KR102082117B1 - 육안으로 판독 가능한 입자 기반 유전자 측정 방법 및 시스템 - Google Patents

육안으로 판독 가능한 입자 기반 유전자 측정 방법 및 시스템 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 시각화 가능한 이동상 입자 및 특이적 기능기가 부착된 고정상 입자를 이용하여 간단한 방식으로 시료 내 타겟 병원체의 유전자(구체적으로 타겟 병원체의 증폭된 유전자)를 검출 또는 진단하는 방법 및 시스템이 기재된다.

Description

육안으로 판독 가능한 입자 기반 유전자 측정 방법 및 시스템{Method and System for Assaying Genome Using Visually Detectable Particles}
본 개시 내용은 시각적으로 또는 육안으로 판독 가능한 입자 기반 유전자 측정 방법 및 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 시각화 가능한 이동상 입자 및 특이적 기능기가 부착된 고정상 입자를 이용하여 간단한 방식으로 시료 내 타겟 병원체의 유전자(구체적으로, 타겟 병원체의 증폭 유전자)를 검출 또는 진단하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 주방, 주방도구, 책상, 식기 등 일상생활 속의 물건등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.
특히, 병원성 대장균 E.coli O157:H7은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.
한편, 병원체, 특히 식중독균은 일반적으로 오염된 식품을 통하여 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 병원체(특히, E.coli)의 존재 여부를 정확하게 진단할 수 있는 기술이 요구되고 있다.
이와 관련하여, 시료(예를 들면, 음식물, 식수 등) 내 병원체의 존재 유무를 진단하는 방법에 대하여 지속적으로 연구가 진행되고 있다.
일 예로서, ATP(adenosine triphosphate) 및 루시페린(luciferin)/루시페라아제(luciferase)가 반응하여 발광하는 원리를 이용하는 ATP 측정법을 들 수 있다. ATP 측정법은 발광 물질인 루시페린(Luciferin)이 ATP와 반응하여 활성화된 후에 발광 효소인 루시페라아제(luciferase)의 작용을 받아 산소에 의해 산화되면서 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 방출한다. 즉, 발광물질인 루시페린은 ATP와 결합하여 루시페린-ATP의 복합물을 형성하면서 2개의 무기인산(H3PO4) 분자를 생성하는데, 이때 루시페린은 환원형이다. 상기 반응에서 생성된 환원형 루시페린-AMP는 산소와 반응하여 산화되면서 불안정한 에너지 상태에 있게 되고, 따라서 불안정한 상태의 산화 생성물은 신속하게 분해되어 산화형 루시페린과 AMP를 생성하면서 광(hv)을 방출하게 된다. 이때 방출되는 광의 량을 측정하여 수치화할 수 있는 바, ATP는 생물의 존재를 지시하는 지표에 해당된다. 즉, 미생물이 존재하면 세포 내에 필수적으로 함유된 ATP 역시 존재하므로 광을 방출할 수 있는 것이다. 그러나, 상술한 방법은 미생물뿐만 아니라 다른 유기물을 검출할 수 있는 장점을 갖고 있으나, 음식물과 같은 샘플 내에도 소량의 ATP가 함유되어 있기 때문에 정확한 진단을 위하여는 음식물 등으로부터 유래하는 ATP를 제거하고, 검출 대상인 미생물-유래 ATP만을 측정해야 한다. 이처럼, APT 측정법 자체는 유해 미생물만을 포집하여 정확한 진단을 수행하는데 근본적인 한계를 갖고 있다.
택일적으로, DNA 및 RNA와 같은 핵산을 기반으로 하는 검출법이 널리 이용되고 있다. 상기 방법 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭 기술에 의하여 진단 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. 일반적으로, PCR은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 양 및 농도를 높이는 기술이다. 특히, PCR은 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 시료를 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 55-65℃, 72℃ 및 95℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다. 이처럼, 유전학적 분석을 기반으로 하는 임상 진단 기술은 통상적으로 박테리아(bacteria), 균류(fungus) 또는 바이러스(virus)로부터 핵산을 회수하여 증폭 반응을 수행한 다음, 다양한 검출 수단(예를 들면, 광학적, 전기화학적 또는 기계적 바이오센서 디바이스)을 이용하여 앰플리콘(amplicon) 분석을 수행하는 방식이다.
한편, 자연발생적으로 입수되는 환경 시료의 경우, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스가 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 특히, E.coli를 함유하는 환경 시료의 경우에 있어서, 진단하고자 하는 타겟 병원체가 제한된 량으로 존재하기 때문에 정확한 검출을 위하여는 시료 내 바이오물질의 핵산을 효과적으로 회수하는 것이 요구된다. 이에 대하여, 신속 정확하며 소량의 시료를 이용하여 검출할 수 있는 현장진료 테스트(point of care testing; POCT) 관련 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 POCT 기술은 현재 각종 병원, 연구기관 등에서 널리 적용되고 있는 바, 특히 높은 감도 특성을 갖고 정확한 진단이 가능한 POCT를 구현하는 것은 임상 및 상용 의료 분야에서는 주된 관심사 중 하나이다.
현재, 신규의 바이오센싱 원리가 제시되고 있으며, 바이오센싱 절차 및 장치 측면에서 POCT가 실제 활용될 수 있도록 관련 기술을 개선하고 있다. 최근 개발된 바이오센싱 원리 및 장치로 인하여 종래에 비하여 진단 신뢰성을 높일 수 있음에도 불구하고, 전체 바이오센싱 프로세스를 정확하게 수행하기 위하여는 복잡한 실험 방법 및 숙련된 전문가에 의한 수행이 요구되므로 여전히 병원 및 연구 설비 수준에서 이루어지고 있는 실정이다. 이러한 높은 기술 수준이 필요한 바이오센서는 일반 환자 및 사용자에게는 접근이 용이하지 않은 한계를 갖고 있다(Mabey et al., 2004; Peeling and Mabey, 2010). 따라서, 다수의 연구자들이 실용적인 POCT 디바이스를 개발하기 위한 연구를 활발히 진행하고 있다.
이처럼, 복잡한 바이오센싱 시스템의 간편화 및 비용 절감과 관련한 이슈로 인하여, 간편한 검출 원리가 필수적으로 요구되고 있다. 그러나, 일반적으로, 분자 진단기술을 분석하기 위하여는 타겟-특이적인 광 소스, 필터, 프리즘 및 시각화 디바이스와 관련된 형광 및 비색(colorimetric) 원리가 사용되고 있으며, 이러한 방법들은 복잡한 방법 및 설비를 요구하고 있어 진단 편의성을 개선할 필요성이 있다.
본 개시 내용에 따른 구체예에서는 육안 검출이 가능한 분석 원리를 기반으로 하여 시료 내 병원체(예를 들면, 식중독 균)를 간편하면서도 정확하게 현장 진단이 가능한 방법 및 시스템(또는 플랫폼)을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 제1 면에 따르면,
시각적 확인(identification)이 가능하고, 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 복수의 이동상(mobile phase) 입자; 및
상기 제1 기능기-함유 성분과 결합능을 갖는 화학적 기능기에 의하여 활성화된 복수의 고정상(stationary phase) 입자;
를 포함하고,
여기서, 상기 제1 기능기-함유 성분은 타겟 병원체의 유전자에 특이적인 프라이머와 접합된 제2 기능기-함유 성분과 바인딩 특성을 갖되, 상기 제2 기능기-함유 성분이 프라이머를 통하여 증폭된 타겟 병원체의 유전자와 접합되어 있는 경우에는 입체 장애로 인하여 상기 이동상 입자와 상기 고정상 입자 간의 바인딩이 억제되며, 그리고
상기 고정상 입자에 바인딩되지 않은 이동상 입자는 물리적 수단에 의하여 분리되고, 상기 분리된 상태의 이동상 입자를 시각적으로 확인 가능하도록 구성된 병원체의 진단 시스템이 제공된다.
본 개시 내용의 제2 면에 따르면,
a) 시각적 확인(identification)이 가능하고, 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 복수의 이동상(mobile phase) 입자를 제공하는 단계;
b) 상기 단계 a)와는 별도로, 제1 기능기-함유 성분에 바인딩 특성을 갖는 제2 기능기-함유 성분과 접합된 프라이머를 이용하여 시료 내 타겟 병원체의 유전자를 증폭함으로써 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자를 얻는 단계;
c) 상기 제1 기능기-함유 성분과 결합능을 갖는 화학적 기능기에 의하여 활성화된 복수의 고정상(stationary phase) 입자가 충진된 컬럼에, (i) 상기 복수의 수식된 이동상 입자, 및 (ii) 상기 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자를 첨가하는 단계;
d) 상기 단계 c)에서 (i) 상기 수식된 이동상 입자 및 (ii) 상기 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체가 첨가된 컬럼에 대한 원심 분리를 수행하는 단계;
를 포함하는 병원체의 진단 방법으로서,
여기서, 상기 제2 기능기-함유 성분으로 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자에 의한 입체 장애로 인하여 상기 이동상 입자와 상기 고정상 입자 간의 바인딩이 억제되며, 그리고
상기 고정상 입자에 바인딩되지 않은 이동상 입자는 원심 분리에 의하여 분리되고, 상기 분리된 상태의 이동상 입자를 시각적으로 확인하는 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 삽입 물질을 상기 증폭 유전자 내에 삽입하여 상기 증폭 유전자의 강성을 높임으로써 증가된 입체 장애를 제공할 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에 따른 기능화된 인터페이스를 통한 입자-기반의 DNA 선택적 운반에 의하여 병원체를 진단하는 방법 및 시스템은 간단한 물리적 분리 수단 또는 조작을 이용하여 현장에서 시료 내 타겟 병원체의 양성/음성을 육안으로도 간편하면서도 정확하게 판정할 수 있는 신규 플랫폼을 제공할 수 있다. 특히, 종래에는 형광을 이용한 측정법 또는 전기영동을 이용한 방법이 일반적으로 사용되고 있는 바, 이들 방식을 수행하는데 이용되는 장치의 규모 및 절차가 복잡하고 측정 시간이 길기 때문에 주로 병원 및 연구소 등에서 사용되고 있으나, 본 개시 내용의 구체예에 따른 방법 및 시스템은 간단한 물리적 수단, 구체적으로 원심분리를 통하여 단시간(예를 들면, 약 2분 내)에 진단이 가능하므로 종래의 방법에 비하여 신속하고 간편하게 특정 병원체에 대한 진단을 수행할 수 있는 장점을 갖는다.
따라서, 향후 임상 진단, 환경 모니터링 등의 다양한 분야에서 광범위한 활용이 기대된다.
도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 기능화된 인터페이스를 통한 입자-기반의 유전자의 선택적 운반에 의하여 병원체를 진단하는 일련의 절차를 예시적으로 도시하는 도면이고;
도 2는 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 고정상 입자의 활성화를 위한 화학적 기능기로 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 사용하는 경우에 있어서 진단 시스템을 구성하는 요소를 도시하는 도면이고;
도 3은 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 고정상 입자의 활성화를 위한 화학적 기능기로 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 사용하는 경우에 있어서 진단 원리를 도시하는 도면이고;
도 4는 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 기능화된 인터페이스를 통한 입자-기반의 유전자의 선택적 운반에 의하여 병원체를 진단하는 방법을 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 5a 및 도 5b 각각은 양성 테스트 및 음성 테스트 결과를 나타내는 사진이고;
도 6은 실시예에 따른 진단 시스템의 E. Coli O157:H7에 대한 검출 한계를 평가하기 위한 실험 결과 및 전기영동 테스트 결과를 나타내는 도면이고;
도 7은 실시예에 따른 진단 시스템의 E. Coli O157:H7를 함유하는 우유 시료에 대한 진단 분석 결과를 나타내는 도면이고;
도 8은 실시예에서 자성 입자(MP) 단독, 자성 입자에 증폭된 유전자가 접합된 상태(MP+DNA), 그리고 자성 입자에 GelRed가 삽입되어 증폭된 유전자가 접합된 상태(MP+DNA+GelRed) 각각에 대한 DLS(dynamic light scattering) 사이즈를 보여주는 그래프이고;
도 9a는 GelRed 희석 인자(dilution factor)에 따른 삽입 염료(GelRed)의 농도 최적화 실험 결과를 나타내는 사진이고; 그리고
도 9b는 원심 분리 중 회전 속도의 최적화 실험 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"바인딩(binding)"은 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.
"시료"는 검출하고자 하는 타겟 병원체를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.
"프라이머"는 상보적 스트랜드의 합성이 폴리머라아제에 의하여 촉매화되는 조건 하에 있는 경우, 상보적 스트랜드를 따라 핵산의 합성 또는 복제 초기 지점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드(합성 또는 천연)를 의미할 수 있다.
"타겟 유전자"는 수개, 수백 개, 수천 개 또는 수백만 개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 또한 DNA, RNA 등의 절편(fragment)도 해당될 수 있다.
"용해(lysis)"는 세포의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전 단계에서 핵산을 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.
"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.
"증폭(amplification)"은 주형 분자의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 반응을 의미할 수 있다.
"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
전체적인 개시 내용
도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 기능화된 인터페이스를 통한 입자-기반의 유전자(특히 증폭 DNA)의 선택적 운반에 의하여 병원체를 진단하는 일련의 절차를 예시적으로 도시한다. 또한, 도 2 및 도 3 각각은 고정상 입자의 활성화를 위한 화학적 기능기로 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 사용하는 경우에 있어서 진단 시스템의 구성 요소 및 진단 원리를 개략적으로 도시한다.
상기 도면을 참조하면, 일 구체예에 따른 진단 시스템(10)은 크게 활성화된 복수의 고정상 입자(2) 및 시각적 확인 또는 인식이 가능하고, 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 복수의 이동상 입자(3)를 포함한다. 이때, 진단은 용기(1) 내에서 수행될 수 있는 바, 상기 용기(1)는 가급적 외부에서 육안으로 관찰 가능한 특성을 갖는 재질, 구체적으로 투명성 재질로 구성될 수 있다. 일 예로서, 용기(1)의 재질은 투명성 고분자, 글라스 등일 수 있는 바, 본 발명은 반드시 이에 한정되지 않는다.
도시된 바와 같이, 복수의 활성화된 고정상 입자(2)는 각각 매트릭스 입자(11) 상에 특정 화학적 기능기(12)가 부착되어 활성화된 형태로서, 용기(1) 내에 충진(또는 팩킹)되어 컬럼 형태로 적용될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 매트릭스 입자(11)는 수지, 금속 및 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재질로 이루어질 수 있다. 이와 관련하여, 수지를 사용할 경우, 각종 천연수지(예를 들면, 아가로오스) 또는 합성수지(예를 들면, 폴리스티렌)를 사용할 수 있으며, 또한 수지 성형물, 겔 등의 형태로 적용될 수 있다. 또한, 매트릭스 입자(11)는 정형(예를 들면, 구형, 타원형 등) 또는 비정형 형상을 가질 수 있고, 또한 대칭 또는 비대칭 형상을 가질 수 있다. 보다 전형적으로, 구체일 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 매트릭스 입자(11)는 다공성 구조, 구체적으로 균일한 다공성 구조를 가질 수 있는 바, 전형적으로는 매트릭스 입자 내에 플로우 포어를 갖는 것일 수 있다. 이때, 다공성 매트릭스 입자의 포어 사이즈(직경)는, 예를 들면 약 20 내지 100 nm, 구체적으로 약 30 내지 80 nm, 보다 구체적으로 약 40 내지 60 nm 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다.
이외에도, 고정상 입자(2)의 사이즈(직경)는, 매트릭스 입자의 재질, 형상 등에 따라 변화 가능하며, 예를 들면 수 내지 수백 ㎛, 구체적으로 약 30 내지 400 ㎛, 보다 구체적으로 약 40 내지 250 ㎛, 특히 구체적으로 약 45 내지 200 ㎛ 범위일 수 있다. 다만, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 매트릭스 입자(11)는 가교된 비드 형상의 아가로오스 겔일 수 있는 바, 아가로오스는 폴리사카라이드(하전 및/또는 중성)계 물질로 알려져 있다. 이때, 겔 내의 아가로오스의 함량은, 예를 들면 약 1 내지 10 중량%, 구체적으로 약 2 내지 6 중량%, 보다 구체적으로 약 3 내지 5 중량% 범위일 수 있는 바, 하기 일반식 1로 표시되는 반복 단위를 가질 수 있다.
[일반식 1]
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한편, 예시적 구체예에 있어서, 화학적 기능기는 매트릭스 입자의 표면에 부착 또는 결합될 수 있는 것으로서 제1 기능기-함유 성분과 결합하거나 커플링(예를 들면, 공유결합 등)할 수 있는 한, 다양한 종류로부터 선정될 수 있다.
이와 관련하여, 상술한 화학적 기능기로서 대표적으로 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 적용할 수 있다. 택일적으로, 아민기, 카르복시기, 히드록시기, 실란올기(예를 들면, 메톡시기, 에톡시기 등), 말레이미드기, 티올기, 알데히드기, PEG(polyethylene glycol) 등으로부터 선택되는 적어도 하나의 모이티를 갖는 기능기를 적용할 수 있다. 이러한 화학적 기능기를 이용하여 매트릭스 입자를 활성화시킬 수 있으나, 이는 제1 기능기-함유 성분에 따라 다양하게 변경할 수 있기 때문에 예시적으로 이해될 수 있을 것이다.
한편, 도 2에 도시된 바와 같이 복수의 이동상 입자(3)는, 베이스 입자(구체적으로, 비드 또는 구형의 입자; 13)가 제1 기능기-함유 성분(14)으로 수식된 형태일 수 있다. 이때, 베이스 입자(13)는, 시각적 확인이 가능한, 구체적으로 육안으로 식별 가능한 색을 갖는 한, 다양한 재질의 비드를 사용할 수 있다. 베이스 입자(13)의 예로서 자성 입자(자성 비드), 폴리스티렌 비드, 금 나노입자, 금속 입자, 글라스 비드, 실리카 비드 등으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 다만, 베이스 입자(13)는 후술하는 물리적 분리(구체적으로 원심분리) 과정에서 분리 효율성을 높이기 위하여 일정 수준 이상의 밀도를 갖는 것이 바람직할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.01 내지 10 g/L, 구체적으로 약 0.5 내지 5 g/L, 보다 구체적으로 약 1 내지 2 g/L 범위일 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적 구체예에 따르면, 베이스 입자(13)로서 자성 입자를 사용할 수 있는 바, 일시적 또는 영구적 자성을 나타낼 수 있다. 자성 입자로서, 예를 들면 철, 코발트, 니켈, 산화철, 수산화철 및/또는 기타 철 합금을 함유하는 자성 입자, 희토류 자성 입자 등을 사용할 수 있다. 택일적으로, 자성 철 코어를 고분자(예를 들면, 덱스트란)로 코팅한 입자를 사용할 수 있다.
베이스 입자(13)의 사이즈는 특정 범위로 한정되는 것은 아니지만, 전형적으로 나노스케일에서 마이크론 스케일 범위 내일 수 있는 바, 예를 들면 약 0.01 내지 10 ㎛, 구체적으로 0.1 내지 6 ㎛, 보다 구체적으로 1 내지 3 ㎛ 범위일 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 입자(13) 사이즈 분포는 가급적 단일분산성을 갖는 것이 향후 물리적 분리(구체적으로 원심분리)의 효율성 및/또는 진단 정확도 확보에 있어서 유리할 수 있다.
도시된 바와 같이, 이동상 입자(3)는 베이스 입자(13)가 제1 기능기-함유 성분(14)으로 수식되어 있다. 이때, 제1 기능기-함유 성분(14)은 후술하는 제2 기능기-함유 성분(15)과 바인딩 특성(즉, 높은 친화성(affinity))을 갖는 종류일 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 제1 기능기-함유 성분(14)은, 예를 들면 아비딘, 스트렙트아비딘, 바이오틴, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 아민, 카르복시, 알데하이드, 유전자(예를 들면, 상보적 결합이 가능한 DNA) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 기능기-함유 성분(14)은 바이오물질로서 아비딘 및/또는 스트렙트아비딘일 수 있는 바, 아비딘은 작은 사이즈의 수용성 바이오틴과 높은 친화성을 갖는 당단백질(glycoprotein)에 해당하며, 스트렙트아비딘은 박테리아 Streptomyces avidinii로부터 분리된 단백질로서 역시 바이오틴에 대한 친화성이 높은 성분이며, 특히 당단백질에 해당되지 않기 때문에 렉틴과 바인딩되지 않고, 또한 물리적 특성 면에서 아비딘보다 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 고정상 입자(2)에서 화학적 기능기(12)로서 NHS를 사용하고, 제1 기능기-함유 성분(14)으로서 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용할 경우에는 NHS와 아비딘의 아민기 간의 이미드 결합이 이루어질 수 있다.
기능화된 이동상 입자(3)는 활성화된 고정상 입자(2)의 컬럼에 첨가(또는 로딩)될 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 기능화된 이동상 입자(3)는, 예를 들면 액상 매질, 구체적으로 수계 매질 내에 분산된 형태(구체적으로 서스펜션)로 첨가될 수 있다. 이때, 서스펜션 내 이동상 입자(3)의 농도는, 예를 들면 약 1 내지 30 mg/mL, 구체적으로 약 5 내지 20 mg/mL, 보다 구체적으로 약 8 내지 15 mg/mL 범위일 수 있다. 또한, 이동상의 이동효율을 위하여 PBS 등을 더 첨가할 수 있다.
이때, 타겟 병원체의 유전자를 진단하기 위하여, 이동상 입자(2)와 함께(예를 들면, 혼합물 형태로) 또는 별도로 제2 기능기-함유 성분과 프라이머의 접합체(음성인 경우) 또는 프라이머를 통하여 증폭된 유전자(양성인 경우)의 접합체가 첨가될 수 있다. 이때, 제2 기능기-함유 성분(15)은 전술한 제1 기능기-함유 성분(14)과 바인딩 특성을 갖는 종류에서 선택할 수 있는 바, 이와 유사하게 아비딘, 스트렙트아비딘, 바이오틴, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 아민, 카르복시, 알데하이드, 유전자(예를 들면, 상보적 결합이 가능한 DNA) 등을 사용할 수 있다. 다만, 제1 기능기-함유 성분(14) 및 제2 기능기-함유 성분(15)은 서로 상이한 종류일 수 있는 바, 예시적 구체예에서는 제1 기능기-함유 성분(14)으로 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하고, 제2 기능기-함유 성분(15)으로 바이오틴을 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 바이오틴은 비타민의 일종으로, 구체적으로 테트라하이드로티오펜 고리와 융합된 우레이도(테트라하이드로이미디잘론) 고리로 이루어지는 B-착체 비타민(hexahydro-2-oxo-lH-thieno[3,4-d]imidazoline-4-valeric acid)으로, 분자량은 약 244 g/mol이며, 테트라하이드로티오펜 고리의 탄소 원자 중 하나에 발레르산 치환기가 부착되어 있다. 바이오틴은 아비딘 또는 스트렙트아비딘과 강한 친화성에 의하여 특이적으로 결합할 수 있는 바, 예를 들면 1개의 스트렙타비딘 분자에 4개의 바이오틴 분자가 결합할 수 있다.
택일적 구체예에 따르면, 제1 기능기-함유 성분(14)이 입자(13) 상에 수식된 형태로 시판 중인 제품을 사용할 수도 있는 바, 예를 들면 Life Science사의 수식된 자성 입자인 상품명 Dynabeadsㄾ Myone™ Streptavidin C1 등을 적용할 수 있다.
이외에도, 제1 기능기-함유 성분(14)과 제2 기능기-함유 성분(15) 간의 바인딩은 항원-항체 간의 면역 반응, 비공유 결합, 유전자간 상보결합 등을 이용하여 달성될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 제2 기능기-함유 성분(15)은 타겟 병원체의 유전자에 특이적인 프라이머(16)와 접합되어 있으며, 이러한 접합체의 존재 하에서 시료에 대한 증폭 과정을 거치게 된다.
이와 관련하여, 타겟 병원체는, 전형적으로 박테리아, 바이러스 등의 바이오물질로서, 그람-양성균 및 그람-음성균을 포함할 수 있는 바, 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytognes 등일 수 있다.
한편, 증폭 반응은 타겟 병원체의 유전자(구체적으로, DNA)이 고정된 기재를 증폭용 혼합물(즉, PCR 혼합물) 내에 침지(immersion)시키는데, 이때 고정된 핵산은 증폭 과정 중 고온에 노출되어 분리되고, 유전 서열은 복제 준비 상태에 있게 된다. 증폭 반응을 위하여, 전술한 바와 같이 PCR(DNA 증폭 방식), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; RNA를 이용한 등온 조건 하에서의 증폭 방식) 등과 같이 당업계에서 공지된 임의의 증폭 기술을 활용할 수 있다. 예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제593687호 등에 기재되어 있고, NASBA 방식은 EP 0 329 822 B1, 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. 또한, PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR, 등온-PCR 등을 예시할 수 있다.
이때, 시료 내에 타겟 병원체가 존재하여 증폭된 경우(양성인 경우)에는 제2 기능기-함유 성분(15)은 프라이머의 작용에 의하여 타겟 병원체의 유전자가 증폭되고, 결과적으로 제2 기능기-함유 성분(15)은 타겟 병원체의 증폭 유전자(17)와 접합된 상태에 있게 된다.
이처럼, 제2 기능기-함유 성분(15)과 접합된 프라이머를 통하여 증폭된 타겟 병원체의 유전자는 증폭 전에 비하여 긴 사슬을 갖게 된다. 이때, 이동상 입자(3) 상의 제1 기능기-함유 성분(14)은 타겟 병원체의 증폭 유전자(17)와 접합된 제2 기능기-함유 성분과의 강한 바인딩 특성으로 인하여 결과적으로 이동상 입자(3)에 고정되고, 그 결과 이동상 입자(3)의 사이즈(직경)가 증가하게 된다. 이와 같이 증가된 사이즈로 인하여 고정상 입자(2)와의 결합 또는 바인딩을 방해하는 입체 장애 효과가 유발된다. 이와 관련하여, DLS(dynamic light scattering)에 의한 측정 기준으로, 이동상 입자(3) 상에 부착되는 증폭 유전자의 사이즈는, 예를 들면 약 10 내지 150 nm, 구체적으로 약 30 내지 100 nm, 보다 구체적으로 약 50 내지 80 nm 범위일 수 있는 바, 이와 같이 벌키한 증폭 유전자 부착에 의하여 이동상 입자의 사이즈는 입체 장애 또는 공간 방해 효과를 제공할 수 있는 수준으로 증가하게 된다. 다만, 이러한 사이즈 증가 정도는 베이스 입자(13)의 종류, 증폭 반응의 정도 등에 따라 상이할 수 있는 만큼, 예시적인 의미로 이해될 수 있다.
반면, 시료 내에 타겟 병원체가 존재하지 않을 경우(음성인 경우), 이동상 입자(3) 상의 제1 기능기-함유 성분(14) 중 일부가 제2 기능기-함유 성분(15)과 프라이머(16)의 접합체와 바인딩되는 한편, 나머지 일부는 고정상 입자(2)에 존재하는 화학적 기능기와 결합(예를 들면, 공유 결합)됨으로써, 결과적으로 이동상 입자(3)가 고정상 입자(2)에 고정된 상태에 있게 된다.
이후, 고정상 입자(2)와 이동상 입자(3)는 물리적 수단에 의한 분리 조작 단계를 거칠 수 있는 바, 대표적인 물리적 분리 수단으로서 원심분리, 물리압착 등을 예시할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 구체예의 경우, 간편한 조작에 의한 진단 과정을 수행할 수 있도록 하는 만큼, 원심 분리 방식을 적용하는 것이 유리할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 원심 분리 조건은 진단 시스템 내의 컬럼 구조에 영향을 억제하면서 고정상 입자(2)에 결합되지 않은 이동상 입자(3)만을 원심력에 의하여 용기 하부로 운반할 수 있는 정도이면 충분할 수 있다. 이와 관련하여, 원심 분리 과정에서 회전 속도는 고정상 컬럼의 길이, 반경 등에 따라 변화 가능한 바, 예를 들면 약 500 내지 1500 rpm, 구체적으로 약 600 내지 1400 rpm, 보다 구체적으로 약 800 내지 1200 rpm 범위 내에서 적절히 조절 가능하며, 또한 원심 분리 시간은, 중력 가속도 등을 고려하여 정하여질 수 있는 바, 예를 들면 약 0.5 내지 5분, 구체적으로 약 1 내지 4분, 보다 구체적으로 약 1.5 내지 3분 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다. 다만, 상술한 원심분리는 필요에 따라 1회 이상 반복 수행할 수도 있다.
이처럼, 증폭된 타겟 병원체의 유전자와 결합된 이동상 입자(3)는 이의 표면에 존재하는 제1 기능기-함유 성분과 접합된 증폭 유전자에 의하여 공간적으로 고정상 입자(2)와 이격된 상태에 있는 경향을 나타내므로 고정상 입자(2)와는 결합하지 않게 된다. 따라서, 원심 분리 과정에서 복수의 고정상 입자(2)의 컬럼을 통과하면서 하측, 예를 들면 컬럼의 바닥까지 이동하여 침전될 수 있다.
그 결과, 육안으로 이동상 입자(3)의 침전을 확인 또는 식별할 수 있으며, 이 경우 양성으로 판정할 수 있다. 반면, 시료가 타겟 병원체의 유전자를 함유하지 않을 경우, 이동상 입자(3)는 고정상 입자(2)와 결합되어 있기 때문에 원심 분리에 의하여도 고정상 입자의 컬럼 내, 구체적으로 고정상 입자의 컬럼 상부에 분포하게 되며, 이를 육안으로 확인할 수 있다. 이 경우는 음성으로 판단할 수 있다.
한편, 본 개시 내용의 다른 구체예에 따르면, 증폭 반응 시 또는 증폭 반응 후 삽입 물질, 구체적으로 삽입 염료를 사용하여 증폭된 유전자 사슬에 강직성을 추가적으로 부여함으로써 증폭된 유전자와 결합된 이동상 입자(3)의 직경을 실질적으로 증가시켜 보다 큰 입체 장애 효과를 제공할 수 있다.
특히, 타겟 유전자가 DNA(구체적으로 이중 스트랜드 DNA)인 경우, 증폭 과정 또는 후에 이중나선 구조 내에 해당 삽입 물질 또는 삽입 염료가 삽입되어 증가된 강성을 나타내는 만큼, 증폭된 유전자 사슬로 인한 직경 증가 정도가 더욱 현저하다.
예시적 구체예에 따르면, 증폭 단계에 앞서, 증폭 과정 중 또는 증폭 반응 후에 삽입 물질 또는 삽입 염료가 증폭 혼합물 또는 증폭 생성물과 혼합되거나 이에첨가될 수 있다. 이때, 증폭 대상이 이중 스트랜드 DNA인 경우, 삽입 염료는 이중 스트랜드 DNA(dsDNA) 사이에 삽입될 수 있다.
삽입 염료는 증폭 과정 또는 증폭 후에 유전자(구체적으로 DNA)의 이중 스트랜드 내로 삽입 가능한 염료로서, GelRed, EtBr(ethidium bromide), GelGreen, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등을 포함할 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 염료 중 이중나선 유전자에 대한 특이적 반응성을 갖는 종류를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기의 점을 고려할 때, 삽입 염료로서 GelRed를 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 상술한 삽입 물질로 한정되는 것은 아니며, 증폭 반응 과정 또는 증폭 생성물의 이중 스트랜드에 삽입되어 증폭 유전자 사슬의 강성을 증가시킬 수 있는 한, 다양한 종류를 사용할 수도 있다. 이외에도, 삽입 물질은 액상 매질, 구체적으로 수계 매질에 용해(희석)된 상태로 적용 가능하다. 예시적으로, 희석된 매질(용액) 내 삽입 물질의 농도는, 예를 들면 약 6 내지 19x, 구체적으로 약 7 내지 18x, 보다 구체적으로 약 8 내지 15x 범위일 수 있다. 다만, 삽입 물질의 농도 범위는 타겟 병원체(구체적으로 박테리아, 바이러스 등)의 종류에 따라 가변적인 만큼, 반드시 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.
또한, 삽입 물질에 대한 증폭 생성물(증폭 혼합물 내에 유전자가 함유된 경우)의 체적 비는, 예를 들면 약 2 내지 8, 구체적으로 약 3 내지 6, 보다 구체적으로 약 3.5 내지 5의 범위 내에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 이해될 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 물질의 사용량이 지나치게 많은 경우에는 응집 반응 등이 유발되어 의도하는 유전자 사슬 내 삽입이 곤란할 수 있는 반면, 삽입 물질의 사용량이 지나치게 낮은 경우에는 원하는 강성 증가 효과 및/또는 추가적인 색상 또는 형광 발현 효과를 나타내기 곤란한 만큼, 전술한 범위 내에서 적절히 조절하여 사용하는 것이 유리할 수 있다.
이와 같이, 타겟 병원체의 증폭 유전자 내에 삽입 물질이 혼입(삽입)되고, 유전자 사슬의 강성이 커짐에 따라 삽입되지 않는 경우에 비하여 측정되는 접합체의 직경이 증가하게 된다. 따라서, 보다 높은 입체 장애를 부여할 수 있고, 이는 시료 내에 병원체가 존재하는 경우(양성인 경우), 이동상 입자(3)가 원심 분리 등과 같은 물리적 수단에 의하여 신속하게 분리되어 이동함으로써 육안 식별을 더욱 용이하게 할 수 있다. 예시적으로, DLS에 의한 측정 기준으로, 삽입 물질의 혼입(삽입) 없이 이동상 입자에 부착된 증폭 유전자의 사이즈에 비하여 삽입 물질의 혼입(삽입) 후 이동상 입자에 부착된 증폭 유전자의 사이즈 증가율은, 예를 들면 적어도 약 20%, 구체적으로 약 30 내지 80%, 보다 구체적으로 약 40 내지 50%의 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 개시 내용의 구체예에 따른 진단 시스템 및 방법은, 간단한 물리적 분리 조작(구체적으로 원심력만을 이용함)에 의하여 현장에서 육안으로 양성 및 음성을 판정할 수 있다. 특히, 형광 또는 전기영동 기반의 종래 방법이 갖는 문제점(즉, 양호한 민감도를 갖고 있으나, 장치 규모 및 절차가 복잡하고 상대적으로 긴 진단 시간을 요함)을 완화할 수 있고, 식중독 균 등의 병원체에 의한 감염을 현장에서 신속하게 진단할 수 있다.
이와 관련하여, 예시적 구체예에 따른 진단 시스템은, 예를 들면 약 10 내지 106 CFU/mL, 심지어 1.0 × 101 CFU 수준의 낮은 검출 한계(LOD)를 가질 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
더 나아가, 삽입 물질을 이용할 경우, 타겟 병원체의 증폭된 유전자와 이동상 입자의 접합 시 증폭 유전자 사슬의 강성을 증가시켜 입체 장애에 따른 이동상 입자의 분리 효율을 추가적으로 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
A. 물질 및 장치
본 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다:
- The N-Hydroxysuccinimidyl sepharoseㄾ 4 Fast Flow (4B)는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다(Cat # H 8280).
- 자성입자(Dynabeads® Myone™ Streptavidin C1)는 미국 Life Science사로부터 구입하였다(Cat #65001).
- 테스트 튜브로서 Axygen, Cat # AXY-MCT-060를 사용하였다.
- PCR 혼합물로서 Qiagen HotStartTaq® Plus Master Mix Kit를 사용하였다(Valencia, USA,Cat # 203643).
- 수식된 프라이머 합성물은 Bioneer(Daejeon, Korea)로부터 구입하였다.
- GelRed™ Nucleic Acid Gel stain(10,000X)은 Biotium으로부터 구입하였다(Cat # 41002)
- 원심분리기는 Hanil사(Combi-514R)로부터 구입하여 사용하였다.
- DLS은 Malvern로부터 구입하여 사용하였다(Zetasizer nano zs).
- NMR 또는 IR, Quick Exrtact™ DNA 추출 용액 1.0은 상품명 Epicentri® (Cat # QE09050, USA)를 사용하였다.
- PBS 완충액은 Gibco사 제품(Cat #70013-032)을 4℃에서 저장하여 사용하였다.
- PCR 장치로서 C1000 Touch™ thermal cycler PCR System (Bio-rad, CA, USA)을 사용하였다.
B. 실험 절차
E.coli O157:H7 제조 및 DNA 추출
E.coli는 Luria-Bertani (LB) 배지 내에 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 콜로니 계수 기법(colony counting method)을 이용하여 E.coli의 CFU(colony forming unit)를 확인하였다. E.coli는 원심분리기(13000 rpm)을 이용하여 테스트 튜브 내에서 수집하였고, Quick Exrtact™ DNA 추출 용액 1.0을 이용하여 98℃에서 15분에 걸쳐 E.coli 펠렛으로부터 DNA를 추출하였다.
E.coli O157:H7 에 대한 PCR 반응
타겟 DNA 앰플리콘을 신속하게 시각적으로 확인하는 개념에 대한 증명을 위하여, E.coli에 대한 PCR을 수행하였다. 프라이머는 stx 2 gene DNA (ref)에 기반하여 설계하였다. 역방향 프라이머는 염기서열의 5' 말단에서 Cy3으로 라벨링하였다. 바이오틴은 정방향 프라이머의 5' 말단에서 라벨링되어 스트렙트아비딘-라벨링된 자성 비드에 의하여 포획될 수 있도록 하였다. 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 염기서열 각각은 하기 표 1과 같다.
프라이머 염기서열
정방향 5′-GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA-3′
역방향 5′-TGT TGC CGT ATT AAC GAA CCC-3′
E. coli의 증폭을 위하여, HotStartTaq® Plus Master Mix Kit를 이용하여 수행하였다. 반응 혼합물은 2X 마스터 믹스, 0.08 μM의 정방향 프라이머, 0.08 μM의의 역방향 프라이머, 1 μL의 추출된 DNA 및 탈이온수를 함유하였다. DNA 증폭을 위하여, C1000 Touch™ thermal cycler PCR System을 사용하였다. 열적 사이클 조건은 95℃에서 5분, 30초 동안 95℃, 30초 동안 60℃ 및 30초 동안 72℃의 열적 사이클을 35회 반복한 다음, 5분 동안 72℃에서 최종 연장 반응(final extension)을 수행하여 유전자 증폭 반응을 완료하였다. 타겟 DNA는 바이오틴으로 라벨링된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 120-bp 사이즈의 앰플리콘에 대하여 증폭되었다.
증폭된 DNA의 시각화
도 4에 도시된 바와 같이, PCR 증폭 반응 후, 4 μL의 바이오틴화 증폭 DNA, 4 μL의 자성 비드 서스펜션(10 mg/mL, Dynabeads® Myone™ Streptavidin C1) 및 1 μL의 GelRed (20x, Biotium, Hayward, CA, USA)의 혼합물을 개별 겔 컬럼(Ortho BioVue system polycassettes) 내로 피펫팅하였고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 겔 카드를 1000 rpm에서 2분 동안 1회 원심분리하였다. 시각적 확인은 30초, 60초, 120초 및 300초에서 수행되었다. 겔 매트릭스에서 플랫 라인(flat line)에 대응하는 로딩 부위는 유입 현상이 일어나지 않았음을 지시하며, 음성 결과를 보여준다. 양성 결과는 앰플리콘-운반 자성 비드(민감화-처리된 자성 비드)가 겔 매트릭스를 통과하며 겔 컬럼의 바닥까지 이동하였음을 지시한다.
C. 결과 분석
기능화된 세파로오스 기반의 광학 분석에 따른 바이오센싱 원리
특정 분석 장치 없이 PCR 생성물을 분석하기 위하여, 육안 식별 가능한 센싱 원리를 설계하였고, 리간드 친화성 크로마토그래피-기반의 광학 센싱 플랫폼을 개발하였다. 스트렙트아비딘-접합된(conjugated) 자성 입자(MP)를 이동상으로 사용하였고, 또한 이의 고유한 붉은색을 띄는 갈색에 기반하는 분자 시그널을 위하여 사용하였다. PCR 방법에 의한 유전자 증폭에 있어서, MP 및 PCR 생성물과 직접 바인딩하도록 바이오틴화 프라이머를 합성하였다. NHS-기능화된 세파로오스를 고정상으로 사용하였다. 육안 식별 가능한 광학 센싱 시스템을 확립하기 위하여, 통상의 PCR 장치를 이용하여 먼저 병원체로부터의 유전자를 증폭시켰고 제조된 자성 입자와 혼합하였는 바, MP 표면의 모이티가 PCR로부터의 증폭된 유전자를 바인딩함에 따라 변화하였다. 그 다음, MP 혼합물과 PCR의 혼합물을 NHS-수식된 세파로오스 컬럼에 적용하였다.
음성 테스트에 있어서, 자성 입자 표면 상의 스트렙트아비딘이 노출되었고, 스트렙트아비딘 상의 아민기가 세파로오스의 NHS기와 반응할 수 있었다. 그러나, 양성 테스트에 있어서는 스트렙트아비딘이 증폭된 유전자에 의하여 피복되어 있고, 이후 자성 입자가 세파로오스 네트워크 구조로부터부터 분리되었다. 이러한 특성에 기반하여, 세파로오스 겔 내의 자성 입자의 이동(migration) 범위는 원심 분리 과정에서 점차적으로 변화하였고, 자성 입자의 붉은색을 띄는 갈색으로 인하여 자성 입자의 움직임을 육안 관찰할 수 있었다.
결과적으로, 타겟 유전자는 복잡한 분석 디바이스 없이도 육안 관찰에 의하여 간단히 진단할 수 있었다.
육안 관찰에 의한 PCR 생성물의 분석
본 실시예에서는 식품 유래의 병원체에 대한 바이오마커로서 E.coli를 선택하였다. 1.0 × 105 CFU의 E. coli를 제조하였고, 이의 유전자 DNA(gDNA)를 추출하여 정제하였다. 탈이온수를 음의 대조군 테스트로서 사용하였고, 상기 용액을 30분 동안 자성 입자와 혼합하였다. 그 다음, 10배로 희석된 GelRed를 10분 동안 반응시켰다. 제조된 200 μL NHS-수식된 세파로오스를 테스트 튜브 내에서 조심스럽게 팩킹하였다. 용액 내에서 부유된 세파로오스로 인하여, 테스트 튜브를 30초 동안 원심분리시켰다. 이후, 각각의 제조된 테스트 시료를 세파로오스 컬럼에 적용하였고, 상기 컬럼을 2분 동안 1000 rpm에서 원심분리시켰다. 그 결과, 양성 테스트에서 자성 입자는 도 5a에서와 같이 자성 입자는 명확하게 세파로오스 컬럼을 통과하여 이동하였고, 붉은색을 띄는 갈색 입자가 육안으로도 관찰되었다. 반면, 음성 테스트에서는 도 5b에서와 같이 자성 입자의 움직임은 관찰되지 않았는 바, 이는 자성 입자가 세파로오스와 견고하게 바인딩되어 있음을 지시한다.
상기 결과는 실시예에 따른 센싱 시스템이 의도된 바와 같이 성공적으로 작동하고, 타겟 병원체로부터 증폭된 유전자가 육안으로 용이하게 식별될 수 있음을 보여준다.
E.coli 에 대한 검출 한계(LOD) 평가
음식물 내 극히 소량의 E.coli를 포함하는 박테리아가 식중독을 유발하기 때문에 높은 감도 특성을 나타낼 것이 요구된다. E.coli 분석 시 검출 한계를 확인하기 위하여 E. coli를 1.0 × 106 CFU에서부터 1.0 × 101 CFU까지 순차적으로 희석시켰고, 전술한 절차와 같이 DNA를 추출하였다. 각각의 시료로부터 증폭된 PCR 생성물에 대하여 동일 조건 하에서 본 실시예에 따른 분석 시스템을 적용하였으며, 그 결과를 전기영동 테스트 결과와 함께 도 6에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 음성 대조군 테스트를 제외하고는 자성 입자의 이동이 관찰되었는 바, 이는 본 실시예에 따른 검출 시스템을 이용할 경우, 육안 관찰에 의하여 E.coli를 진단할 수 있음을 지시한다. 또한, 1.0 × 101 CFU 미만의 E. coli 농도에서는 자성 입자는 약간 이동하였다. 이와 같이 낮은 E. coli 농도에서도 MP 레벨이 변하였으며, 육안으로 평가하기에 음성 시료 테스트(대조군) 결과에 비하여 뚜렷히 구별된다. 따라서, 검출 한계(LOD)는 1.0 × 101 CFU로 판단하였다.
실제 시료에 기반한 육안 관찰 분석
E.coli가 식중독의 주된 요인인 만큼, 실제 시료에 기반하는 E.coli 분석 실험을 수행하여 본 실시예에 따른 진단 시스템의 적용 가능성을 평가하였다. 본 실시예에서는 10 μL의 우유 내로 1.0 × 106 CFU에서부터 1.0 × 101 CFU까지의 E.coli를 주입하여 인위적으로 감염된 실제 시료를 제조하였다. 박테리아-주입된 우유 시료를 용해시키고, 용해된 용액을 통상의 PCR에 적용하였다. PCR 생성물을 본 실시예에 따른 시스템에 적용하였는 바, 재현성 확보를 위하여 동일 조건 하에서 적어도 3회에 걸쳐 분석 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, 전체 사진에서 MP의 이동이 관찰되었는 바, 이는 본 실시예에 따른 시스템에 실제 음식물 시료에 기반한 E.coli가 효과적으로 검출 가능함을 뒷받침한다. 구체적으로, MP는 1.0 × 101 CFU를 이상의 E. coli 농도에서는 명확하게 이동한 반면, 음성 대조군에서는 MP 변화가 관찰되지 않았다. 1.0 × 101 CFU 농도의 경우, 자성 입자는 약간 이동하였으나, 음성 대조군에 비하여 뚜렷한 이동이 관찰되었다. 따라서, 실제 시료에 있어서 검출 한계는 1.0 × 101 CFU E.coli로 결정할 수 있다.
DLS(dynamic light scattering)을 이용한 DNA 유연성 평가
본 실시예에서 제시된 바이오센싱 원리에 따르면, 양성 테스트에서 자성 입자 상에 부착된 증폭된 PCR 생성물이 스트렙트아비딘의 아민기와 세파로오스 상의 NHS기의 바인딩이 입체 장애에 의하여 간섭받는다. 따라서, 이중 스트랜드 DNA(dsDNA)의 구조를 강성 형태로 유지하는 것이 반응 효율을 증가시키는데 중요하다. 그러나, DNA의 이중 스트랜드는 수계 상에서 높은 유연성을 갖고 있어 정확한 분석이 방해받는다. dsDNA-특정 삽입 물질(분자)의 결합 시, DNA 유연성이 변화하는 바, 본 실시예에서는 GelRed를 사용하여 평가하였다.
GelRed가 염기 쌍 사이에 스태킹될 수 있기 때문에, DNA 움직임은 수계 상 내에서 구속될 수 있다. GelRed 반응에 따른 DNA 유연성을 평가하기 위하여, DLS 방법을 통하여 DNA 사이즈 변화를 분석하였는 바, 상기 방법은 바이오분자의 역학(dynamics)을 측정하여 사이즈 변화를 관찰한다. 약 100개의 염기 쌍으로서 증폭된 DNA 주형의 경우, 작은 사이즈의 길이 변화를 명확하게 검출하기 위하여 100 nm의 스트렙트아비딘-접합된 자성입자를 사용하였다. 1.0 × 105 CFU E. coli는 추출 및 정제되었고, 제조된 유전자는 바이오틴화 프라이머를 함유하는 PCR 혼합물과 혼합되었다. PCR 수행 후, 증폭된 유전자는 100 nm 자성 입자와 반응하였고, 이후 GelRed를 상기 용액과 혼합하였으며, DLS(dynamic light scattering) 사이즈를 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 초기 자성 입자의 사이는 158 nm이었다. 자성 입자 표면 상의 전체 스트렙트아비딘 사이즈(약 20 nm) 및 입자의 수력학적 직경을 고려하면, 상기 사이즈는 신뢰할 수 있다. 또한, DNA가 바인딩된 MP는 191 nm로 측정되었다. 증폭된 유전자는 평균 100 bs이었고, 이론 사이즈는 약 34 nm이었다. 증폭된 DNA가 MP 표면과 균일하게 바인딩된다는 것을 가정하면, 전체 사이즈는 68 nm 증가하였다. 그러나, 전술한 바와 같이, DNA 길이는 수용액 내에서 변화가능한 만큼, 얻어진 결과는 DNA가 유연성을 나타냄을 뒷받침한다. GelRed, DNA 및 MP 테스트 결과에 있어서 관찰된 사이즈는 224 nm이었다. 상기 결과는 dsDNA의 염기쌍 사이에 GelRed가 성공적으로 삽입되었고, GelRed가 증폭된 DNA의 유연성을 효과적으로 감소시켰음을 보여준다.
GelRed 농도 및 반응 시간의 최적화
GelRed의 기능성을 이중 스트랜드 DNA의 유연성 변화로 고려할 때, 유전자 분석에서 세파로오스와의 MP 바인딩 친화성은 GelRed의 농도와 밀접하게 관련되어 있다. GelRed 농도를 최적화하기 위하여, 세파로오스-충진(팩킹)된 테스트 튜브 및 1.0 × 105 CFU E. coli는 앞선 테스트와 동일한 방법으로 제조하였다. PCR에 의하여 증폭된 유전자는 동일 농도의 MP와 반응시켰다. 그 다음, 5배, 10배, 20배, 50배 및 100배 희석된 GelRed를 순차적으로 10분 동안 적용하였고, 이와 같이 제조된 테스트 튜브는 2분 동안 1000 rpm에서 원심분리되었다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, 5배 희석된 GelRed 테스트에서는 MP의 응집 현상이 관찰되었다. 이처럼, 지나치게 높은 농도의 GelRed는 세파로오스 상에서 응집되어 MP 상의 아민과 세파로오스 상의 NHS의 반응에 관계없이 MP의 이동이 교란되는 것으로 판단된다. 그러나, 10배 희석된 GelRed 테스트에 있어서, MP는 양성 테스트에서 명확하게 이동한 반면, 음성 컨트롤 테스트에서는 MP의 움직임 변화는 관찰되지 않았다.
20배, 50배 및 100배 희석된 GelRed 테스트에 있어서, 음성 컨트롤에서의 MP 레벨은 효과적으로 변화하지 않았고, 양성 테스트에서의 MP는 초기 상태와 유사하였는 바, 이는 사용된 GelRed가 증폭된 타겟 유전자에 따른 시그널 변화를 차별화하는데 불충분함을 지시한다. 상술한 테스트 결과, 약 10배 희석된 GelRed를 사용하는 것이 적합하다는 결론을 내릴 수 있다.
한편, 최적화된 원심 분리 조건을 도출하기 위한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9b에 나타내었다.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, 모든 테스트 결과 중 양성 테스트에서 자성 비드의 이동 레벨은 순차적으로 변화한 반면, 음성 테스트에서 자성 비드 움직임의 현저한 변화는 검출되지 않았는 바, 이는 본 개시 내용에서 제안된 바이오센싱 원리가 적절하다는 것을 지시한다. 이는 PCR 생성물과 자성 비드의 접합에 따른 표면 기능기의 차이때문으로 판단된다. 양성 테스트 및 음성 테스트에 따른 자성 비드의 이동 변화는 30초에서 60초까지의 반응 시간에서 관찰되었음에도 불구하고, 자성 비드 이동 변화가 적기 때문에 질병 감염을 결정하는데 불충분하였다. 반면, 120초 동안 반응시킨 경우, 양성 테스트 및 음성 테스트 모두에서의 비드 변화가 명확히 확인되었는 바, 이는 육안으로도 E.coli PCR 생성물을 신뢰성 있게 진단할 수 있도록 한다. 300초의 반응 시간에서는 충분한 진단 결과를 확보할 수 있었으나, 이러한 원심 분리 조건은 현장 테스트에 적합하지 않다. E.coli의 경우, 약 2분의 반응 시간이 가장 이상적임을 알 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (21)

  1. 시각적 확인(identification)이 가능하고, 표면이 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 복수의 이동상(mobile phase) 입자; 및
    상기 제1 기능기-함유 성분과 결합능을 갖는 화학적 기능기에 의하여 활성화된 복수의 고정상(stationary phase) 입자, 상기 복수의 고정상 입자 각각은 매트릭스 입자의 표면에 화학적 기능기가 부착됨;
    를 포함하고,
    여기서, 상기 제1 기능기-함유 성분은 타겟 병원체의 유전자에 특이적인 프라이머와 접합된 제2 기능기-함유 성분과 바인딩 특성을 갖되, 상기 제2 기능기-함유 성분이 프라이머를 통하여 증폭된 타겟 병원체의 유전자와 접합되어 있는 경우에는 상기 이동상 입자가 사이즈 증가로부터 기인하는 입체 장애로 인하여 상기 고정상 입자와 공간적으로 이격됨으로써 상기 이동상 입자와 상기 고정상 입자 간의 바인딩이 억제되며, 그리고
    상기 고정상 입자에 바인딩되지 않은 이동상 입자는 물리적 수단에 의하여 분리되고, 상기 분리된 상태의 이동상 입자를 시각적으로 확인 가능하도록 구성된 병원체의 진단 기기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 물리적 수단은 원심 분리인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  3. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스 입자는 수지, 금속 및 글라스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재질인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  4. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스 입자는 20 내지 100 nm 범위의 포어 사이즈를 갖는 다공성 매트릭스 입자인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고정상 입자의 사이즈(직경)는 30 내지 400 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  6. 제4항에 있어서, 상기 매트릭스 입자는 가교된 비드 형상의 아가로오스 겔인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화학적 기능기는 아민기, 카르복시기, 히드록시기, 실란올기, 말레이미드기, 티올기, 알데히드기, 및 PEG로부터 선택되는 적어도 하나의 모이티를 갖는 기능기인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화학적 기능기는 NHS인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  9. 제1항에 있어서, 제1 기능기-함유 성분 및 제2 기능기-함유 성분은 서로 상이하고, 아비딘, 스트렙트아비딘, 바이오틴, 항원, 항체, 압타머(aptamer), 아민, 카르복시, 알데하이드 및 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  10. 제9항에 있어서, 제1 기능기-함유 성분은 아비딘 또는 스트렙트아비딘이고, 제2 기능기-함유 성분은 바이오틴인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이동상 입자는 베이스 입자가 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 형태로서, 상기 베이스 입자는 자성 입자, 폴리스티렌 비드, 금 나노입자, 금속 입자, 글라스 비드 및 실리카 비드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  12. 제11항에 있어서, 상기 베이스 입자는 0.01 내지 10 ㎛의 사이즈를 갖는 것을 특징으로 하는 병원체의 진단 기기.
  13. a) 시각적 확인(identification)이 가능하고, 표면이 제1 기능기-함유 성분으로 수식된 복수의 이동상(mobile phase) 입자를 제공하는 단계;
    b) 상기 단계 a)와는 별도로, 제1 기능기-함유 성분에 바인딩 특성을 갖는 제2 기능기-함유 성분과 접합된 프라이머를 이용하여 시료 내 타겟 병원체의 유전자를 증폭함으로써 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자를 얻는 단계;
    c) 상기 제1 기능기-함유 성분과 결합능을 갖는 화학적 기능기에 의하여 활성화된 복수의 고정상(stationary phase) 입자가 충진된 컬럼에, (i) 상기 복수의 수식된 이동상 입자, 및 (ii) 상기 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자를 첨가하는 단계, 상기 복수의 고정상 입자 각각은 매트릭스 입자의 표면에 화학적 기능기가 부착됨 ;
    d) 상기 단계 c)에서 (i) 상기 수식된 이동상 입자 및 (ii) 상기 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체가 첨가된 컬럼에 대한 원심 분리를 수행하는 단계;
    를 포함하는 병원체의 검출 방법으로서,
    여기서, 상기 제2 기능기-함유 성분으로 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자에 의한 상기 이동상 입자가 사이즈 증가로부터 기인하는 입체 장애로 인하여 상기 고정상 입자와 공간적으로 이격됨으로써 상기 이동상 입자와 상기 고정상 입자 간의 바인딩이 억제되며, 그리고
    상기 고정상 입자에 바인딩되지 않은 이동상 입자는 원심 분리에 의하여 분리되고, 상기 분리된 상태의 이동상 입자를 시각적으로 확인하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 삽입 물질을 상기 증폭 유전자 내에 삽입하여 증폭 유전자의 강성을 높임으로써 증가된 입체 장애를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 삽입 물질은 삽입 염료이며, GelRed, EtBr(ethidium bromide), GelGreen, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, 및 SYTO 시리즈로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 삽입 물질은 수계 매질에 희석된 상태로 적용되며, 이때 희석된 매질 내 삽입 물질의 농도는 6 내지 19x 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 원심 분리 시 회전 속도는 500 내지 1500 rpm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 원심 분리 시간은 0.5 내지 5분 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, (i) 상기 복수의 수식된 이동상 입자, 및 (ii) 상기 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자는 혼합물 형태로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 제2 기능기-함유 성분과 접합된 타겟 병원체의 증폭 유전자가 상기 제2 기능기-함유 성분과 상기 이동상 입자의 제1 기능기-함유 성분과의 바인딩에 의하여 이동상 입자에 고정된 후의 입자 사이즈는 고정 전 대비 적어도 20% 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 타겟 병원체는 E. coli O157 : H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, 또는 L. monocytognes인 것을 특징으로 하는 방법.
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