LOW-COST ELECTRODE CHIP VARIANTS AND METHODS FOR MULTI ANALYTE ANALYSIS AND REF-ERENCING BASED ON CATHODIC ELECTROLUMINESCENCE}

본 발명은 전계발광(electroluminescence) 현상의 분석 방법과 그 현상을 활용하는 장치에 관한 것이다. 본 발명은 특히 포인트오버케어(point-of-care) 분석 같은 포인트오브니드형(point-of-need type) 분석과 빠른 스크리닝 테스트에 적합하다.

현재, 전반적으로 빠르고 민감하며 정량적인 진단 기술의 필요에 대한 부담이 있다. 그런 기술은 공중보건, 연구, 농업, 환경보호, 수의학, 특정 산업 생산 영역을 포함하는 광범위한 시장 영역에 적합하다. 향상된 민감도, 속도, 강건성, 안정성, 감소된 분석 비용의 요소를 갖춘 진단 기술이 개발된다면 새로운 영역에서의 수요가 발생할 것이다.

어떤 진단 도구는 민감도는 매우 높지만 대신 매우 고가이다. 또 어떤 방법은 면역크로마토그래피(immunochromatography)의 예에서 볼 수 있듯이 저렴하기는 하지만 시장의 특정한 필요를 충족하지 못한다. 그런 일련의 요구를 충족하는 기술은 장래의 진단과 거대한 잠재적 시장에서 중요한 위치를 차지하게 될 것이다.

실제적인 진단에는 몇 가지 분석 원리가 사용된다. 예를 들면, 방사능을 이용한 분석, 효소면역측정법(ELISA), 비색분석, 형광을 이용한 분석 및 전계발광(EL)등 화학발광을 이용하는 방법 등이 있다. 여기서 전계발광은 전기로 유도한 발광(luminescence)과 같은 것을 말한다. 따라서 전계발광은 양전자와 열전자로 유도된(음극) 전기화학발광(ECL)을 포함하는 것으로 본다. 열전자 유도 ECL(HECL)은 Kulmala S. 등의 미국 특허번호 6251690에 상세히 설명되어 있다. 이들 각 기술은 민감성, 강건성, 속도 및 가격의 총체와 관련하여 각각의 역할을 가지고 있다. 각 기술들 간의 차이는 물리적인 제한 또는 그 방법의 장점을 반영한다. 예를 들면, 방사성 화합물을 이용할 때의 단점은 일정한 기간이 지나면 표지가 부패하고 안전과 환경적인 면에서 볼 때 방사성 폐기물로 인해 추가의 비용이 들어간다는 것이다. 가장 민감하다고 하는 분석을 진단에 사용하려면 시험과 도구의 복잡성 때문에 전문가가 아니라면 사용하기 어렵다. 또 분석 방법이 복잡할수록 시험 도구나 비용도 그만큼 비싸진다. 그런 도구의 복잡성이란 면을 두고 볼 때 현재 양극 전기화학발광 기술은 점점더 인기를 얻고 있지만 복잡한 실험실용 로봇을 사용하고 있어서 전문지식이 없이는 사용하기 어렵고 반복된 세척과 전처리 과정이 필요하다. 또 그런 방법들은 분석 비용과 폐기물의 양을 증가시킨다. 따라서 그런 방법은 작은 실험실이나 박사들의 사무실(침대 옆 또는 현장의 분석) 등에서 사용할 수가 없다.

상업적으로 유용한 방법은 분석대상이 되는 물질을 소위 표지물질(label substances)과 혼합한 혼합물에서 확인하고 측정할 수 있다는 원리에 기초한다. 면역화학적 분석에서처럼 생물학적 분자의 고유의 특성에 기초한 측정법에서는 측정되는 분석물질(X)은 분자의 혼합물에서부터 고체상으로 결합되는 항체(solid-phase bound antibodies)에 이르기까지 선택적으로 흡착되기 때문에 그런 결합 분자(bound molecules)를 (X)에 선택적으로 결합된 다른 표지된 항체들과 함께 측정한다. 표지물질로는 방사선 동위원소, 효소, 빛을 흡수하는 형광성이나 인광성 분자, 금속 킬레이트 등 공유결합에 의해 항체와 결합되는 물질을 사용할 수 있다. 다른 방법으로논, 정제된 (X)을 표지할 수 있고 표지가 되지 않은 알려지지 않은 시료(X)의 양을 경쟁 반응으로 측정하는 방법이 있다. DNA와 RNA 분석도 역시 선택적 결합(생체신화성)을 이용할 수 있다. 또 비용을 감소시키거나 측정 정확도를 높인 기타 여러가지 방법들이 있는데 현재의 경향은 시료의 몇 가지 파라미터를 동시에 측정하는 것이다. 현재 가능성 있는 방법은 다른 파장 또는 다른 발광 라티프타임에서 형광 또는 인광을 보이는 표지를 사용하는 것이다. 면역진단에 사용할 수 있는 다른 측정 원리와 전략은 The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994의 1-618 페이지에 설명되어 있다.

유기물질과 금속 킬레이트가 표지물질로 유용하다는 것과 그런 표지물질이 빛에 의해 여기 상태가 되거나 어떤 경우에는 표지에 대해 전기화학적으로 특정한 발광을 발생시키는 기술에 대해서는 이미 알려진 바이다. 이 방법들은 매우 민감하고 많은 유형의 생체친화성 분석에 매우 적합하다. 그러나 측정된 농도가 극도로 낮기 때문에 어려움이 있을 수 있다. 형광을 사용하면 Tyndall, Rayleigh 및 Raman 산란에 의한 교란이 발생할 수 있다는 단점이 있다. 생물학적 물질을 측정할 때, 거의 예외없이, 여기펄스(excitation pulse) 후에 빠르게 사라지는 높은 백그라운드 형광 발광이 있다. 용액 상태의 인광은 대개 란탄족 이온 간, 특히 합성된 유기분자 사이의 킬레이트와 함께만 활용할 수 있다. 축광(photoluminescent) 표지를 사용하는 여기 기술(excitation techniques)의 단점은 도구가 복잡하고 민감한 광학 부품의 가격이 높다는 것이다.일반적으로 ECL의 장점은 전기 여기(electrical excitation) 부품이 저렴하고 광학 부품이 보다 단순하다는 것이다. 그리고 축광에 비하여, 몇 가지 단점을 피할 수 있다. 불활성 금속 전극을 이용한 전통적인 양극 전기화학발광은 비수성 용매에서 비교적 단순한 도구로 유기 발광단으로 실행할 수 있다. 그러나 생체친화성 분석에서는 가장 상업적으로 주목되는 방식은 수용액을 사용하는 것이다. 생물학적 시료는 거의 항상 비 유기 용액에서 취하며 따라서 측정 장치는 수성 또는 최소한 미셀러(micellar) 수용액에서 작동시켜야 한다. 오직 매우 제한된 수의 천이 금속 킬레이트만이 물이나 미셀러 용액에서 양극 ECL의 ECL-표지로 작용한다.

지금까지 상업적으로 가장 중요한 양극 ECL의 분석화학적 사용은 표지에 대한 탐지가 미셀러 상(micellar phase)에서 나타나는 Ru(bpy)₃ ²⁺-킬레이트의 유도체를 사용하는 방법이다. 텍스트북에서 알려진 것처럼, 미셀러 혼합물(micellar mixtures)은 항상 조절되지 않는 미셀러 평형(micellar equilibria)의 복잡성으로 인해 여러 다른 교란 효과가 일어나는 경향이 있다. 유사한 시스템은 모세관 전기이동 시스템에서 매우 작은 검출 셀을 이용해서도 사용할 수 있다(A. Aurora et al., Anal. Comm. 34 (1997) 303-395. ).

미셀(micelles)에 의존하지 않는 HECL은 양극 ECL보다 여러가지 중요한 장점이 있다. 그 방법은 면역 및 DNA 하이브리드화 방법에 적용할 수 있다(Blackburn, G., et al., 1991, Clin. Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., et al. 1992, Clin. Chem. 33: 873-879 참조). Roche Diagnostics Ltd.에 의한 면역분석과 DNA 또는 RNA 탐침 장치는 표지물질을 금 작업 전극(golden working electrode)으로 옮겨오는 자성입자(magnetic particles)을 이용한다(Massey; Richard J., et al. US 5746974; Leland; Jonathan K., et al. US 5705402). 그러나 자성 라텍스 입자의 재현 가능한 처리는 여러모로 어려움이 있다. 따라서 이 방법은 복잡하고 정밀한 액체 처리 시스템을 갖춘 고가의 실험실 로봇(예: Elecsys 1010, 2010)에만 유용하다. 또한 영구적이고 무거운 금 작업 전극은 각 분석 사이에 긴 시간 동안 세척하고 전처리하는 과정이 필요하다.

비록 많은 점에서 우수한 면이 있다해도, 생체친화성 분석의 단점은 반응 분자들을 평형상태가 되게 하기 위해서 오랜 인큐베이션(incubation) 시간이 필요하다는 것이다. 이후에 작업 전극에 얇은 다공성막을 붙이고 CIPF 장치를 제작하여 성능상에 상당한 향상을 얻을 수 있다는 것이 발견되었다(US2009178924 (Al), Ala-Kleme et al.).

기존의 전기화학에서, 전극은 한동안 동일한 평면에 통합되었지만 이론적으로 이것은 열전자 전기화학을 사용하는 동안은 작동시킬 수 없다. 왜냐하면 HECL은 카운터 전극(Counter electrod)에 가장 가까운 작업 전극(음극)의 바깥쪽 가장자리에서만 발광되기 때문이다. 그러나 시험하는 동안 우리는 어떤 이유에서인지, 충분한 양의 전해질 용액이 든 전해셀에서 HECL이 전체 작업 전극 표면 위에 고르게 발광하는 것을 발견했다. 설사 카운터 전극들이 일반적으로 유리, 세라믹스 또는 유기고분자 같은 절연재료로 만들어진 전극칩의 동일한 평면에 배치되었다 할지라도 마찬가지였다.

Labmaster Ltd (핀란드의 투르쿠)는 거의 10년 동안 진단 스트립으로 연구하였는데, 그들이 개발한 솔루션은 생체친화성 분석을 위한 시료와 시약의 투입을 위해 플라스틱에 더해진 산화코팅된 실리콘 조각 하나와 필수 다용도 박막이 포함된 약간 단순한 장치이다. 이 스트립의 중요한 단점은 모든 실험이 도구의 셀 안에서 이루어져야 하고 이 도구의 셀은 분석 물질이 옮겨가지 않도록 각 측정과 측정 사이에 매우 주의 깊게 씻고 세척해야한다는 것이다. 그리고 도구 안에 내장된 카운터 전극의 손상 또한 문제이다.

최근에 매우 정확하고 재현가능한 전극이 있고 사용하고 난 후 버리는 카트리지라서 실제 분석에서 매우 정확한 결과를 내는 일회용 카트리지를 구성하는 방법을 우리가 발견했다(FI 20100246, S. Kulmala et al., FI 20100251, S. Kulmala et al. and FI 20100253, S. Kulmala et al.). 이들 발명의 기본은 HECL 검출에 사용하기 위해 동일한 평면에 양극과 음극을 함께 배치한 일체형 전극칩(IE칩)을 사용하거나 란탄족 킬레이트(lanthanide chelate) 표지의 EL을 일으키는데 사용되는 카본 페이스트(carbon paste)로 만든 양극과 음극 한쌍의 전극을 포함하는 전극/전극칩(EE칩)을 사용하는 것이다. IE칩과 EE칩은 주로 면역 분석이나 DNA 탐색을 위한 카트리지에서처럼 일회용 생체친화성 카트리지에 사용된다. 이제부터 IE칩과 EE칩이라는 명칭이 전극칩과 E침과 함께 사용될 것이다.

우리는 광학적으로 투명한 작업 전극과 광학적으로 투명한 카운터 전극이 HECL에 사용될 경우(M. Hakansson et al., Anal. Chim. Acta 541 (2005) 137-141.), 두 가지 분석물질을 측정할 수 있다는 것을 매우 빨리 발견하게 되었다. 그러나 하나의 도구에 두 개의 광자계수 검출기를 탑재하는 것은 너무 비용이 많이 들기 때문에, 단 하나의 광검출 장치만 사용해도 되는 전해 전지(electrolytic cell)를 발명한다면 훨씬 훌륭한 솔루션이 될 것이다. 최근에 이루어진 발명들의 문제점은 단일 광검출기(light detector)를 사용할 경우, 한 가지 분석물질(FI 20100246, S. Kulmala et al, FI 20100251, S. Kulmala et al.)이나 두 가지 분석물질만(FI 20100253, S. Kulmala et al.) 측정할 수 있다는 것이다. 본 발명은 새로이 발명된 다용도 E칩의 제조 방법과 내부 표준물질법이나 표준물질 첨가법 또는 다른 종류의 비교 방법을 사용한 다성분 측정이나 단일 성분 측정에서 그 다용도 E칩을 분석에 사용하는 방법을 개시한다. 이들 중 어떤 것이 본 발명의 신규성을 막는다고 여겨질 경우, 출원 FI 20100248, S. Kulmala et al; FI 20100246, S. Kulmala et al.; FI 20100251, S. Kulmala et al. or FI 20100253, S. Kulmala et al.에 근거하여 우선권이 주장된다.

본 발명에서는, 다용도 E칩을 조립할 수 있으며 또한 청구항 1-10에 설명된 상기에서 언급한 E칩을 포함한 1회용 HECL 및 EL 카트리지를 활용하여 CIPF 장치(US2009178924 (Al), Ala-Kleme et al.)의 사용을 상당히 향상시켰다.

도1(a) 원형 절연 지지물과 그 위에 조립된 전극들로 구성된 E칩. (1) 원형 기판, (2) 카운터 전극, (3) 작업 전극, (4) 소수성(Hydrofobic) 테이프나 점착 테이프, (5) 셀. (b) 보다 큰 디스크나 판을 직사각형 형태로 자른 E칩이며 번호는 상기와 동일. (c) 접점 패드(contact pad)를 하나의 가장자리에서 모이게 한 E칩이며 번호는 상기와 동일(때때로 측정 도구의 전자 도체 패드에 도 1 (c)에 나타난 것보다 훨씬 긴 도체 필름이 필요한 좀더 긴 E칩을 사용하는 것이 유용하다). (d) 전극 부분이 오목거울 형태인 E칩. (e) 칩을 통과하는 전자 도체가 있는 뽀족한 전극이 있는 오목거울 형태의E칩(칩의 보다 낮은 표면의 전자 접점 네트워크). (f) 칩을 통해 다수의 접촉 전극과 빛을 모아서 검출기의 감광성 영역의 중앙으로 보내는 렌즈 역할을 하는 뚜껑이 있는 E칩. (1) 기판, (2) 칩을 통과하는 작업 전극들, (3) 칩 중앙의 카운터 전극, (4) 렌즈 모양의 PDMS 뚜껑, (5) 애벌런치 포토다이오드(avalanche photodiode)나 포토멀티플라이어관(photo multiplier tube) 같은 광검출기.
도 2. E칩의 hTSH 분석에 표준물질 첨가법.
도 3. 실리콘 작업 전극들이 있는 E칩의 듀얼 면역분석.
도 4. 실리콘 작업 전극들이 있는 E칩의 듀얼 면역분석.
도 5. 선별 목적을 위한 20개 포지션의 E칩. (a) 측면도. (b) 위에서 본 그림. (1) 절연 또는 도체 지지물, (2) 지지물 상단에 붙은 진공증착이나 스퍼터드 알루미늄 필름 또는 알루미늄 호일, (3) 인쇄된 절연 테이프나 적절한 위치에 캐비티(cavity) 구멍이 있는 점착 절연 테이프를 붙여 만든 절연 필름(ca. 300 nm보다 두꺼움), (4) 칩 측면에 도체 패드가 있는 작업 전극 캐비티 둘레의 두꺼운 절연 필름 위의 실버 잉크 상단의 카본 페이스트 전극, (5) 작업 전극과 작업 전극 주변의 카운터 전극을 벗겨진 채로 남겨 두고 붙여서 시료 캐비티(cavity)의 최종 크기를 결정하는 두꺼운 고분자층, 예: E칩 상단에 부착된 두 번째 접착 테이프, 인쇄된 고분자층 또는 PDMS 칩.
도 6. 알루미큠 호일 작업 전극을 이용한 20개 포지션의 E칩을 사용한 면역분석.
도 7. 모세관으로 채워진 PDMS 챔버가 있는 실리콘 기반의 4개 포지션 E칩 카트리지. (1) 실리콘 칩, (2) 두꺼운 필드 산화막(모든 회색 영역), (3) 작업 전극 영역의 4-nm 초박형 산화 필름(모든 밝은 회색 영역), (4) 필드 산화막(검은색)의 맨 위에 도체 패드가 있는 카운터 전극, (5) 별도의 카운터 전극에 대한 전기적 접촉을 위해 열린 칩 가장자리의 PDMS 뚜껑, (6) 시료 챔버로 통하는 미세 주입로(각 시료 챔퍼당 하나씩), (7) 미세 공기 배출로(3개 중 1개만 표시함).
도 8. 실리콘 기반 4개 포지션 E칩 카트리지를 사용한 표준물질 첨가법.

본 발명에 따르면, 직접적으로나 E칩 표면의 다공성막의 도움으로 실제 면역분석 또는 DNA 하이브리드화를 실시할 때, 단순하고 저렴한 장치로 보다 복잡한 장치와 동일한 성능으로 다양한 분석을 실시할 수 있다. 따라서 앞선 장치들 보다 상당히 향상된 성능으로 한번의 분석을 통해 몇 개의 분석물질을 측정할 수 있으며, 내부 표준 물질법이나 표준물질 첨가법을 사용할 수도 있다. 게다가 측정 도구와 측정 카트리지는 포인트-오브-니드(point-of-need) 분석에 사용할 수 있을 만큼 충분히 저렴하며 완벽하게 일회용 제품으로 제조할 수 있다. 따라서 분석과 분석 사이에 분석물질이 옮겨가지 않으며, 별도의 작업 전극과 카운터 전극의 필요가 없을 없을 경우 이전의 경우저럼 카트리지를 끼워넣지 않아도 되기 때문에 일회용 분석 카트리지의 제조가 훨씬 쉬워질 것이다.

현재의 발명에서 우리는 몇 가지 다른 구성 디자인을 만들어 내었다. 첫 번째로, 모든 전극을 플라스틱, 유리, 세라믹 같은 큰 절연 기판 위에 마스크를 사용하여 단일 단계에서 진공증착이나 스퍼터링으로 제작할 수 있다. 그리고 최종적으로 양극으로 선택한 전극을 스프린 인쇄나 잉크젯 등의 방법으로 카본 페이스트로 코팅하고 마지막으로 기판을 칩으로 잘라낸다. 다른 방법으로는 2단계 또는 3단계 진공증착이나 스퍼터링 등을 실시할 수 있다. 어떤 기판은 접착층으로 최초의 크롬층을 먼저 제작한 다음 실제 전극이나 카운터 전극 재료를 크롬에 추가하는 것이 좋은 방법이다. 일부 용도에서는 크롬을 카운터 전극으로 바로 사용할 수 있다. 그런 경우, 진공 챔버에 진공 챔버의 정상적인 대기압을 가할 필요없이 다른 마스크를 더하는 것이 가장 편리하다. 그러나 시간이 충분한 경우라면 카운터 전극 영역에 두 번째 마스크를 덮고 (작업 전극 영역에는 덮지 않는다) 수동으로 알루미늄을 더하거나 높게 도핑된 실리콘을 작업 전극 영역에 추가한다. 따라서 결국 우리는 실리콘이나 알루미늄으로 만든 작업 전극 필름과 크롬으로 만든 카운터 전극을 얻게 되었다. 크롬이 그다지 질좋은 재료가 아니라고 생각된다면, 크롬을 얇은 카본 페이스트 막으로 코팅할 수 있다. 다른 방법으로는, 카운터 전극 영역만 열린 채로 두고 마스크를 세 번째 마스크와 교체하고 백금 박막을 추가하는 세 번째 제작 단계를 사용한다. 이 경우, 최종적으로 알루미늄이나 실리콘 작업 전극과 백금 카운터 전극/전극들을 얻었다.

알루미늄 전극은 산소나 공기 중에서 그냥 두기만 해도 산화되기 때문에 알루미늄 전극을 사용하는 것이 가장 편리하며, E칩은 바이오 재료를 코팅하거나 플라스틱/고분자로 만들어진 카트리지에 직접 부착하기 위해 소수결합으로(hydrofobically) 결합된 셀 영역을 제공하는 소수성 재료로 코팅할 수 있도록 준비되어 있다.

실리콘 작업 전극의 경우에, 짧은 플라스마 산화나 화학적 산화, 또는 좀 더 불편한 방법으로 실리콘의 양극 산화 중에 제작된 마지막 양극을 음극으로 사용하는 양극 산화법으로 표면을 먼저 산화시켜야한다. 다른 방법으로, 양극 펄스로 HECL를 측정하는 동안 제 위치에서 실리콘을 양극 산화시킨다.

때때로 기판 위에 크롬막을 만든 후 최상의 솔루션은 알루미늄이나 높게 도핑된 실리콘이 의도한 모든 전극 영역에 코팅되도록 하고 마지막으로 의도한 카운터 전극 영역(양극 영역)에 잉크젯 또는 스크린 프린팅을 통해 카본 페이스트 층을 입히는 것이다. 카본 페이스트 잉크 층이 모든 전극의 마지막 층이 되도록 하고자 할 때 선택할 수 있는 한 가지 좋은 방법은 카본 페이스트 층 아래의 매우 전도성이 높은 첫 번째 전도층으로 알루미늄이나 크롬만 사용하는 것이다. 알루미늄/카본 페이스트 전극은 카본 페이스트가 구멍이나 틈을 통해 전류를 누설시킬 경우 알루미늄 자체가 훌륭하게 작업 전극의 역할을 할 수 있다는 것이 장점이다. 그러나 크롬은 설사 산화된 표면을 가지고 있고 산화막이 충분히 얇다 해도 란탄족 킬레이트의 HECL나 EL을 발생시킬 수 없다.

제조 계획에 따라 기판을 적절한 단계에서 칩으로 자른다. 대개 칩으로 자르는 일은 플라스틱이나 유리로 된 절연 재료로 만든 기판 디스크에 마지막 전극 층을 덮은 후에 즉시 한다. 그러나 때때로 조각내기 전 잉크젯 원리나 프린팅 원리에 의해 작업 전극에 바이오 재료를 입히는 것이 더 나을 수 있다.

작업 전극 영역을 바이오코팅한 후에 마지막 카트리지에 자른 칩을 더하거나 보통 바닥 부분과 유체소자, 챔버, 주입구 및 배출구가 포함된 다른 반쪽을 칩의 맨 위에 더한다. 이것은 PDMS 등으로 매우 쉽게 제조할 수 있다.

특히 동일한 판에 많은 수의 작업 전극을 구성할 때는 카트리지의 상부를 렌즈 모양으로 만들거나 모든 작업 전극으로부터 광검출기로 빛을 모으는 렌즈 모양의 광학적으로 투명한 창을 포함시키는 것이 바람직하다. 검출기의 감광 영역(예: 포토멀티플라이어관의 음극 영역)이 작을 수로 검출기의 소음 수준도 더 작기 때문에, 이것은 작업 전극의 점이나 줄무늬의 수가 적을 경우에는 유리하다. 따라서 이런 렌즈형은 보다 저럼하고 소음이 적은 광검출기를 사용하는 것이 가능하다. PDMS는 일회용 카트리지에서 이런 유형의 저가 렌즈의 훌륭한 재료이다. 그러나 물론 폴리스티렌 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polystyrene polyetehenetherephtalate) 등과 같은 많은 다른 광학적으로 투명한 고분자 재료도 동일하게 사용하기에 매우 적합하다.

축광을 복수의 테스트 지점으로 스크리닝 테스트에 사용할 경우, 모든 지점을 충분히 정확하게 스캔할 수 있는 광원과 검출장치를 구성하려면 비용이 매우 많이 든다. 그 점에서 복수의 작업 전극 점이나 줄무늬와 함께 HECL와 EL를 이용한 우리의 E칩은 비용을 크게 낮추는 방법이다. 또한 축광 사용에서, 카트리지의 플라스틱은 여기광(excitation light)이 카트리지 재료를 통해 통과할 경우 UV 범위에서 광학적으로 투명한 것을 선택해야 한다. 우리의 발명에서, 카트리지 창이나 뚜껑은 발광 파장에서 시각적으로 충분히 투명하다는 것은 완전히 충분하다.

효율적인 광수집(light collection)을 위한 다른 솔루션은 처음에 E칩 기판을 오목거울 모양으로 만들어 실시예 중 하나에서 설명한 것처럼 "오목거울"의 초첨에 위치한 작은 감광 영역이 탑재된 검출기에 빛이 모이게 하는 것이다.

E칩을 만드는 다른 한 방법은 강하게 도핑한 실리콘 칩을 기판 재료로 사용하여 (i) 그 기판 위에 ca. 4nm 산화막을 작업 전극 영역에 산화막을 배치하고 (ii) 칩의 다른 부분을 먼저 두꺼운 영역 절연 실리카(silica) 층으로 코팅하며 그 맨위에 (iii) 스퍼터링이나 진공 증착법 또는 실버 잉크나 카본 페이스트 잉크 프링팅 또는 그런 방식을 결합한 층을 사용하여 카운터 전극을 구성하는 방법을 사용하는 것이다. 이 경우에 모든 작업 전극들에 대해서는 단 하나의 전자 접점만 있지만 각 카운터 전극마다 별도의 접점이 있다. 단점은 실제 사용하는 셀 디자인은 잘못된 작업 전극 영역으로 흐르는 전류를 막는다는 것이다. 이것은 서로 떨어진 각 작업 전극 챔버를 분리하는 보통 광학적으로 투명한 뚜껑을 사용해야 한다. 실리콘 기판의 사용은 스크리닝 테스트의 경우에 뛰어나며 높은 정확성과 재현성이 필요할 경우, 작업 전극점을 잉크젯이나 프린트 방식의 코팅 방법으로 바이오코팅한다.

스크리닝 테스트에서, 훌륭한 다른 방법 하나는 (i) 먼저 강하게 도핑된 실리콘 위에 두꺼운 열장 산화층(thermal field oxide)을 만든 다음, (ii) 작업 전극의 캐비티들을 애칭하고 웰(well)의 바닥에 초박형 4nm 열산화막을 형성한다. 그리고 (iii) 필드 산화막의 위에 별도의 백금이나 다른 도체 전극을 추가하고(카운터 전극) (iv) 전체 웨이퍼(wafer)의 위에 SU-8을 더한 후 시료의 캐비티에서 떨어진 SU-8를 애칭하여 단독으로 사용되는 HECL 웰(well)을 제조하는 것이다(작업 전극의 캐비티보다 충분히 커서 모든 작업 전극과 카운터 전극 쌍이 덮히지 않게 하여SU-8 이 최종적으로 단순이 올바른 카운터 전극을 선택함으로 전기 여기(electrical excitation)에 사용할 수 있는 별도의 웰들을 형성한다).

동일하게, (i) 먼저 플라스틱이나 유리 기판에 알루미늄막을 만들거나 기판에 알루미늄 호일을 붙이는 것으로 시작할 수 있다. 그리고 (ii) 의도한 만큼 작업 전극 영역을 드러난 채로 남겨두고 작업 전극 영역을 절연 고분자, 레커 또는 도막(paint film)으로 프린팅하거나 의도한 작업 전극 영역 부분에 구멍을 낸 점착테이프를 붙이는 방업으로 처리한다. 그런 다음 (iii) 두 번째 단계에서 설명한 절연 하위층에 카운터 전극을 프린팅한다. 마지막으로, (iv) 개별적으로 어드레싱할 수 있는 작업 전극-카운터 전극 쌍과 함께 최종적인 시료 캐비티를 형성하기 위해 시료의 캐비티는 다른 절연막(그러나 이전 것보다 두꺼운)을 프린팅하여 형성한다. 이것은 정확한 위치의 정확한 크기의 캐비티들이 나 있는 두꺼운 점착테이프 조각으로도 가능하다. 그러나 그것은 일반적으로 예비 테스트를 위해서는 충분하지만 큰 규모의 산출에서는 경쟁성 있는 방법이 아니다.

세 번째 방법은 미우 간단하다. 모든 전극 영역을 전도성이 충분한 카본 페이스트로 프린팅하거나 잉크젯을 통해 단일 단계로 완성한다. 카본 페이스트의 전도성이 높지 않을 경우에는 실버 잉크층이나 전도성 고분자층 같은 기타 전도성이 높은 층 등을 먼저 프린팅한 다음 굳은 전도성 높은 잉크 위에 카본 페이스트 층을 입히는 방법으로 문제를 해결할 수 있다.

다음으로 본 발명에 대해 다이어그램과 실시예 그리고 그와 연결된 그림으로 더 자세히 설명할 것이다.

실시예 1. E칩 장치의 제작과 이종의 E칩을 사용한 TSH 면역분석.

도 1은 본 발명의 몇 가지 변형된 E칩 형태를 보여준다. 어떤 경우에는 원형 플라스틱 기판(도면 1a)을 사용하는 것이 좋다. 이 방법은 또 원형 칩 가장자리의 전자 접점으로 셀 영역을 여러 개의 좁은 섹터로 편리하게 나눌 수 있는 방법이다. 그러나 일반적으로 칩들은 큰 기판이나 디스크 위에 조립되기 때문에 직사각형으로 칩을 자르는 것이 가장 편리하다. 작업 전극이 작을수록 잉크젯 도포를 사용하여 항체, 항원, 올리고뉴클레오티드 등과 같은 바이오코팅에 더 적합하다. 실제 테스트에서 우리는 상당히 큰 작업 전극점을 가지는 표본을 사용하기로 했다.

매우 작은 전극점들을(스크리닝 테스트) 비교적 큰 셀 영역에 사용할 경우, 때에 따라 몰딩, 열 엠보싱 등의 방법으로 오목거울 모양으로 만든 기판을 사용하고 광검출기를 이 거울의 초점에 위치시키는 것이 좋을 수 있다. 이런 종류의 장치의 좋은 예는 끝부분을 카본 페이스트로 코팅한 도체봉이 PDMS에 탑재된 형태이다. 이런 유형의 장치는 틀(직경 20mm) 속의 PDMS에 한다발의 알루미늄선(약간 긴 스테인리스 강봉 하나 둘레에 30개 알루미늄선)을 넣어 테스트했습니다. "오목거울"의 안쪽 표면을 기계적으로 윤을 내고 매우 매끄러운 사포로 모든 전극이 PDMS에서부터 벗겨저 드러나도록 닦은 후 마지막으로 물속에서 알루미늄 산화 슬러리로 처리한다. 그런 다음 전극을 산화되도록 하룻밤 동안 공기 중에 둔다. 1 마이크로몰 Tb(III) 킬레이트 솔루션으로 테스트할 때, 알루미늄선으로 만든 뾰족한 각 작업 전극이 작동하는 것이 관찰되었지만 CV는 12%로 "오목거울"의 모양이 완벽하지는 않다는 것이 확인되었다. PDMS와 기타 다른 종류의 고분자에 다수의 뾰족한 전극을 조립하는 간단한 방법은 먼저 칩을 통해 구멍을 만든 다음 되도록이면 충분히 전도성이 강한 카본 페이스트 잉크를 채우는 것이다. 그러나 실버 잉크 등을 사용하고 실버 잉크를 바른 칩에 카본 페이스트 전극을 배치하기 위해 마지막으로 카본 잉크로 코팅할 수도 있다. 다공성 세라믹 재료와 다공성 알루미늄 산화 필터를 이용하여 구멍에 알루미늄을 녹여 다수의 매우 작은 뾰족한 HECL 전극을 제작할 수 있으나 그렇게 쉬운 작업은 아니다.

첫 번째 생체친화성 분석 테스트에서 우리는 상당히 큰 상당히 큰 작업 전극점을 가지는 표준을 선택했다. 도면 1 (c)에 나타난 형태의 E칩은 유리 웨이퍼에 조립했다. 먼저 유리 웨이퍼를 간단히 플라스마 에칭했다. 그런 다음, 마스크(도면 1 (c)의 2와 3)를 통해 모든 전극 영역에서 크롭층(99.99%, Alpha Ventron)을 스퍼터링했다. 그리고 카운터 전극 영역(즉 작업 전극(도면 1 (c)의 3)을 가리는 다른 마스크를 통해 크롬막에서 알루미늄층(99.99 %, Alpha Ventron)을 스퍼터링했다. 다음 단계에서, 작업 전극 영역을 가리는 세 번째 마스크를 사용하여 백금을 스퍼터링했다. 즉 백금 카운터 전극을 만들었다(도 1 (c)의 2). 그리고 웨이퍼를 20mm x 20mm 크기의 사각형 조각으로 자른 후 그 칩들을 데시케이터로 옮긴다. 그리고 알루미늄 전극을 실온에서 하룻밥 동안 대기 중 산소에서 산화되도록 두었다.

E칩(도 1(c)의 5)의 셀 영역을 소수성 링을 이용하여 코팅했는데 이 소수성 링은 직경 11.0mm의 셀 영역을 한정하는 구멍이 있는 점착테이프로 만들었다. 코팅 용액(180 μL)은 MES 0.1M, H₃BO₃ 0.03M, K-시트르산염0.5mM, 0.025% 글루타르알데히드, 0.05% 보바인 감마글로불린, 항체 10μg/mL(MIT0406 MOAB 안티 hTSH Medix Biotech Inc. USA)으로 이루어진다. 실온의 플라스틱 상자에서 2시간 동안 넣어 둔 후, 코팅 용액을 흡입시키고 웰을 세척 용액(Tris-HCL 50mM, pH7.8, 0.9% NaCl, 0.09% NaN₃, 0.05% 트윈 20 함유)으로 2회 세척했다. 그런 다음 포화용액(트리즈마 베이스50mM, 0.1% BSA, 0.1 % NaN₃, 0.1% 트윈 20, pH7.5 H₂SO₄로 조정) 180μL을 추가하여 웰을 적셨다. 적신 후에 IE칩을 30°C에서 2.5 시간 동안 건조시켰다.

테르븀(III)킬레이트(Tb-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트)의 이소티오시아네이트 유도체를 실온에서 하룻밤 동안 pH 9.5, 80배 과잉 몰(molar excess)에서 반응하도록 하여 표지된 항체(단일항체 안티-hTSH, 클론 5404, 5.5mg/mL, Medix Biochemica Oy Ab)를 준비했다. 직경 1cm의 원통에 5.5cm까지 세파덱스 G-50을 채운 후, 과잉 시약으로부터 복합 단백질 분획을 분리하기 위해 세파로오스 6B를 52cm만큼 더 사용했다.

면역분석에는 다공막(두께 6-11um, 1x10⁵-6x10⁸ 구멍/cm², 와트만)을 사용했다. 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 0.05% 보바인 감마글로불린, 0.01% 트윈 20이 함유된 pH 7.7의 트리스-HC1 완충제 50 mM로 표지된 항체(0.5mL, 80 μg/mL)를 11x11mm 박막 조각에 피펫으로 떨어뜨린 후 실온에서 하룻밤 동안 건조시켰다.

시험관에서 TSH 표준용액(Wallac, DELFIA hTSH 키트, TSH 324 mlU/mL)을 희석용액(트리즈마 베이스 50mM, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, CaCl₂*H₂0 1mM, pH 7.7 HC1로 조정)으로 희석하여 표준 시료(TSH 농도 10.0, 30.0, 100.0 mlU/L)를 준비했다.

면역분석을 위해서 건조된 표지된 상태의 이차항체를 포함한 박막 조각을 전해질 용액 방울로 전해셀을 형성하도록 설계된 친수성 전극 영역에 부착시킨다. 30.0-mlU/L의 TSH 표준용액 중에서 10-μL의 시료를 피펫으로 E칩의 다공막 중앙에 떨어뜨렸다. 시료가 표지된 항체를 녹여서 박막과 전극망 사이의 캐비티를 빠르게 채웠다. 8분 후, 평형에 가까워질 만큼 면역반응이 충분히 진행되었을 때 핀셋으로 박막을 떼어냈다. E칩을 세척용액/측정용액(Na₂B₄0₇ 50mM, 0.1% NaN₃, 0.003% 트윈 20, pH 7.8, H₂S0₄로 조정)의 혼합용액으로 2회 세척했다.

그런 다음 120μL의 측정 완충제를 더한 후 펄스 발생기를 차례로 각 작업 전극으로 교체하면서 일렉트로케밀루미노미터(electrochemiluminometer)로 TR-HECL(시간 분해 HECL) 강도를 측정했다. 측정 도구는 스탠포드 리서치 도구 SR 400 광자계수기(Stanford Research Instruments SR 400 gated photon counter), 뉴클리어스 MCS 멀티스캘러 카드(Nucleus MCS multiscaler card)와 홈메이드 정전기 펄스 발생기(home made coulostatic pulse generator), 홈메이드 셀 디파트먼트(cell compartment)(검은색 플라스틱)과 퍼킨엘머 광자계수 CPM 모듈(PerkinElmer photon counting CPM module)로 구성되었다. 펄스 진폭는 -25 V였고 펄스 충전 15μC/펄스, 펄스 주파수 20Hz이었으며 TR-HECL 강도는 100 이 넘는 여기 사이클(excitation cycles)를 기록했고 지연 시간은 0.05 ms, 게이트 타임은 6.0 ms였다.

따라서 동일한 시료로부터 빠르게 5회 반복하여 측정값을 얻을 수 있었다. 시그널은 875, 814, 856, 802, 819 광자수였다. 따라서 평균은 832.2과 CV 3,7 %였다. 이런 방식으로, 각 농도당 5회 반복 측정으로 보정곡선을 빠르게 얻을 수 있었다.

도 1(e)에 따라 뽀족한 작업 전극을 배치하고 도 1(f)를 Tb(III) 킬레이트 용액으로 테스트했을 때, 평면 전극 지지물에 비하여 오목 전극 지지물을 사용할 경우 오직 미미한 향상만이 관찰되었다.

그러나 도 1 (f)에 표시된 대로 비교적 큰 PDMS 렌즈를 설치했을 때는 얼마간 더 나은 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 2. 표준물질 첨가법 사용

E칩을 실시예 1에 따라 제작했지만 그 위에 하나의 커다란 원형 구멍이 있는 점착테이프를 붙이는 대신에 정확히 작업 전극의 크기(직경 3.0mm)에 맞는 5개의 둥근 구멍이 있는 0.25mm 두께의 두께 테프론 스티커(Irpola Oy, Turku, Finland)를 붙였다.

E칩의 작업 전극 영역을 MES 0.1M, H₃BO₃ 0.03M, K-시트르산염0.5mM, 0.025% 글루타르알데히드, 0.05% 보바인 감마글로불린, 항체 10μg/mL(MIT0406 MOAB 안티 hTSH Medix Biotech Inc. USA)으로 된 코팅 용액(50μL)으로 코팅했다. 실온의 플라스틱 상자에서 1시간 동안 넣어 둔 후, 코팅 용액을 흡입시키고 점착테이프 웰을 세척 용액(Tris-HCL 50mM, pH7.8, 0.9% NaCl, 0.09% NaN₃, 0.05% 트윈 20 함유)으로 2회 세척했다. 그런 다음 포화용액(트리즈마 베이스50mM, 0.1% BSA, 0.1 % NaN₃, 0.1% 트윈 20, pH7.5 H₂SO₄로 조정) 50mM μΕ을 추가하여 웰을 적셨다. 적신 후에 E칩을 30°C에서 2.5 시간 동안 건조시켰다.

30.0mIU/L hTSH 표준용액에서 시료를 취하여 시험관에 30mL씩 5개 부분 표본으로 나누어 담았다. 그들 중에서 두 개의 부분 표본에 10.0만큼만 분석 완충제를 더한 후 혼합하고, 다음 30μL부분 표본에 3.0 μL의 324-mIU/mL hTSH 표준물질과 7.0 μL의 분석 완충제를 더한 후 혼합하고, 다음 부분 표본에 6.0μL의 324-mIU/mL hTSH 표준물질과 4.0μL의 분석 완충제를 더한 후 혼합하고, 마지막 부분 표본에 9.0μL의 324-mIU/mL hTSH 표준물질과 1.0μL의 분석 완충제를 더한 후 혼합했다. 다음으로 각 시험관에서 25μL의 시료를 취하여 1.0μL의 표지된 항체(pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5 % BSA, 0.05% 보바인 감마글로불린, 0.01% 트윈20이 함유된 50mM Tris-HC1 완충제 안에 40 μg/mL)함께 피펫으로 미니 점착테이프 웰 안에 떨어뜨렸다. 15분 동안 넣어 둔 후, 칩을 30 용액(Tris-HCL 50mM, pH 7.8, 0.09% NaN₃, 0.05% 트윈20)으로 세척하고 테잎을 떼어낸 다음 PDMS 슬라이드(최종적인 측정 셀이 있는 PDMS 칩을 관통하는 2.0mm 두께의 원형 구멍이 있음)로 교체한다. 그리고 이 PDMS 슬라이드를 E칩에 클램프로 고정하고 200μl의 측정 완충제를 첨가했다(Na₂B₄O₇ 50mM, 0.1% NaN₃, 0.003% 트윈 20, pH 7.8, H₂SO₄로 조정).

마지막으로 실시예 1에서처럼 차례로 동일한 측정 파라미터를 사용하여 각 작업 전극에서 HECL 를 측정했다.그 결과는 도 2에 제시되어 있다.

실시예 3. E칩에서 TSH과 CRP에 대한 동시 측정.

C-반응성 단백질(hCRP)과 갑상샘 자극 호르몬(hTSH)을 동시헤 측정했다. 작업 전극 중 하나를 두 가지 포착항체(catching antibodies)로 코팅하고, 두 개의 작업 전극을 hTSH-포착항체로 코팅하고, 나머지 두개를 hCRP-포착항체로 코팅했다. 안티-hTSH와 안티-hCRP를 실시예 1과 비슷하게 테르븀(III)킬레이트(Tb(III)-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트)의 이소티오시아네이트 유도체로 표지했다.

도 1 (c) 형태의 실리콘 전극이 있는 E칩을 스퍼터링으로 유리 웨이퍼에 조립하고 n 형 실리콘 웨이퍼를 도핑된 실리콘의 재료(0.005-0.018 Ω?cm 저항과 (111) 지향성, 핀란드, 오키메틱 오이)로 사용했다. 이 전극들을 하룻밤 동안 실온의 건조기의 산소에서 산화되도록 두었다. 다음으로 카운터 전극을 칩의 마스크를 통해 수동으로 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)층을 칠하고 하룻밤 동안 카본 페이스트가 굳도록 두었다.

실시예 2에서처럼 마이크로 웰을 만드는 테프론 스티커를 이용하여 일차 항체 코팅을 했다. 30μL의 안티-hTSH (안티-hTSH 30 μl에 125μg, MIT0406, Medix Biotech Inc. USA, MES 0.1M, 붕산염 0.03M, K-시트르산염0.5mM, 0.025% 글루타르알데히드, 0.05% 보바인 감마글로불린)을 선택한 각 마이크로 웰에 피펫으로 떨어뜨리고 안티-CRP 코팅(아래)을 하고 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 상기에서 언급한 것처럼 마이크로 웰 중 3개를 안티-hTSH로 코팅하고 2개를 안티-hCRP로 코팅했다. 30μL의 안티-hCRP(안티-hCRP, 6404, 필란드 Medix Biochemica Oy, 30μL에 100μg, Tris-HCl-완충제 50 mM, pH 7.8, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.05% 보바인 감마글로불린)을 아직 남아있는 마이크로 웰에 피펫으로 떨어뜨렸다. 상기에서 설명한 바와 같이 인큐베이션 시간은 2시간이었다.

그리고 마이크로 웰을 세척용액(Tris-HCl 완충제 50mM, pH 7.8, 0.9% NaCI, 0.09% NaN₃, 0.05% 트윈20)으로 2회 세척한 후 흡입기로 비웠다. 그런 다음 전극에 30 μL의 포화용액(Tris-HCl 50mM, pH 7.8, 0.05% NaN_3, 0.9% NaCI, 0,1% BSA, 6% D-솔비톨)을 피펫으로 떨어뜨려 적신 다음 45분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 마이크로 웰을 흡입기로 비우고 30°C에서 2.5시간 동안 건조시켰다.

이중 면역분석을 위해 표준용액(hCRP 0ng/ml과 hTSH 0mlU/ml (바탕용액), hTSH 10mlU/ml, hTSH 100mlU/ml, hCRP 10ng/ml, hCRP 100)을 만들었다.

면역분석 단계에서, 20μl의 20μl 표준용액을 웰2-3에 더하고, 1.0 μl 의 표지된 안티-hTSH(80 μg/ml, 클론 5404, Medix Biochemica Oy Ab, Tris-HCl 완충제 50 mM, pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 0.05% 보바인 감마글로불린, 0,01% 트윈 20, CaCl₂*H₂O 1mM)을 추가했다.

또한 20μl의 hCRP 표준용액을 웰 4-5에 더하고, 1.0μl의 Tb 킬레이트로 표지된 안티-hCRP 용액74μg/ml, Medix Biochemica Oy Ab 안티-hCRP클론 6404, pH 7.7, 0.05% NaN₃, 0.9% NaCl, 0.5% BSA, 0.05% 보바인 감마글로불린, 0,01% 트윈 20, CaCl₂*H₂O 1mM)을 추가했다. 바탕용액을 웰 1에 유사한 방법으로 더했다.

15분간의 인큐베이션 후, 웰을 측정 완충제(황산을 사용해 pH 7.8로 조정한 테트라붕산나트륨 완충제 0.05 M, 0.1% NaN₃)로 세척하고, 오리지날 테프론 스티커를 조심스럽게 떼어낸 후, 직경 11.0mm의 사용 중인 원형 셀을 남기고 점착테이프로 교체했다. 120μl의 측정 완충제를 더한 후, 측정 전에 20 양극 6V펄스(20 μC/펄스)를 작업 전극에 가하는 외에는 실시예 1에서와 동일한 측정 파라미터를 사용하여 각 전극에 대해 차례로 HECL 강도를 측정했다. 그 결과는 도 3에 제시되어 있다. 본 실시예의 실리콘 전극으로 할 때보다 실시예 1의 E칩을 테스트했을 때에 다소 나은 결과를 얻을 수 있었다.

실시예4. 카본 페이스트 전극이 있는 E칩에서 TSH와 CRP에 대한 동시 측정.

우리는 최근에 카본 페이스트 전극에서 Tb(III) 표지가 여기될 수 있으며 아래에 제시한 측정은 알려지지 않은 메커니즘에 의해 이 EL이 명확하게 음극에서 기원하는다는 사실을 확인해 주었다. 이 전극들과 이 EL의 장점은 이 전극들은 음극으로도 양극으로도 사용할 수 있기 때문에 어떤 이유로든 필요한 경우, 단일 측정 동안 두 극성을 모두 사용할 수 있다는 것이다.

이 실험에서 사용된 칩은 원래 실시예 1을 위해 제작되었다. 칩에 이미 배치되어 있는 전극들을 스크린 프린팅처럼 마스크를 통해 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)로 코팅했다. 코팅한 카본 페이스트를 실온에서 24시간 동안 굳도록 두었다.

그런 다음, 측정 완충제가 Na₂B₄O₇(pH9.2, 2x1^-4M K₂S₂O₈ 함유)이고 펄스전압이 -35 V라는 것 외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 hTSH와 hCRP에 대한 이중 면역분석을 실시했다. 그 결과는 도 4에 제시되어 있다.

실시예 5. 스크리닝을 위한 E칩.

플라스틱 칩(10 x 36mm)에 알루미늄 호일(Pirkka Vahva Alumiinifolio, Kesko Oyj, Finland)을 붙여 스크리닝 테스트를 위한 간단한 E칩을 만들었다. 마스크를 통해 책을 덮는 점착막에 실버 잉크(Bison electro G-22, Bison Inc, Netherlands)를 프린팅하여 전극 모양을 만들었다(4, 도5). 실버 잉크가 굳은 다음 동일한 마스크를 통해 이번에는 카본 페이스트(Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA)로 한 층을 더 칠했다. 이런 방법으로 카운터 전극에 스크린 프린팅한 후에, 마스크를 위치를 잡는 도구로 사용하여 코르크 드릴로 카운터 전극에 덮인 점착테이프를 통해 구멍을 조심스럽게 뚫었다(직경 3.0mm의 구멍). 그런 다음 알루미늄 호일에 점착 테이프 막을 붙이고 알루미늄 호일의 오른쪽 끝은 벗겨진 채로 두어 작업 전극에 대한 전자 접점이 되게 했다(도 5). 그리고 4mm 코르크 드릴로 만든 캐비티가 나있는 테프론 스티커(두께 0.25mm, Irpola Oy, Turku, Finland)를 이전의 점착층 위에 붙였다. 그렇게 해서 세로 0.25mm, 직경 4.0mm의 시료 캐비티를 만들었다. 이 캐비티들의 바닥에는 직경 3.0mm의 원형 작업 전극 하나가 있었고 그 전극 근처에 폭 0.5mm의 원형 카본 페이스트 카본 전극이 하나 있었다. 이 칩의 유일한 문제점은 칩을 이 전기화학 광도계의 광측정 캐비티의 정확한 위치로 옮겨야 한다는 것이었다. 즉 하나의 위치에서는 오직 두 번의 측정만이 가능하고 두 번의 측정이 끝나면 다시 적절한 위치로 칩을 옮겨야 한다는 것이다. 실제 제품에서 이런 문제는 현재 그다지 비싸지 않은 스테퍼 모터를 설치하여 쉽게 해결할 수 있다.

각기 따로 전기적으로 어드레싱 가능한 이런 종류의 캐비티는 처음에 적절한 재료로 바이오 코팅할 수 있다. 또 이런 종류의 칩은 표준물질 첨가 측정법을 활용하여 정량적 다성분 물질 측정에 사용하거나 단일 분석물질로부터 많은 수의 반복 측정 값을 얻는데도 효과적으로 사용할 수 있다. 우리의 경우에, 안티-hTSH 항체로 시료 캐비티를 코팅하고 동일한 표준용액을 사용하여 실시예 1에서처럼 hTSH 측정을 실시했지만, 지금은 별도로 두 번의 블랭크 측정(blank determinations)을 실시하고 중복 측정으로 세 개의 표준물질의 보정곡선을 만든 다음 표준물질 10mlU/L과 100 mlU/L을 1 : 1 비율로 섞어 "알려지지 않은" 시료를 만들어 내었다(즉 시료의 농도를 55 mlU/L 곧 55 μlU/mL로 했다). 이 보정곡선과 시료에 대한 측정값은 도 6에 제시되어 있다.

실시예 6. 카본 페이스트 전극쌍이 있는 스크리닝 용 E칩.

먼저, 이전의 실시예에서 사용한 것과 동일한 카본 페이스트로 알루미늄 호일 표면을 전체적으로 코팅하는 것 외에는 실시예 5와 유사한 칩을 만들었다. 따라서 별도의 캐비티에 개별적으로 어드레싱할 수 있는 카본-카본 전극쌍을 만들었다. 이들의 기능을 1.0마이크로몰의 Tb(III)-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트 용액(pH 9.2, 2xl0^-4 M K₂S₂O₈)으로 테스트했다. 펄스 전압은 -65 V, 펄스 충전은 25 μC/펄스, 펄스 주파수는 20Hz였다. TR-EL(시간 분해 전계발광) 강도는 여기 사이클를 기록했고, 지연 시간은 0.05ms, 게이트 시간은 6.0ms였다. CV는 9.2%로 관찰되었는데 핸드메이드 장치로서는 나쁘지 않았다. 전극은 원래의 EL 강도를 잃지 않고 1000 여기 사이클을 너끈히 견딜 수 있었다.

실시예 7. 실리콘 기반 E칩 카트리지에 바이오코팅을 하지 않은 전극이 필요한 HECL 에너지 전달 분석을 시뮬레이션하는 표준물질 첨가방법.

이 칩은 전도성이 높은 실리콘으로 이루어져 있다(1, 도 7). 이 칩은 열로 산화시켜 표면의 산화막이 300nm 이상의 두께가 되도록 만든다(2, 도 7). 이 필드 산화막은 카운터 전극의 금속화와 실리콘 기판 사이에서 전기절연제 역할을 한다. 이것을 작업 전극 영역에서부터 습식 에칭하여 열산화에 의해 4nm 두께의 터널링 산화를 형성한다. 도면의 좀더 어두운 회색 영역은 필드 산화막이 남아있는 곳을 가리킨다.

점착성을 높이기 위해 밑바단에 10nm 크롬층이 있고 200nm의 백금을 침전시켜 4개의 전선 형태의 카운터 전극을 만들었다(4, 도 7). 이 금속화는 시료 셀 영역에 카운터 전극을 형성하는 리프트 오프(lift-off)와 칩의 각 모서리의 도체 패드에 의해 패턴이 만들어졌다. 금속화는 도면에서 검은색으로 표시되어 있다.

칩의 뒷부분은 산화물이 없이 애칭하고 전기적 접촉을 향상시키기 위해 알루미늄으로 금속화시킨 후 칩으로 잘랐다(20 x 20 mm). PDMS 베이스를 주형에 넣어 주조하고 혼합 경화제로 굳혀 PDMS 뚜껑을 만들었다. 굳은 다음에 뚜껑의 주형을 벗겨내고 전극칩에 붙이고 시료 챔버(3, 도 7), 시료 주입로(6, 도 7), 공기 배출로(7, 도 7)을 만들었다. 도면에서 파선으로 둘러싸인 영역은 PDMS 뚜껑을 표시하고 있는데(5, 도 7), 칩 모서리의 카운터 전극의 도체 패드는 벗겨진 채로 둔다.

뚜껑 내에서, PDMS은 주입로, 배출로, 또는 시료 챔버 영역을 제외한 전극칩과 직접적으로 접촉된다. 둥근 시료 챔버 내에서(3, 도 7), 칩과 접촉하는 사각형 기둥들이 챔버의 천장을 지지한다. 시료 챔버의 용량은 15.0μL였다.

Tb(III)-2,6-bis[N,N-bis(카르복시메틸)아미노메틸]-4-벤조일페닐 킬레이트는 이 실험에서 모델 분석물질이었다. 시료의 "알려지지 않는" 분석물질의 농도는 100pM였다. 테스트에서, 첫 번째 시료 챔버는 비어있는 채로 두었고 다른 3 개의 챔버에는 1.0마이크로몰 Tb(III) 킬레이트 용액을 각각 3.0, 6.0, 9.0μL씩 피펫으로 떨어뜨린 후 뚜껑은 건조되도록 했다(즉 각 챔버에 3.0, 6.0, 9.0pmol의 킬레이트를 첨가하였다). 프레임의 E칩에 뚜껑을 씌우고 공기가 물이 스며들지 않도록 PDMS의 뚜껑과 E칩 사이를 단단히 누렀다.

PDMS-E칩의 오른쪽 가장자리와 왼쪽 가장자리를 차례로 시료 용액(Tb(III) 킬레이트 용액 100pM)에 적셔서 모세관압에 의해 주입로(6, 도 7)를 통해 유체가 4개의 시료 챔버 안으로 들어가게 했다. 챔버가 채워지면 좀더 가는 배출로를 통해 공기가 PDMS 뚜껑의 가장자리로 빠져나가게 했다(7, 도 7, 도면에는 각 챔버의 3개의 공기 배출로 중 하나만 그려져 있다).

따라서 챔버 중 하나에는 시료만 들어있고 다른 챔버에는 시료 + 표준물질이 들어있었다. 펄스 전압이 -30 V이고 펄스 충전이 20.0 μC/펄스이며 HECL이 1000 이상의 여기 사이클을 기록한다는 것 외에는 실시에 2에서처럼 첨가된 표준 물질을 녹이기 위해 8분 동안 넣어 둔 후 HECL 강도를 측정했다. 본 칩은 작업 전극 영역이 매우 크기 때문에 각 측정을 위해서 측정 챔버에서 칩의 위치를 바꾸어야 한다. 도 8은 실험에서 표준물질 첨가 그래프를 보여준다.

Claims (10)

1. 전기화학발광 분석장치로서:
   -양극 하나와 다수의 음극, 또는 다수의 음극과 하나의 양극, 또는 양극과 음극 모두 다수로 구성된 전극을 절연 재료로 만들거나 부분적으로 전도성 재료와 절연 재료로 만든 동일한 적극 지지 칩에 통합시키고,
   - 작업 전극의 재료는 도체나 강하게 도핑된 반도체로서 모두 초박형(0,5 - 50 nm) 전기 절연체층으로 덮여 있으며,
   -카운터 전극은 스퍼터링이나 진공 증착 또는 기타 표준 금속화 방법이나 전도성 잉크로 프린팅하거나 전도성 잉크에 담그는 방법을 사용하여 금속으로 만들고,
   -작업 전극과 카운터 전극은 전극칩의 다른 쪽 끝이나 칩의 모서리, 또는 칩을 관통하는 등 칩의 적당한 부분에 접촉 스트립(contact strips)이 있어서 그것을 통해 전극이 발광 측정 도구의 전자 여기(excitation electronics)와 연결될 수 있도록 되어 있고,
   -작업 전극은 장치의 음극이 되고,
   -카운터 전극은 장치의 양극이 되며,
   -여기펄스를 가하는 중이나 가한 후에, 장치 아래의 분석물질의 양에 비례하여 분석되는 시료가 발광 신호를 내는 장치.
2. 제 1항에 있어서, 작업 전극을 실리콘이나 알루미늄으로 만들고, 그 표면에 초박형 산화층(0.5-50 nm)이 포함되도록 하며, 칩의 의도한 양극 영역을 칩의 의도한 영역에 먼저 비교적 두꺼운 절연막(200 nm 이상 등급)을 더하여 만들고, 진공 증착이나 스퍼터링으로 추가의 금속막을 형성하거나 장치의 양극 영역에 전도성막을 프린팅하거나 잉크젯 인쇄 방법으로 전도성막 코팅을 성공적으로 한 장치.
3. 제 1항에 있어서, 모든 전극을 카본 페이스트로 처리하거나 실버 잉크 또는 기타 전도성 잉크로 처리하고 그 위에 카본 페이스트층을 코팅할 수 있는 장치.
4. 제1-3항에서,
   -두께가 100μm 미만인 다공성막을 전극에 가져오고,
   -분석되는 시료를 다공성막/박막에 가져오며,
   -다공성막/박막에 시료와 기타 시약을 가져와서 서로 반응하도록 하며,
   -여기펄스를 가하는 중이나 가한 후에, 장치 아래의 분석물질의 양에 비례하여 분석되는 시료가 발광 신호를 내는 장치.
5. 제1-4항에서,
   -음극들이나 음극, 그리고 양극이나 양극들이 포함된 전극칩을 모세관압, 압력 또는 흡입으로 카르리지의 캐비티에 시료가 채워지게 한 하나의 고분자 카트리지에 통합시키고,
   -시료나 희석된 시료를 칩의 캐비티를 채우는 동안 장치의 유입 캐비티에서 모든 필요한 시약을 녹이며,
   -여기펄스를 가하는 중이나 가한 후에, 장치 아래의 분석물질의 양에 비례하여 분석되는 시료가 발광 신호를 내는 장치.
6. 제1-6항에서,
   -음극(들)과 양극(들)이 포함된 전극칩을 모세관압, 압력 또는 흡입으로 카르리지의 캐비티에 시료가 채워지게 한 하나의 플라스틱 카트리지에 통합시키고,
   -뚜껑이나 카트리지 상부는 렌즈모양으로 하거나 일회용 렌즈를 뚜껑이나 카트리지의 상부에 끼워 다수의 작업 전극으로부터 빛을 모으기에 적합하고 검출기의 감광 영역으로 빛을 향하게 하며,
   -시료나 희석된 시료를 칩의 캐비티를 채우는 동안 장치의 유입 캐비티에서 모든 필요한 시약을 녹이며,
   - 전극칩의 캐비티를 여기(excitation)가 발생하기 전에 측정 완중제로 일단 세척하고,
   -여기펄스를 가하는 중이나 가한 후에, 장치 아래의 분석물질의 양에 비례하여 분석되는 시료가 발광 신호를 내는 장치.
7. 청구항 1-5 중 어떤 항에 따라 전도성 기판이나 반도체 또는 절연 기판에 도체, 반도체, 절연체를 연속되게 층으로 쌓아 양극과 음극 영역이 서로 전자접촉이 일어나지 않도록 구성하고 마음대로 전기 여기에 사용될 칩의 전극쌍을 개별적으로 선택하여 열전자 유도 전기화학발광이나 전계발광을 발생시키는데 사용할 수 있게 만든 전극칩의 전극에서 핵산 탐침 분석이나 면역분석 같은 생체친화성 분석을 실시하는 방법.
8. 청구항 1-6 중 어떤 항의 전극칩으로서 여기 작용이 일어나는 동안 전극의 극성이 최소한 한번 이상 변경되어 측정하는 동안 두 전극이 모두 양극과 음극으로 작용하는 전극칩에서 핵산 탐침 분석이나 면역분석 같은 생체체화성 분석을 실시하는 방법.
9. 전극칩을 고분자 카트리지에 완전히 끼우거나 단지 시료와 시약의 주입과 결합반응을 위한 캐비티와 분석에 사용되는 전기화학발광 표지의 여기(excitation)를 위한 열전자 유도 전기화학발광 챔버가 있는 고분자 뚜껑으로 덮은 청구항 1-6 중 어떤 항의 통합된 전극칩에서, 핵산 탐침 분석이나 면역분석 같은 생체친화성 분석을 실시하는 방법.
10. 핵산 탐침 분석이나 면역분석 같은 생체친화성 분석을 소수성을 갖게 만든 셀 영역의 전극칩에서 실시하거나 시약이나 시료의 첨가를 위한 전극의 다공성막/박막을 이용하거나 혈액세포를 제거하거나 생체친화적 반응의 속도를 올리거나 보다 단순하게 다공성막/박막의 도움 없이 소수성을 갖는 셀 영역에서 바로 실시하는 청구항 7-9 중 어떤 항의 방법.
    

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