KR100771554B1

KR100771554B1 - 금속 나노 교상체 및 인터컬레이터를 이용한 핵산의검출방법

Info

Publication number: KR100771554B1
Application number: KR1020050120331A
Authority: KR
Inventors: 김민환; 정지원; 김운옥
Original assignee: 래플진(주)
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2007-11-01
Also published as: KR20070060592A

Abstract

본 발명은 금속 나노 교상체(metal nano colloidal form) 및 인터컬레이터(intercalator)를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 샘플 또는 시료 속의 목적 핵산을 증폭하고, 이중나선의 핵산에 결합하는 인터컬레이터를 3~10μM 첨가하여 핵산-인터컬레이터 결합체를 형성한 후, 금속 나노 교상체를 첨가하여 상기 인터컬레이터에 금속 나노 교상체를 결합시킨 다음, 상기 결합에 의한 금속 나노 교상체의 응집을 유발하여 색깔변화를 일으킴으로써, 증폭된 핵산의 존재 유무를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 목적 핵산을 증폭한 다음 특정 농도의 인터컬레이터를 첨가함으로써, 특별한 분석장치 및/또는 고가의 시약 없이 육안으로도 단시간내에 간편하고 신속하게 증폭된 핵산을 검출할 수 있어 유용하다.

핵산 검출, 이중나선 핵산 인터컬레이션, 금 나노 교상체

Description

금속 나노 교상체 및 인터컬레이터를 이용한 핵산의 검출방법{Method for Detecting a Nucleic Acid Using Metal Nano Colloidal Form and Intercalator}

도 1은 본 발명의 핵산 검출방법을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 이중나선 핵산 인터컬레이터와 금 나노 교상체의 결합에 따른 가시광선 흡광도를 나타낸 것이다.

도 3은 피리딘을 처리하여 대장균 O157의 유전자 증폭을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 0~25μM의 코라린을 처리하여 대장균 O157의 유전자 증폭을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 0~5μM의 코라린을 처리하여 대장균 O157의 유전자 증폭을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

핵산 분석에 있어서 in vitro 핵산 검출 기술은 강력한 방법으로 사용되어 왔다. 그러나 법의학적 측면에서 감염성 및 유전성 질병의 진단, 분석을 위한 유전자의 분리 및 특정 핵산의 검출에 있어서, 상기 방법의 낮은 민감성이 문제가 되어 이를 극복하기 위한 노력이 진행되고 있다. 그 결과, 핵산 검출에 있어 높은 민감도를 나타내는 진단 분석법(assay)들이 개발되고 있다.

생화학적 및 생물학적 물질에서 목적 핵산성분(nucleic acid analyte)의 검출을 위하여 다양한 방법 및 시스템이 개발되고 있다. 일반적으로, 목적 핵산성분의 존재는, 상기 핵산성분에 선택적으로 결합하는 프로브(probe)에 붙는 식별 가능한 라벨(label)을 통하여 검출할 수 있으며, 이 외에도 생성물에서 방출되는 광(light)의 모니터링(monitoring), 생성물의 질량 측정, 또는 생성물이 형성될 때 전기적 성질의 변화 검출에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 광-방출 특성을 지닌 수많은 종류의 라벨이 합성되어, 광 검출 또는 전기적 검출에 근거한 검출방법에서 사용된다.

핵산 검출방법에 있어서, 광 방출을 통한 모니터링은 가장 광범위하게 사용하는 검출 양상(modality)으로, 발광(luminescence), 형광(fluorescence), 시간-분해 형광(time-resolved fluorescence), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 화학발광 (chemiluminescent) 등을 예로 들 수 있다.

발광은 ATP-의존성 루시퍼라아제 반응에서 방출된다 (Nyren et al., Anal. Biochem., 151:504, 1995). ATP 생성이 프라이머 신장반응과 결부되어 있을 때, 발광은 디옥시리보뉴클레오시드(deoxynucleoside)가 프라이머 신장반응에 첨가되는 순간마다 관찰된다. 백그라운드(background)는 매우 낮으므로, 발광은 매우 좋은 신호 대 잡음 비율(signal to noise ratio)을 가지고 있다. 그러나, 추가적인 효소 단계 및 필요한 기질(substrate)은 실험과정을 어렵게 하고, 분석시 비용을 증가시킨다.

형광검출은 직접적이며, 수행하기 편리한 방법이다. 고체 지지물 위에서 형광 라벨을 포획(capture)하기 위해서, 또는 젤 또는 모세관 전기영동을 통해 라벨로부터 형광생성물을 분리하기 위하여 형광검출을 사용하는 것을 제외하고는, 형광검출은 이중나선 핵산에서 형광을 나타내는 핵산 인터컬레이팅 염료(DNA intercalating dye)을 가진 이중나선 핵산의 형성을 모니터하는데 사용할 수 있다. 직접적인 형광검출은 어느 범위까지는 매우 다양하게 사용할 수 있다. 그러나 형광 라벨을 사용할 때 반응생성물의 정제·분리에 대한 필요성 및 인터컬레이팅 염료를 사용할 때 비특이적 이중나선 핵산 종(species)에 의한 간섭(interference)은 직접적인 형광검출의 단점으로 지적되고 있다.

시간-분해 형광은 검출을 위한 접근법으로 형광 염료의 방출 반감기가 긴 경우 실행이 가능하다. 시간-분해 형광에 사용되는 염료는 대부분이 지구상에서 보기 드문 란탄계열 원소(Lanthanides)이며, 매우 짧은 반감기(half-life)를 나타내지 않는 자가형광(autofluorescence)처럼 여기(excitation) 이후에도 오랫동안 지속되는 형광 표시도수(fluorescent reading)를 가지고 있을 뿐 아니라, 백그라운드가 거의 없는 매우 민감한 검출방법이다. 하지만, 란탄계열 원소는 핵산을 직접적으로 표지(label)할 수 없는 무기화합물(inorganic compound)이라는 단점을 가지고 있기 때문에, 검출을 목적으로 사용하기 위해서는 프로브에 유기 킬레이터(organic chelator)가 결합되어 있어야 한다.

FRET는 균질한 핵산서열을 검출하기 위하여 일반적으로 사용하는 방법이다 (Didenko, Biotechniques, 31:1106, 2001). FRET는 하기 두 조건이 충족될 때 이뤄진다. 첫째, 형광제공 염료(fluorescent donor dye)의 방출 스펙트럼(emission spectrum)은 형광수용 염료(fluorescent acceptor dye)의 여기 파장과 부분적으로 일치해야 한다. 둘째, 상기 두 염료는, 에너지 전달이 거리에 비례하여 재빨리 감소하므로, 서로 가까운 거리안에 있어야 한다. 거리는 다양한 핵산서열 검출방법 기작에 대해서, FRET를 우수한 검출방법으로 만드는 필수조건이다. 기본적으로, 두 염료를 접합 또는 분리하는 어떠한 반응이라도 반응의 검출방법으로 FRET를 사용할 수 있다. 그러므로 FRET 검출은 두 라벨이 서로 근접한 거리에 존재하는 프라이머 신장 및 접합 반응에서 사용하고 있다. 또한, 5’뉴클리에이즈 반응(5’nuclease reaction), 분자적 표지반응(molecular beacon reaction) 및 근접한 제공자/수용자 쌍을 유지하는 스템-루프 구조(stem-loop structure)의 분열 또는 붕괴에 의해 상기 쌍을 분리하는 분열반응에서도 사용할 수 있다. 상기 방법의 단점은 FRET 검출을 사용하는 모든 핵산서열 검출방법에서 사용하는 표지된 프로브의 비용이다. 상기 분열방법에서, 상기 프로브는 이중으로 표지되므로, 프로브 합성 비용은 더욱 증가한다.

화학발광(chemiluminescent) 방법은 에너지의 화학적 전달에 의한 발광 종(luminescent species)의 생성을 수반한다. 전기적 화학발광(electrochemiluminescence)은 전기적으로 발광 종의 생성을 수반한다.

ECL(electrochemiluminescent) 분석방법은 화학발광 방법을 개선한 것으로, 관심 있는 핵산성분의 존재 및 농도를 섬세하고 정확하게 측정할 수 있도록 한다. 상기 기술에서, 발광을 촉진시키기 위하여 볼타메트릭 워킹 전극(voltametric working electrode)에 배양된 샘플을 노출시킨다. 적절한 화학적 조건에서, 전기적 화학발광은 특정한 시간에 특정한 방식으로 워킹 전극에 가해진 전압에 의해 촉진된다. 라벨의 의해 생성된 광을 측정함으로써, 핵산성분의 존재 또는 양을 알 수 있다. 분석과정동안 ECL 분석을 수행하는 것이 가능하며, 핵산성분의 농도를 달리하여 신호조절을 최대화함으로써 정확하고 민감하게 측정하는 것이 가능하다.

라벨을 모니터링하는 핵산서열 검출에서, 생성된 산물이 동일하다는 것을 추론하는 다른 검출방법과 달리, MS(mass spectrometer)는 생성된 산물의 분자량을 측정할 수 있는 가장 직접적인 검출방법이다 (Rose et al., Nat. Biotechnol., 16:1347, 1998). MS는 분자의 기본적인 특성을 결정하기 때문에, 라벨은 필요로 하지 않는다. 고해상도 MS는 염기가 하나만 달라도 DNA 분자를 쉽게 구별할 수 있다. MS의 또 다른 장점은, 각 샘플을 연속적으로 분석하더라도 각 샘플을 분석하는데 10-3초밖에 걸리지 않으며, 작업처리량(throughput)이 매우 크다는 것이다. 더욱이, 적절하게 프로브를 고안한다면, 적당한 멀티플렉싱(multiplexing)도 가능하다. 그러나 MS 검출방법은 분석대상이 고순도를 가지고 있어야 한다는 단점을 지니고 있다.

구리, 은, 금 계열의 금속은 가시광선 영역에서 강력한 전자 플라즈마 공명에 의해 특정 색깔을 띠는 특징이 있다. 이러한 공명의 파장은 금속의 유전적인 기능에 의해 결정되는데 이러한 유전적 기능은 금속의 크기와 모양 그리고 금속 상호간의 거리에 의해 좌우되기 때문에 금속 교상체의 색깔은 금속 교상체의 제조방법과 금속의 응집 상태에 따라 다양하게 존재한다 (Chang, Surface Enhanced Raman Scattering, Plenum, New York, 1982). 용액에 존재하는 전도성 금속 나노 물질, 즉, 금속 교상체는 금속 물질 상호간의 강력한 반데르 발스 결합력에 의해 응집하려는 성향이 있으나, 특이적으로 금속 물질이 시트레이트와 같은 음이온에 둘러싸여 있으면 이온 반발력에 의해 용액에서 안정적으로 존재할 수 있다. 이러한 금속 나노 교상체에 특정 농도의 염을 첨가하면 시트레이트 음이온이 제거되어 이온 반발력이 사라져 금속의 응집을 유도하게 된다 (Hunter, Foundations of Colloid Science, Oxford University Press Inc., New York, 2001).

단일나선 핵산은 금 나노 교상체와 결합하여, 금 나노 교상체의 응집을 통한 색깔의 변화의 유발을 억제하는 것으로 알려져 왔는데, 그 이유는 단일나선 핵산은 구조적 자유성으로 염기가 외부로 노출되어 있어, 염기와 금 나노 물질간의 반데르 발스 결합력에 의해 금 나노 교상체와 결합할 수 있으나, 이중나선 핵산은 구조적으로 염기가 외부로 노출되어 있어, 금 나노 교상체와 결합할 수 없기 때문이다 (Li, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 101:14036, 1994).

최근 단일나선 핵산이 금 나노 교상체와 결합하여 특정 농도의 염을 첨가해도 금 나노 교상체의 응집을 저해하는 특성을 이용하여 핵산의 검출에 응용한 예가 발표되었다 (Li, J. Am. Chem. Soc . 126:10958, 2004).

그러나 본 발명자의 실험 결과에 의하면, 이중나선 핵산도 금 나노 교상체와 결합하여 금 나노 교상체의 응집을 저해하는 특성을 가지고 있고, 심지어는 그 저해 특성이 단일나선 핵산을 능가하는 것으로 밝혀졌다. 즉, 목적 핵산을 PCR 증폭한 후 피리딘을 첨가하면, 단일나선 핵산(증폭되지 않은 프라이머)이 존재하는 대조구가 이중나선 핵산(증폭산물)이 존재하는 실험구에 비해서 더 낮은 농도의 피리딘을 첨가했을 때 나노 교상체의 응집을 보였다. 이는 이중나선 핵산이 가역적 변화에 의해 단일나선 핵산으로 변환하는 현상에 의한 것이다. 그러나, 이중나선 핵산에 인터컬레이터가 결합하면 이러한 가역적 변화는 억제된다.

또한, 금 나노 교상체는 형광물질과 결합하면 형광의 퀸칭을 유도하는데, 이러한 형광 물질의 퀸칭 작용은 기존의 퀸칭 유기물질 보다 100배 이상의 퀸칭 효율을 보여준다 (Bubertret, Nature Biotechnology, 19:365, 2001). 따라서, 이중나선 핵산에 선택적으로 인터컬레이팅하는 형광 물질을 사용하면, 이중나선 핵산의 존재 유무 및 그 양에 따라 형광의 세기가 달라지므로, 가시광선 보다 민감도가 우수한 형광의 특성을 이용하여 목적 핵산의 정량적 검출도 가능하다. 이중나선 핵산에 선택적으로 인터컬레이팅하는 형광물질로는 YOYO 혹은 SYBR Green 등이 잘 알려져 있다.

고분자고리 방향족 화합물은 이중나선 핵산에 선택적으로 인터컬레이팅하여 이중나선 핵산의 구조 변화와 안정성에 기여한다는 것은 잘 알려진 사실이다. (Lerman, J. Mol . Biol . 3:18, 1961) 이중나선 핵산 인터컬레이터는 이중나선 핵산의 구조적 변화를 유도하여 핵산의 복제 및 유전자의 전사 등을 억제하는 생리학적 특성을 보여주어 암 치료제 등 신약개발 분야에 빈번히 응용되고 있다 (Brana, Curr. Pharm . Des. 7:1745, 2001). 다양한 양이온의 유기 방향족 물질은 전통적인 이중나선 핵산 인터컬레이터로 잘 알려져 있으며 이러한 예로는 아크리딘 유도체인 프로플레빈 (Lerman, J. Mol . Biol . 3:18, 1961), 아크리딘 오렌지 (Armstrong, J. Am. Chem . Soc . 92:3174, 1970) 등과 아진 염색물질인 메틸린 블루 (Tuite, J. Am. Chem. Soc . 116:7548, 1994), 페난트리디니엄 염인 에테디엄 브로마이드 (LePecq, J. Mol . Biol . 27:87, 1967), 시아닌 염색물질인 타이졸 오렌지 (Netzel, J. Phys. Chem . 99:17936, 1995) 등이 있다. 최근 양이온 사중 브릿지헤드 질소 원자를 함유하는 퀴놀리지니엄 유도체인 코라린은 이중나선 핵산의 구조적 안정을 유도하여 단일나선 핵산으로의 가역적 변화를 저해하는 특성을 가지고 있고, 나아가서는 삼중 나선 핵산을 형성한다는 것이 밝혀졌다 (Swapan, Nucleic Acids Research 31:4608, 2003).

전통적인 생물학적 분석법은 매우 반복적이며 노동-집약적이고, ㎖단위의 샘플을 사용하여 수행된다. 상기 방법들을 포함하는 생물학적 방법은 과도한 경제적 부담 및 시간을 필요로 한다. 따라서, 환경적 및 생의약적 진단을 위한 저렴한 기술의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 단시간내에 간편하고 정확하게 증폭된 핵산을 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 증폭된 핵산에 이중나선의 핵산에 결합하는 인터컬레이터 3~10μM을 첨가하여 핵산-인터컬레이터 결합체를 형성한 후, 금속 나노 교상체를 첨가하여 상기 인터컬레이터에 금속 나노 교상체를 결합시키면, 금속 나노 교상체의 응집이 유발되어 색깔변화를 관찰할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 금속 나노 교상체를 이용한 핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적 핵산을 증폭하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 증폭된 핵산에 이중나선 핵산에 결합하는 유기물질을 첨가하여 상기 증폭된 핵산에 유기물질을 결합시키는 단계; (c) 상기 유기물질이 결합된 핵산에 금속 나노 교상체를 첨가하여 상기 유기물질에 금속 나노 교상체를 결합시켜 금속 나노 교상체의 응집을 유발시키는 단계; 및 (d) 금속 나노 교상체의 색깔 변화를 측정하여 핵산의 존재 유무를 결정하는 단계를 포함하는 핵산의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유기물질의 농도는 3~10μM 인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 유기물질은 이중나선 핵산에 대한 인터컬레이터(intercalator)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 인터컬레이터는 아크리딘계열 물질 또는 그의 유도체, 아진계열 물질 또는 그의 유도체, 페난트리디니엄계열 물질 또는 그의 유도체, 사아닌계열 물질 또는 그의 유도체, 퀴놀리지니엄계열 물질 또는 그의 유도체 및 형광물질로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 아크리딘계열 물질은 아크리딘(acridine)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 퀴놀리지니엄계열 물질은 코라린(coralyne)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 형광물질은 EtBr(Ethidium Bromide), YOYO-1(catalog no. Y-3601, Invitrogen, USA), TOTO-1(catalog no. Y-3600, Invitrogen, USA) 및 SYBR Green I(catalog no. S-7563, Invitrogen, USA)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 금속 나노 교상체의 금속은 금, 은 및 금 또는 은의 혼합금속으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 금속 나노 교상체의 직경은 1~20nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 10~15nm인 것이 바람직하다.

또한, 상기 금속 나노 교상체의 금속은 금이고, 색깔 변화를 육안으로 관찰하여 핵산의 존재 유무를 결정하는 것을 특징으로 할 수 있고, 색깔이 적색계열에서 청색계열로 변화하는 경우에 목적핵산이 존재하는 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 유기물질은 형광물질이고, 상기 (d)단계는 형광물질과 금속 나노 교상체의 결합에 따른 형광 세기의 변화를 측정하여 핵산의 존재 유무를 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하 본 발명을 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 수행을 위하여, 1mM HAuCl₄ 250ml을 플라스크에 넣고 가열하여 환류한 다음, 38.8mM 시트레이트 나트륨(sodium citrate, Aldrich, USA) 25ml을 신속하게 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물을 10분동안 가열한 다음, 옅은 붉은색으로 변한 혼합물을 상온에서 식히면서 15분동안 교반하여 금 나노 교상체(옅은 붉은색)를 제조하였다.

제조한 금 나노 교상체와 인터컬레이터의 결합유무를 확인하기 위하여, 상기 금 나노 교상체와 인터컬레이터인 코라린(corayne chloride, Aldrich, USA)을 혼합하여 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 코라린 첨가에 따른 흡광도의 전이를 관찰할 수 있었고, 이를 통하여 상기 두 물질간의 결합이 이루어진다는 것을 확인하였다.

그리고, E. coli O157로부터 분리한 핵산을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로 써, 본 발명의 핵산 검출방법을 검증하였다. O157로부터 분리한 핵산으로 PCR 반응을 수행한 것을 실험군으로, 핵산 대신 물을 첨가하여 PCR 반응을 수행한 것을 대조군으로 하여 본 발명의 검출방법을 수행함으로써, 이중나선 핵산이 존재하는 경우 3~10μM의 인터컬레이터가 첨가되면, 인터컬레이터와 금 나노 교상체간의 결합에 의해 금 나노 교상체의 응집이 유발되어 색깔 변화가 관찰된다는 것을 확인할 수 있었다. 단일나선 핵산이 존재하는 경우에는 색깔 변화가 관찰되지 않았다.

본 발명에 있어서, 인터컬레이터(intercalator)라 함은 이중나선 핵산에 인터컬레이팅할 수 있는 모든 물질을 지칭하는 것이다.

본 발명에 있어서, 핵산의 증폭은 PCR에 의해 수행되었으나, LCR, TMA, NASBA 및 SDA에 의해 택일적으로 수행될 수 있으며, 상기 기술한 증폭방법에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 금 나노 교상체의 제조

종래 기술(Turkevjch, Faraday Soc . 11:55, 1951)에 따라 금 나노 교상체를 제조하였다. 먼저, 1mM HAuCl₄(Aldrich, USA) 250ml을 플라스크에 넣고 가열하여 환류한 다음, 38.8mM 시트레이트 나트륨(sodium citrate, Aldrich, USA) 25ml을 신속하게 첨가하였다. 이 때, 옅은 노란색의 HAuCl₄ 용액이 짙은 보라색으로 변한다. 이후, 반응 혼합물을 10분동안 가열한 다음, 옅은 적색으로 변한 혼합물을 상온에서 식히면서 15분동안 교반하여 금 나노 교상체를 제조하였다. 제조된 금 나노 교상체는 520nm의 가시광선에서 최적의 흡광도를 나타낸다.

실시예 2: 코라린에 의한 금 나노 교상체의 응집에 따른 흡광도의 변화

실시예 1의 금 나노 교상체(188μl)에 다양한 농도(0, 0.5, 1, 2.5μM)의 코라린을 첨가한 뒤(최종 부피: 800μl), 400~700nm의 파장범위(Optizen 2120UV, 한국)에서 흡광도를 측정함으로써, 금 나노 교상체와 코라린의 결합에 따른 금 나노 교상체의 응집도를 관찰하였다 (도 2).

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 코라린을 첨가함에 따라 흡광도의 전이를 관찰할 수 있었다. 그리고, 이를 통하여 옅은 붉은색의 금 나노 교상체에 이중나선 핵산과 선택적으로 결합하는 인터컬레이터를 일정량 첨가하면, 인터컬레이터가 금 나노 교상체와 결합함으로써, 금 나노 교상체의 응집을 유발하여 색깔 변화를 유발한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 본 발명에 따른 핵산 검출

3-1: E. coli O157 균주로부터 핵산 분리

E. coli O157 균주(KCCM 40406)를 37℃ Trypticase soy agar 평판 배지(catalog no. 211768, BD, USA)에서 정치 배양하여 하나의 콜로니(single colony)을 수득한 다음, 37℃의 호기성 조건하에서 배양액(Trypticase soy broth)에 배양하였다.

상기 조건에서 배양하면서, 매시간 세포 배양액을 취하여 흡광도 및 세포수를 측정하였다. 세포수는 액체배지에 세포배양액을 연속적으로 희석하는 기법을 시행하여 헬버 세포 카운팅 챔버(Helber cell counting chamber)로 측정하여 흡광도에 따른 세포수를 결정하였다.

상기 대장균 균주로부터의 핵산분리는 Intron사의 G-spin Genomic DNA 분리시스템(Cat No. 17121)을 사용하였다. 먼저, 상기 배양액 1.0ml(10⁷ 세포수/ml)을 13,000 xg에서 2분간 원심분리하여 세포만을 모으고, G-buffer 용액 300μl를 첨가하여 재현탁한 후, 65℃에서 15분동안 정치시킨 다음, 250μl binding buffer(RNase 용액 및 Proteinase K 용액 함유)를 첨가하여 부드럽게 현탁시켰다. 이 혼합액을 스핀컬럼(spin column)으로 옮겨 13,000xg 에서 1분동안 원심분리하였다. 500μl washing buffer A 세척액을 다시 스핀컬럼에 첨가하고, 13,000xg에서 1분간 원심분리하였다. 그리고, 500μl washing buffer B 세척액을 다시 스핀컬럼에 첨가하고 13,000xg에서 1분동안 원심분리하였다. 컬럼을 새 튜브로 옮긴 다음, 100 μl elution buffer를 컬럼막(column membrane)에 골고루 적셔 실온에서 3 분간 정치한 후, 13,000xg에서 2분간 원심분리하여 핵산을 분리하였다. 수득한 핵산은 -80 ℃ 에 보관하여 사용하였다.

3-2: E. coli 핵산을 이용한 stx2의 증폭

E. coli 의 stx2(shiga toxin) 유전자의 특정 핵산 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여, 먼저, 종래문헌(Belanger, Journal of Clinical Microbiology, 40:1436, 2002)을 참고하여 하기 서열번호 1 및 2의 프라이머를 제작하였다.

서열번호 1 : 5'-CGT TAA TGG AGT TCA GTG G-3'

서열번호 2 : 5'-TAA AGG ATA TTC TCC CCA-3'

상기 과정에 의해 수득한 Eascherichia coli 핵산 100ng과 서열번호 1 및 2의 프라이머(각각 0.5μM)를 혼합한 다음, 효소반응액(10mM Tris-HCl pH 8.5, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.05mM each dNTP(Intron), 1U Taq polymerase(Intron))을 첨가하고, 하기 조건하에서 PCR 반응을 수행하였다. 증폭을 위한 반응물의 최종부피는 20μl이고, 핵산 대신 물을 첨가한 것을 대조군으로 사용하였다.

PCR 반응조건: 95℃, 5분 → [95℃ 30초, 54℃ 15초, 72℃ 35초] 30회 → 72℃ 5분

3-3: 피리딘을 이용한 증폭된 핵산 검출

PCR 반응이 종결된 후, 대조군과 실험군의 증폭물로부터 각각 4μl씩 추출하고, 여기에 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 및 5μM)의 피리딘(pyridine)을 첨가한 다음, 실시예 1의 금 나노 교상체(29.4μl)를 첨가하고(최종 부피: 50μl), 색깔 변화(옅은 붉은색 → 푸른색)를 관찰하였다 (도 3).

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.5~5μM이상의 피리딘을 첨가한 경우, 대조군과 실험군 모두에서 금 나노 교상체의 색깔 변화는 관찰할 수 있었으나, 이로부터 단일나선 핵산 및 이중나선 핵산의 존재유무를 명확하게 판별할 수는 없었다.

3-4: 본 발명에 따른 증폭된 핵산 검출

PCR 반응이 종결된 후, 대조군과 실험군의 증폭물로부터 각각 4μl씩 추출한 후, 여기에 다양한 농도(0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 13, 15, 20 및 25μM)의 코라린(coralyne)을 첨가한 다음, 실시예 1의 금 나노 교상체(29.4μl)를 첨가하고(최종 부피: 50μl), 색깔 변화(옅은 붉은색 → 푸른색)를 관찰하였다 (도 4 및 5).

그 결과, 도 4 에 나타난 바와 같이, 3~10μM의 코라린을 첨가한 경우, 대조군에서는 색깔 변화를 관찰할 수 없었으나, 실험군에서는 색깔 변화를 관찰할 수 있었으며, 첨가한 코라린의 농도가 증가할수록 반응물의 색깔 농도 역시 비례하여 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 3~10μM 이외의 농도범위를 가지는 코라린을 첨가한 경우에는 대조군과 실험군 간의 색깔 차이를 관찰할 수 없었다.

도 5는 1~5μM의 코라린을 첨가하여 실험군과 대조군에서 농도 변화를 관찰한 것이다.

이를 통하여, 특정 농도(3~10μM)의 인터컬레이터가 첨가되는 경우, 시료 혹은 샘플에 단일나선 핵산만 있다면, 단일나선 핵산은 금속 나노 교상체와 결합하여, 교상체와 인터컬레이터간의 결합을 저해함으로써 금속 나노 교상체의 색깔 변화는 발생하지 않지만, 특정 농도(3~10μM)의 인터컬레이터가 첨가되는 경우, 시료 혹은 샘플에 이중나선 핵산이 있다면, 첨가된 인터컬레이터가 이중나선 핵산에 인터컬레이팅되어 단일나선 핵산으로의 가역적 변화를 억제하고, 금속 나노 교상체와 결합하여 응집을 유도함으로써, 금속 나노 교상체의 색깔 변화(옅은 붉은색 → 푸른색)가 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 금속 나노 교상체를 이용한 핵산의 검출방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 목적 핵산을 증폭한 다음 특정 농도(3~10μM)의 인터컬레이터를 첨가함으로써, 특별한 분석장치 및/또는 고가의 시약 없이 육안으로도 단시간내에 간편하고 신속하게 증폭된 핵산을 검출할 수 있어 유용하다. 또한, 금속 나노 교상체와 결합하는 유기물질로 형광물질을 사용할 경우, 금속 나노 교상체의 응집에 다른 색깔 변화뿐 아니라, 결합한 형광물질의 형광 세기 변화로 인한 정량적 검출에 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음 단계를 포함하는 핵산의 검출방법:

(a) 목적 핵산을 증폭하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 증폭된 핵산에 3~10μM의 이중나선 핵산에 결합하는 인터컬레이터(intercalator)를 첨가하여 상기 증폭된 핵산에 인터컬레이터를 결합시키는 단계;

(c) 상기 인터컬레이터가 결합된 핵산에 금 나노 교상체를 첨가하여 상기 인터컬레이터에 금 나노 교상체를 결합시켜 금 나노 교상체의 응집을 유발시키는 단계; 및

(d) 금 나노 교상체의 색깔 변화를 측정하여 핵산의 존재 유무를 결정하는 단계.
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제1항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 아크리딘계열 물질 또는 그의 유도체, 아진계열 물질 또는 그의 유도체, 페난트리디니엄계열 물질 또는 그의 유도체, 사아닌계열 물질 또는 그의 유도체, 퀴놀리지니엄계열 물질 또는 그의 유도체 및 형광물질로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 아크리딘계열 물질은 아크리딘(acridine)인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 퀴놀리지니엄계열 물질은 코라린(coralyne)인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 형광물질은 EtBr, YOYO-1, TOTO-1 및 SYBR Green I로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 금 나노 교상체의 직경은 1~20nm인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 금 나노 교상체의 직경은 10~15nm인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 형광물질이고, 상기 (d)단계는 형광물질과 금 나노 교상체의 결합에 따른 형광 세기의 변화를 측정하여 핵산의 존재 유무를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.