KR20130015810A - 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 기판 상에 DNA 프로브가 고정된 DNA칩에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용시킨 다음, 이중나선 핵산과 결합하는 인컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시킨 후 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시켜서 상기 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 육안으로 목적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용함으로써, 다른 어떠한 장비 없이도 육안으로 핵산 검출이 가능하여 기존의 검출 방식보다 검출 시간 및 분석 비용이 절감되는 효과뿐만 아니라 장치의 소형화가 가능하여 가축 농장이나 가정 등에서 현장 진단이 가능하다는 장점이 있다.

Description

인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법{Method for Detecting of Nucleic Acid Using Intercalator-Conjugated Metal Nanoparticle}
본 발명은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 기판 상에 프로브가 고정된 DNA칩에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용시킨 다음, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시킨 후 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시켜서 상기 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 육안으로 목적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
바이오칩(Biochip)은 DNA, 단백질, 항체, 당쇄, 세포 또는 뉴런 등의 생체물질들을 유리, 실리콘, 고분자 등의 고체기질 위에 고밀도로 집적화하고 극미량의 시료를 초고속으로 분석해서 유전자 발현양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 신경세포간의 상호 정보교환 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 동정 및 반응속도 또는 정보처리 속도를 높이는 생체정보 감지소자이다.
바이오칩은 생물분자와 시스템화된 정도에 따라 DNA칩, RNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로 구분될 수 있으며, 시료의 전처리, 생화학 반응, 검출 및 자료 해석까지 소형 집적화되어 자동분석기능을 갖는 실험실칩(Lab on a chip)과 같이 각종 생화학물질의 검출 및 분석 기능을 할 수 있는 '바이오 센서'를 포함하여 광범위하게 정의될 수 있다.
특히, 인간 게놈 프로젝트가 진행됨에 따라 기존의 분자생물학적 연구방법들을 대체할 수단으로 DNA칩 기술이 크게 주목받고 있다. DNA칩은 적게는 수십에서 수백만 종류의 DNA 조각을 슬라이드 글라스와 같은 아주 작은 표면에 집적한 것으로 이를 이용한 DNA 검출 방법은 적은 양의 시료에 들어 있는 RNA 또는 DNA를 짧은 시간에 검출할 수 있으므로 기존의 서던 블럿(Southern blot)이나 노던 블럿(Northern blot)을 대량으로 짧은 시간에 수행할 수 있다는 점에서 매우 각광받고 있다. DNA칩은 유전체 연구 및 분자생물학적 연구에 필수적인 대량의 RNA 발현측정, 게놈 DNA의 돌연변이 검출, 유전자 진단, 약물유전학(pharmacogenomics), 맞춤의약 등에 응용할 수 있다.
현재까지 크게 올리고칩(oligochip)과 cDNA 칩이라는 두 가지 종류의 DNA칩이 소개되고 있는데, 전자는 20~25머(mer)의 올리고뉴클레오티드를 수십만개 집적한 것이고, 후자는 올리고뉴클레오티드보다 좀 더 긴 cDNA 조각을 집적한 것이다.
기존에 알려진 DNA칩의 기본 원리는 특정 염기서열을 가진 프로브 DNA 조각을 칩으로 불리는 표면에 다양한 방법으로 집적한 후, 집적된 프로브 DNA 조각 중 어떤 프로브 DNA가 시료에 존재하는 타겟(target) DNA(또는 RNA)와 결합하는지를 다량으로 검출하는 것이다.
이러한 DNA칩을 제작 및 이용하기 위한 기술로는 타겟 DNA와 특이적으로 반응할 수 있는 프로브의 고정화 기술, 반응 유무를 검출할 수 있는 검출 기술 및 검출된 정보를 처리할 수 있는 정보처리기술 등이 있다.
이 중, 반응 유무를 검출할 수 있는 검출 기술은 일반적으로 형광, 발색, 동위원소와 같이 특정한 방식의 표지를 이용하게 된다. 표지기술은 감도를 높이는 데 있어서 중요한 기술이기는 하나, 표지에 의해 생체분자가 변형되거나 저분자 물질은 표지가 불가능할 수 있는 문제점이 있다. 또한 표지과정에서 시료가 많이 소모되며 2~3단계의 공정을 더 거쳐야 하는 문제점이 있다. 현재 주로 사용되고 있는 대표적인 표지 방식으로는 레이저를 이용한 형광검출법 등이 있다. 상기 레이저를 이용한 형광검출법은 시료에 형광물질을 결합시켜 기판에 고정화된 프로브와의 반응 여부를 결합시킨 형광물질을 이용하여 광학적으로 반응 여부를 구별하는 방법으로 현재 가장 널리 이용되고 있는 방법이지만, 반응 여부를 판별하기 위해 광학측정장비가 필요하게 되고, 이로 인해 많은 시간 및 비용이 요구되는 문제점이 있을 뿐만 아니라, 이러한 검출 방식은 DNA칩을 기반으로 한 분석시스템을 소형화하는데 어느 정도 한계가 있다는 문제점이 있다. 또한, 시료의 표적 분자에 형광을 내는 물질을 달아주는 단계가 추가적으로 필요하며, 비표지 방식의 검출 방법에 비해 번거롭다는 단점이 있다.
따라서 비표지 방식의 측정기술이 DNA칩 기술분야에서 점점 요구되고 있다. 비표지 방식의 검출 방법의 하나로서 전기화학적 검출법이 있는데, 이는 프로브와 시료가 결합한 전극 상에서 다른 화학물질의 전기화학반응을 이용하여 반응 여부를 검출하는 방법이지만, 이는 형광검출법에 비해 비교적 측정능력이 떨어지는 문제점이 있다.
이와 같이 종래에 실시하고 있는 검출 방법은 어느 정도 그 효율성에 한계가 있기 때문에 이를 적용하여 실행하는 생화학 실험에 대한 실질적인 사용상의 신뢰도 및 만족도가 극소화되는 문제점들이 항상 내포되어 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 DNA칩이 가지고 있는 고가의 별도의 장비가 필요한 문제점 및 비효율성을 극복하기 위해 예의 노력한 결과, DNA 프로브와 결합한 목적핵산에 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 결합시키고, 금속 인핸싱 용액 (enhancing solution)을 반응시킬 경우, 금속 인핸싱 용액에 의해 금속 나노입자가 육안으로 관찰할 수 있을 정도로 증폭되어 별도의 장비 없이 비표지 방식의 검출이 가능하고, 나아가 일반적인 스캐너를 이용해 목적핵산의 정량적인 분석이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고가의 장비 없이 육안으로 신속하게 핵산을 검출 및 정량하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산의 검출방법은 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용함으로써, 다른 어떠한 장비 없이도 육안으로 핵산 검출이 가능하여 기존의 검출 방식보다 검출 시간 및 분석 비용이 절감되는 효과뿐만 아니라 장치의 소형화가 가능하여 가축 농장이나 가정 등에서 현장 진단이 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 핵산의 검출방법 과정을 개략적으로 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 있어서 인터컬레이터인 다우노루비신이 이중 핵산에 결합되는 과정을 개략적으로 나타낸 그림 및 다우노루비신과 금 나노입자가 컨쥬게이트하는 과정을 개략적으로 그림으로 나타낸 것이다.
도 3은 목적핵산 DNA와 특이적 혼성화 반응이 일어난 결과로서 DNA 농도별로 얻은 스팟 및 이를 gray scale로 정량 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 기판의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 DNA칩 제작을 위한 고체 기판이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄, 화합물 반도체 및 실리콘 등이 있을 수 있으며, 가장 바람직하게는 유리기판을 이용할 수 있다. 상기 기판은 표면 처리되는 데, 표면처리는 프로브 분자의 부착 및 고정화를 용이하게 하기 위해 수행된다. 또한 표면처리는 DNA칩의 기질 표면에 생물분자를 고정화시키기 위한 관능기를 포함할 수 있도록 수행될 수 있다. 예컨대 상기 기판은 알데히드기, 카르복실기 또는 아민기로 개질될 수 있다. 유리 기판이나 반도체 기판의 경우 실란 처리를 하여 아미노기(-NH3, -NH2 등)를 형성할 수 있다. 또한 실란 처리를 효과적으로 하기 위해 실란 처리 전에 하이드록실(hydroxyl, -OH)기를 만들기 위한 처리를 할 수도 있다. 본 발명의 목적상 프로브 분자를 기판에 고정시키는 방법은 제한 없이 사용될 수 있으며, 화학 또는 물리적 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 유리기판의 표면에 O2 플라즈마 처리를 하여, 유리기판의 표면에 -OH기가 노출되도록 하고 표면에 아민기로 관능화한 후, 아민으로 처리되었던 표면을 카르복실기로 치환시킨 다음, 아민기(-NH2)를 갖고 있는 프로브인 DNA와 공유결합인 펩타이드 결합을 통해 상기 기판 위에 고정화시켰다. 상기 DNA와 결합하지 않은 기판은 배경 염색이 되지 않도록 아민기를 갖고 있는 PEG(polyethylene glycol)와 반응시켜 블로킹시켰다.
본 발명에서 용어 "DNA 프로브"란, 시료 내의 검출하고자 하는 목적핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 목적핵산의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미하는 것이다.
본 발명에서 용어 "목적핵산"이란, 시료 내에 존재하고 있는지 여부를 검출하고자 하는 물질로서, 목적핵산의 종류는 DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 등 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 DNA이다. 보다 구체적으로, 상기 목적핵산은 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"란 검출하고자 하는 목적핵산이 들어 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 '스팟(spot)'이란 프로브가 기판 상에 미세 집적된 부분을 의미하는 것으로, 즉, DNA칩 등과 같은 기판 상에 DNA 프로브가 고정된 부분을 의미하는 것이다.
목적핵산을 포함하는 시료를 DNA 프로브가 고정된 기판과 접촉시키면 시료 내의 목적핵산과 프로브 분자의 특이적인 결합반응, 즉, 목적핵산과 DNA 프로브 사이의 상보적인 서열끼리의 특이적인 혼성화 반응이 일어난다.
본 발명의 일 실시예에서는 기판 위에 목적핵산을 감지할 수 있는 프로브를 고정화시키고, 프로브가 반응하지 않은 부분은 비특이적인 반응을 줄이기 위해 블로킹 분자를 사용하여 블로킹하였다. 여기에 측정하고자 하는 목적핵산을 반응시키게 되면 이에 상보적인 서열을 갖는 프로브와 목적핵산이 혼성화되어 이중나선 형태를 이루게 된다. 목적핵산을 반응시킨 후, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키면, 혼성화된 이중나선 핵산에만 인터컬레이터가 결합하고, 혼성화가 되지 않은 부분에는 인터컬레이터가 결합하지 않기 때문에 나노입자들이 붙지 않게 된다.
본 발명에서 용어 "인터컬레이터(intercalator)"란 이중나선 핵산에 인터컬레이팅할 수 있는 모든 물질을 지칭하는 것으로, 예컨대, 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 하이드로크로라이드(daunorubicin hydrochloride), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 아크리딘오렌지(Acridin Orange) 등 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 금속 나노입자 용액을 제조한 다음, 인터컬레이터를 첨가하여 반응 시킴으로써, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 제조하였다. 여기서, 금속 나노입자 용액에 첨가되는 인터컬레이터의 비율은 0.1mM 내지 1mM이며, 반응시간은 약 3시간 내지 10시간 정도일 수 있다. 이때, 상기 컨쥬게이트된 금속 나노입자는 투석과 같은 종래의 정제 방법을 통해, 인터컬레이터와 결합되지 아니한 금속 나노입자를 제외하고, 다우노루비신이 컨쥬게이트된 금속 나노입자만을 수득할 수 있다.
상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)일 수 있으며, 금속 이온과 환원제를 혼합하여 제조할 수 있고, Sigma와 같은 시약회사에서도 상업적으로 용이하게 입수 가능하다.
본 발명에서 상기 (c) 단계의 금속 인핸싱 용액을 반응시키는 단계는 혼성화된 이중나선 핵산에 결합한 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자의 크기를 증폭하여 목적핵산의 검출을 육안으로 측정하기 위한 단계이다.
본 발명에서 용어 "금속 인핸싱 용액"이란, 금속 이온으로 이루어진 용액으로 금속 나노입자를 촉매로 하여 상기 금속 나노입자 주변에 금속 이온들이 환원이 되면서 나노입자의 크기를 증폭시킬 수 있는 용액을 의미하며, 나노입자의 크기를 증폭시킬 수 있는 금속 인핸싱 용액으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 용액은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 금 (Au), 은 (Ag), 구리 (Cu), 백금 (Pt) 또는 팔라듐 (Pd) 이온을 포함하는 용액일 수 있으며, 가장 바람직하게는 금 이온을 포함하는 용액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 목적핵산은 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화를 육안으로 확인함으로써 검출할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 반사법 또는 투과법과 같은 광학적 원리를 이용하여 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하여 검출할 수 있다. 이 때, 최종 검출신호는 흑과 백의 그레이 스케일의 크기에 따라 표현할 수 있다.
예컨대, LED 또는 Laser Diode와 같이 단파장광원을 사용하고 광검출장치로는 CMOS, 혹은 CCD와 같은 Photodiode array를 사용하여 그레이 스케일 광 세기를 측정할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 일반적인 광학 스캐너로 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금 나노입자를 반응시키고, 금 인핸싱 용액을 1분 동안 반응시켰다. 그 결과 금 이온이 환원이 되면서 금 나노입자 주변에 금속이 코팅되면서 상기 입자의 크기가 커져서 목적핵산이 붙은 영역이 회색 빛깔을 띄어 육안으로 관찰할 수 있었다. 구체적으로, 프로브에 특이적으로 반응한 부분이 진한 회색을 띄고 있으며, 비특이적인 부분은 매우 연한 회색을 띄거나 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의한 경우 간단히 목적핵산 또는 프로브 분자에 형광 물질 등을 표지시키거나 별도의 광학 장치나 형광 스캐너 없이 육안으로 DNA칩을 이용하여 목적핵산을 검출할 수 있다 (도 1).
본 발명은 다른 관점에서, (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계; (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계; (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 (d) 단계의 금속 인핸싱 용액에 반응한 부분의 반응의 세기를 측정하는 단계는 시료 내에 존재하는 목적핵산을 정량 분석하기 위한 단계로, 시료 내에 존재하는 목적핵산의 농도가 증가할수록 금속 인핸싱 용액에 반응한 부분의 반응의 세기 또한 증가하므로 목적핵산을 정량할 수 있다.
상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사법 또는 투과법과 같은 광학적 원리를 이용하여 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하여 이루어 질 수 있으며, 최종 검출신호는 흑과 백의 그레이 스케일의 크기에 따라 표현할 수 있다.
예컨대, LED 또는 Laser Diode와 같이 단파장광원을 사용하고 광검출장치로는 CMOS, 혹은 CCD와 같은 Photodiode array를 사용하여 그레이 스케일 광 세기를 측정할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 일반적인 광학 스캐너로 분석할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 목적핵산이 1pM 에서 100nM 까지로 농도가 증가할수록 회색 스팟이 진해지고 커지는 것을 확인하였고, 일반 스캐너로 찍어서 아도브(Adobe)사의 포토샵 소프트웨어를 이용하여 gray scale로 분석하여 얻은 결과는 목적핵산의 농도가 증가할수록 gray scale 값도 증가하는 반면, 목적핵산이 붙지 않은 주변 기판에서는 농도에 상관없이 일정한 값을 나타내는 것을 확인하여, 일반적인 스캐너와 보통의 소프트웨어를 이용하여 목적핵산의 정량 분석이 가능함을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자의 제조방법
인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 제조하기 위하여, 용기에 18.5ml의 증류수를 넣고 500RPM으로 shaking하면서, 10mM HAuCl4 500μL, 10mM Sodium Citrate 500μL, 100mM NaBH4 500μL를 첨가하고 3시간 동안 반응시킨 후, 10 % Sodium Dodecyl Sulfate(SDS) 400μL 첨가 후, 마지막으로 10mM 다우노루비신(Sigma Aldrich) 400μL를 첨가하여 최종 농도가 0.2mM이 되도록 6시간 이상 반응시킨 다음, 최종적으로 Sodium Citrate(2.5mM), 0.2% SDS 용액에 Dialysis(투석) 하여, 금 나노입자에 붙지 않은 다우노루비신을 제거한 후, 최종적으로 정제된 다우노루비신이 컨쥬게이트된 금 나노입자를 얻었다.
유리기판의 처리
유리기판을 피라나 용액(piranha solution)을 이용하여 세정시키고, O2 플라즈마 처리를 하여 유리기판의 표면에 -OH기가 노출되도록 하였다. 상기 유리기판을 에탄올 용액에 준비한 2% APTES(aminopropyltriethoxysilane)로 두 시간 동안 반응시켰다. 2시간 반응 후, 에탄올로 표면을 깨끗이 씻고 건조를 시킨 다음, 120℃ 핫플레이트에서 1시간 동안 baking을 시켜서, 유리 기판의 표면을 아민(amine)으로 관능화(functionalize)시켰다. 상기 기판을 DMF(dimethylformamide)에 넣은 1 M 숙신산 무수물(succinic anhydride)로 하루 밤 동안 반응을 시킨 후, 세정을 하여 아민으로 처리되었던 유리기판을 카르복실기(-COOH)로 치환을 시켰다.
DNA칩의 제작
DNA칩을 제작하기 위하여, 먼저 EDC/NHS를 15분간 반응시킨 후, NH2-O-AATGGTTTATTCTGCTCA(이하, "H5"라고 명명함)로 이루어진 10 μM의 DNA와 NH2-O-GACATCAAGCAGCCATC(이하, "HM"이라고 명명함)로 이루어진 50 μM의 대조구 DNA를 1시간 동안 반응시켜서, 상기 실시예 1에서 준비한 유리기판에 프로브 역할을 하는 DNA를 고정시켰다. DNA가 고정되지 않은 부분을 블로킹시키기 위해서, 말단에 아민으로 되어 있는 1M Ethanol Amine을 1시간 동안 반응시켜서, 프로브가 부착된 DNA칩을 제작하였다.
목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응
상기 실시예 2에서 제작한 프로브가 부착된 DNA칩과 목적핵산 DNA의 특이적 혼성화 반응을 확인하기 위해, 프로브인 H5 DNA에 상보적인 서열번호 1인 TGA GCA GAA TAA ACC ATT의 서열을 갖는 목적핵산 DNA(Bioneer, Korea) 및 대조구인 서열번호 2인 GAT GGC TGC TTG ATG TC를 Hybridization Buffer (5XSSC,0.2%SDS)에 희석하여 농도별로 각각 혼성화 반응을 시켰다.
목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응의 증폭 및 측정
목적핵산 DNA와 특이적인 혼성화 반응의 증폭 및 측정을 위해, 상기 실시예 4에서 혼성화 반응을 시킨 DNA칩을 SSC 완충용액으로 씻어서, 반응하지 않은 DNA를 제거하였다. 그 후, 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금나노입자를 10분 동안 반응시킨 후, SSC 완충용액으로 씻은 다음 금 인핸싱 용액 (0.85mL HAuCl4(10mM), 0.25mL AgNO3 (10mM), 0.27mL Ascorbic acid(100mM), 20mL CTAB(100mM))으로 1분 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 혼성화 반응이 진행된 DNA칩을 물로 씻어서, 특이적 혼성화 반응을 관찰하였다.
먼저 유리기판에 형성된 스팟을 일반스캐너로 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 목적핵산 DNA와 특이적 혼성화 반응이 일어난 부분에만 회색 빛깔의 스팟(spot)이 생긴 것을 육안으로 확인할 수 있었다. 도 3에서는 목적핵산 DNA가 프로브인 H5에 특이적으로 붙어 회색 빛깔을 내는 스팟을 형성하였고, 대조구 DNA가 대조구인 HN에만 특이적으로 붙어 회색 빛깔을 내는 스팟을 형성하였다. 상보적이지 않은 프로브 DNA와 목적핵산 DNA에서는 스팟이 보이지 않거나 희미하게 보이는 것을 확인하였고, 목적핵산 DNA의 농도에 따라 회색 빛깔의 세기가 크게 나오는 것을 확인함으로써, 본 발명의 혼성화 반응이 특이적으로 이뤄지며, 혼성화 반응이 일어난 프로브 DNA와 목적핵산 DNA의 결합에 인터컬레이터가 결합하고, 환원 반응을 일으키는 금 인핸싱 용액을 처리하였을 경우, 별도의 광학 기기 없이 육안으로 스팟을 확인할 수 있을 정도로 금 나노입자를 촉매로 하여서 금속 이온들이 환원이 되면서 입자의 크기를 키우게 되는 것을 확인하였다.
또한, 목적핵산 DNA의 농도별로 얻은 스팟을 아도브사(Adobe)사의 포토샵 소프트웨어를 이용하여 gray scale로 정량 분석한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 농도별로 1 pM에서 100 nM까지 gray scale 값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 목적핵산이 붙지 않은 주변 기판에서는 농도에 상관없이 배경 염색이 되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Method for Detecting of Nucleic Acid Using Intercalator-Conjugated Metal Nanoparticle <130> P11-B052 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target DNA <400> 1 tgagcagaat aaaccatt 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control <400> 2 gatggctgct tgatgtc 17

Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 검출방법:
    (a) 목적핵산과 혼성화하는 DNA 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산에 인터컬레이터(intercalator)가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및
    (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적핵산의 검출은 육안으로 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 (daunorubicin), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 아크리딘오렌지(Acridin Orange)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 금속 인행싱 용액은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 금속 인행싱 용액은 금속 이온을 환원시켜서 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자의 크기를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 이용한 핵산의 정량방법:
    (a) 목적핵산과 혼성화하는 프로브가 고정된 기판에 목적핵산을 포함하는 시료를 적용하여 프로브와 목적핵산을 혼성화시키는 단계;
    (b) 인터컬레이터가 컨쥬게이트된 금속 나노입자를 상기 (a) 단계에서 혼성화된 이중나선 핵산과 반응시키는 단계;
    (c) 상기 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자에 금속 인행싱 용액(enhancing solution)을 반응시키는 단계; 및
    (d) 상기 반응된 스팟의 색상 변화를 분석하여 목적핵산을 정량하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기판은 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 금, 은, 구리, 알루미늄 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 젠타마이신 설페이트(gentamicin sulfate), 다우노루비신 (daunorubicin), 노갈라마이신(nogalamycin), 독소누비신(doxorubicin), 헤다마이신(hedamycin), 미토산트론(mitoxantrone), 틸로론(tilorone), 훽스트(hoechst 33258), 퀴나크린(Quinacrine), 아크리딘오렌지(Acridin Orange)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 금(Au), 은(Ag) 및 백금(Pt)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 금속 인행싱 용액은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계의 금속 인행싱 용액은 금속 이온을 환원시켜서 이중나선 핵산과 결합된 금속 나노입자의 크기를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 (d) 단계의 스팟의 색상 변화는 반사 혹은 투과된 광의 세기의 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 핵산의 정량방법.






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