JP2005308407A - マイクロアレイ用チップと、その製造方法及びその検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来の３次元マイクロアレイ用チップは、各孔の内壁から発光分子から発光した光が透過して漏れた光が光学像にボケを生じさせ、反応情報を正確に得ることができない。
【解決手段】本発明は、チップ基板に設けられた孔の内壁に高反射率を有する反射膜を形成することにより、プローブとの間で特異的な反応が起こった生体関連物質に、直接的又は間接的に標識された物質から放射される光が各孔の内壁を透過せずに、殆どの光が内壁上で反射して、チップ基板表面及び裏面から放射され、互いの反応情報（出力輝度値）が干渉しない光強度プロファイルが得られ、散在する生体関連物質に、直接的又は間接的に標識された物質の分子数を正確に検出して、厚さ方向に発生する反応情報を正確に得るマイクロアレイ用チップとその製造方法及びその検出方法である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体関連物質の検出に用いるマイクロアレイ用チップと、その製造方法およびマイクロアレイ用チップの検出方法に関する。

近年、人間を含む多くの生物や稲をはじめとする多くの植物に対する遺伝子の解析が進められている。この解析に利用されるものとして、半導体等にＤＮＡを規則正しく配列したＤＮＡチップ又は、ＤＮＡマイクロアレイ用チップを用いた新規な検出方法が提案されている。この新規な検出方法では、同時に複数の遺伝子を検出することが可能である。

これらのマイクロアレイ用チップとしては、アルミニウムのリン酸皮膜や繊維質等の厚み方向に吸収し得る材料から成るチップ基板に、異なる多数のプローブ溶液をディスクリートに微量供給し、それぞれのプローブを各領域の内壁に固相化することにより、生体関連物質検出のための３次元マイクロアレイ用チップが製作されている。

この３次元マイクロアレイ用チップの特徴は、供給するプローブ溶液が横に広がらず厚み方向（縦方向）に配置されているため、同じ感度で非常に小さな面領域のプローブが形成できることである。また感度は縦方向にプローブ領域を伸ばすことで高感度を実現できる。即ち、この３次元マイクロアレイ用チップは、高密度化と高感度化を実現している。

例えば、特許文献１においては、３次元マイクロアレイ用チップの高感度性を生かすために、非光吸収性の素材として、アルミニウムの陽極酸化膜の基板を用いた技術が開示されている。また、特許文献２においては、３次元ＤＮＡマイクロアレイを用いて、簡便に短時間で遺伝子を検出できる遺伝子検査装置が提案されている。ここでは、反応液は多孔質のフィルタを坦体とする３次元ＤＮＡマイクロアレイの反応容器に入れられ、シリンジポンプ等のポンプによる加圧・減圧によって繰り返し、反応部を透過するように往来させる。各プローブと供給サンプルとの反応の結果、反応の強さに比例する発光分子がプローブと結合するようにプロセス設計がされているため、発光量を測定することにより反応情報を得ることができる。
特許第３２０８３９０号公報 ＷＯ０３／０２７６７３号

前述した３次元マイクロアレイ用チップは、高密度化を実現するために厚み方向（縦方向）に放射される光を検出して解析を行うこととなる。従って、図９（ａ）に示すように例えば、透明な多孔質材料によるチップ基板においては、厚さ（孔の内壁長）があるために内壁から漏れた光が光学像にボケを生じさせる。

一例として、生体関連物質（検体）との反応の後、チップ基板内部で隣接する孔（プローブ）内にそれぞれ３個及び１個の発光分子が存在するものとする。これらを検出しようとする場合、図１０（ｂ）に示すように、各発光分子から発光される光には内壁を透過して外部に放射される光が多く存在する。これらの光は、チップ表面において、発光分子の厚さ方向に分布しているために、図１０（ａ）に示すように境界部にボケを伴うプロファイルとなる。

このボケは、図９（ａ），（ｂ）に示すように、出力輝度値のエッジ部分を鈍らせて広い画面領域に広がりを持たせるため、すそ部分はノイズとして作用する。その結果、ノイズの発生量によっては、画像解析後のマイクロアレイの情報を正確に得ることができないという欠点を生じさせている。
そこで本発明は、３次元マイクロアレイ用チップで厚さ方向に発生する反応情報を正確に得ることができるマイクロアレイ用チップと、その製造方法及びその測光方法を提供することを目的とする。

本発明は上記目的を達成するために、チップ基板の主面に対して略垂直方向で、生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブが固相可能で微小な内径の複数の孔を備え、少なくとも前記孔の内壁上に、光の不透過性を有し、且つ入射角３０°の計測波長の光に対して、４０％以上の反射率を有する金属で形成されるか、又は金属膜を被覆するマイクロアレイ用チップを提供する。

また、透明部材からなる平板形状のチップ基板の主面に対して略垂直方向で微小な内径の複数の孔を形成する工程と、少なくとも前記孔の内壁上に、光の不透過性を有し、且つ入射角３０°の計測波長の光に対して、４０％以上の反射率を有する金属で形成されているか、又は金属膜を被覆する工程と、前記孔の内壁上に被覆した金属膜上に所望する生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブを固相する工程とからなるマイクロアレイ用チップの製造方法を提供する。

さらに、チップ基板の主面に対して略垂直方向で、生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブが固相される孔を備え 前記孔の内壁上に、入射角３０°の計測波長の光に対して４０％以上の反射率を有する金属で形成されているか、又は金属膜を被覆するマイクロアレイ用チップに生体関連物質を供給し、前記プローブと生体関連物質との間で特異的な結合反応を起こさせる。前記生体関連物質に直接的又は間接的に標識された物質から放射される光で前記孔の深さ方向と同じ方向に放射される光を検出して画像解析により、前記マイクロアレイ用チップ上での反応情報を得るマイクロアレイ用チップの検出方法を提供する。

以上のような本発明によれば、マイクロアレイ用チップのチップ基板に設けられたプローブを固相するための孔の内壁に高反射率を有する反射膜が形成され、前記プローブと特異な反応をした生体関連物質に直接的に又は間接的に標識された物質から放射される光が各孔の内壁を透過せずに、殆どの光が内壁上で反射して、チップ基板表面／裏面から、隣接する孔間で光強度プロファイルが干渉しないように放射される。チップ基板表面の近傍に配置された撮像部により、放射された光を入射して光電変換を行い出力輝度値が得られ、正確に散在する発光分子数を検出して、厚さ方向に発生する反応情報が得られる。

本発明によれば、プローブと特異的な反応をした生体関連物質に、直接的又は間接的に標識された物質から放射される光を内壁で反射させて、チップ上面において出力輝度値が干渉しない光強度プロファイルを生成し、正確に散在する発光分子数を検出して、厚さ方向に発生する反応情報を正確に得ることができる生体関連物質を検出するマイクロアレイ用チップと、その製造方法及びその測光方法を提供することができる。

以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明は、生体関連物質（検体）を検出するための新規なマイクロアレイ用チップと生体関連物質の検査方法を提案するものである。尚、本実施形態において、「生体関連物質」とは、動物、植物、微生物等の細胞のみならず、これらに寄生しなければ自ら増殖できないウイルス等に由来する物質をも含むものとする。さらに、この生体関連物質は、これらの細胞等より直接抽出・単離された天然形態のもののみならず、遺伝子工学的手法を利用して生産されたもの、化学的に修飾されたものも含むものとする。より具体的には、ホルモン類、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸等が含まれる。また、「プローブ」とは、上記の生体関連物質に対して特異的に結合する物質を意味し、例えば、ホルモン等のリガンドとその受容体、酵素とその基質、抗原とその抗体、特定配列を有する核酸とこれに相補的な配列を有する核酸等の関係にある何れかが含まれるものとする。

図１は、本発明によるマイクロアレイ用チップに係る第１の実施形態として、マイクロアレイ用チップの概念的な断面構成例と配置例と出力輝度値の分布例を示している。このマイクロアレイ用チップ１は、外形が平板形状で、表面（又は裏面）である主面に対して厚さＬ方向（垂直方向）に即ち、３次元に孔２が多数形成されたチップ基板３により構成
されている。これらの孔２の内壁には生体関連物質（検体）と反応するプローブが内壁に固相される。尚、図１（ｃ）はチップ基板３の一部領域を示している。

これらの孔２は、基板の表面から裏面に抜ける貫通穴であり、真円形状、楕円形状又は、多角形形状でもよい。例えば、真円形状であれば、チップ基板３にマトリックス状に配置することができる。また、孔が６角形であれば、ハニカム状に配置することもできる。

孔２の標識物質からの放射光に対するノイズは、孔２の内壁を透過して漏れた光及び、孔２内の回折光が主であり、この回折光は孔２の内径を小さくすることで発生するノイズは小さくなる。実質的な孔の内径（又は対角線）は、例えば０．１μm以下から１μm程度の範囲で実現でき、好ましくは０．２μm前後が好ましい。

これらの孔２の内径は、小さいほど高密度化及び小型化が実現できるが、標識物質から放射された光像を撮像する撮像素子の解像度やプローブの固相が可能か否かに依存してそのサイズが制限される。また撮像素子の画素（ピクセル）の大きさ（受光面積）に対して、孔が微小な場合には拡大機能する光学系を設けてもよい。

このマイクロアレイ用チップ１は、透明部材、例えばガラスや透明樹脂等で形成され、又は後述する高反射率を有する金属材料で形成される。この例では、孔２はマトリックス状に配置されている。この配置は、適宜変更することは容易に可能である。
チップ基板３は、計測波長の光に対して高反射率を有する金属材料により形成される、又は、図１（ｂ）に示すように、プローブが固相される基板表面、ここでは、孔の内壁表面に高反射率を有する金属膜４が被覆される。

この金属材料又は金属膜４による光の高反射により、検出時において図１（ｂ）に示すように発光分子から発光した光は、チップ基板３の孔２の内壁を透過せずに、殆どの光が内壁上で反射して、チップ基板の２つの主面（表面及び裏面）から放射される。放射された光は、図１（ａ）に示すような互いの反応情報（出力輝度値）が干渉しない光強度プロファイル、即ち、矩形プロファイルを示し、隣接するプローブ間の２つの強度比は、正確にそれぞれに散在する発光分子数の比３：１となっている。

このような隣接するプローブから出力輝度値が干渉しない光強度プロファイルを得ることにより、正確に散在する発光分子数を検出して、厚さ方向に発生する反応情報を正確に得ることができる。

次に図２を参照して、第２の実施形態について説明する。
本実施形態は、図２（ｂ）に示すように、チップ基板３には多数の有底孔５が形成されている。これらの有底孔５の内壁表面５ａ及び底表面５ｂには、前述した第１の実施形態における上記高反射率を有する金属膜４が被覆されている。有底孔５の内径は、第１の実施形態における孔２の内径と同等である。尚、チップ基板３は、前述した第１の実施形態と同様に、高反射率を有する金属材料により基板自体を形成してもよい。

このように有底孔５として構成することにより、底面で反射した光も重畳されて、開口された側に反射光が放射されるため、各プローブに対応する２つの出力輝度値は、図２（ａ）に示すように、いずれも図１に示したチップ基板３に比べて、２倍の出力輝度値として得ることができる。

従って、第２の実施形態によるマイクロアレイ用チップは、隣接する有底孔（プローブ）５間の２つの出力輝度値は、干渉せずに増感効果を生じさせる。このため、ノイズが低減できる上、例えノイズが発生しても検出信号（出力輝度値）のレベルが高いため、その影響を少なくすることができ、更に反応情報を正確に得ることができる。

次に図３を参照して、第３の実施形態を説明する。
本実施形態は、図３（ｂ）に示すように、チップ基板３には多数の孔２が形成されている。前述した図１（ｂ）に示した第１の実施形態のチップ基板３と同等であり、複数の孔２を有している。さらに、このチップ基板３の一方、例えば、裏面側から反射鏡等の高反射率を有する反射部材６で孔２を塞ぐように配設する。

この構成では、図２（ｂ）で示した構成と同様に、反射部材６による反射光が重畳して、図３（ａ）に示すように、２つの出力輝度値はいずれも図１（ａ）に示した出力輝度値に対して２倍となる。

本実施形態によれば、標識物質からの放射光がチップ基板３の孔２の内壁を透過せずに、殆どの光が内壁及び孔底部で反射して、チップ基板表面に隣接する孔間で互いの光が干渉しない出力輝度値の矩形プロファイルとなる。さらに、孔底部（反射部材６）で反射した光が重畳して増感効果を生じ、得られる出力輝度値が高くなり、第２の実施形態と同様な効果が得られる。また、プローブの反応時には、反射部材６は取り付けられていないため、孔２内を生体関連物質を含む検体溶液が容易に往来でき、反応の機会が増加して高速で効率的な反応が可能となる。尚、本実施形態に用いる反射部材は、測光すべき光が外部に漏れないように、マイクロアレイ用チップと密着して配設する。

本実施形態では、説明を容易にするために、１孔を１プローブとして説明したが、実際には、図４に示すように複数の孔を１プローブとして扱う場合もあり、この場合でも全く同様の効果を得ることができる。

次に、前述した第１乃至第３の実施形態における金属膜について説明する。
図５は、アルミニウム陽極酸化膜に表面処理を行なって膜表面の反射率４０〜１００％有する基板により得られた輝度信号の特性のデータの一例であり、図６はそのデータに基づく特性図である。図中のＲは、計測波長の光に対して入射角が３０°の時の反射率である。

図５に示すように、この例ではピクセル番地６からピクセル番地３０と、ピクセル番号４６からピクセル番地７０とで出力された輝度信号が得られている。従って、チップ基板内に形成される孔の内壁の反射率が、少なくとも４０％以上であれば、スポット外に漏れる信号が減少し、実質的にバックグラウンドの低減効果を充分有することが確認できる。これらの図５及び図６から、反射率は４０％以上であれば実施可能であり、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上である。

このように反射率が高くなると、スポット外（例えば、ピクセル番地３２）に漏れる信号が極端に減少し、バックグラウンドが低減する効果だけでなく、スポット密度を向上させることが可能となる。従って、デバイスの微小化、少量の検体溶液での測定等が可能となる。

金属材料やガラス材料からなるマイクロアレイ用チップにおける孔の形成は、半導体製造技術を用いて形成することができる。例えば、シリコンも高反射率を有する金属材料からなるチップ基板上にフォトリソブラフィ技術により孔部分が開口させるためのフォトレジストマスクを形成する。ウェットエッチング又はドライエッチングを用いて、孔を形成した後、フォトレジストマスクを除去する。ウェットエッチングとしては、例えば、フッ酸と硝酸、フッ酸と過酸化水素を含む溶液を用いて、金属基板上に多数の孔を一度に作製することが可能である。さらに、孔径０．２μmよりも小さく且つ深く、アスペクト比が高い場合には、異方向性エッチング、例えば、ＥＣＲ（ 電子サイクロトロン共鳴）エッチングや反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）等が好ましい。

また、異なる方法としては、例えば、鋳型に紫外線硬化樹脂を含浸させ、鋳型を取り外すか、除去する。すると、ネガティブタイプの樹脂マスクが得られる。次に、この樹脂マスクを鋳型として電鋳した後、樹脂マスクを除去すると、鋳型と同じ構造を有する金属基板を作製することができる。例えば、アルミニウムの陽極酸化膜やＳcience vol.258 p783に示されているようなナノチャンネルガラスアレイや浜松ホトニクスより市販されている穴径が数μmから数百μmのガラス管を２次元配置したキャピラリプレートや種々の金属管を鋳型とすることが可能である。

また、メッキ技術を用いて、チップ基板に設けられた孔の内壁上に高反射率の金属膜を形成することもできる。孔の内壁上に析出させる金属は、メッキ溶液とチップ基板との組み合わせて適切なメッキ方法を選択することにより形成する。例えば、電気メッキ、電着塗装、電解液中に非導電性の粒子を懸濁して行う複合メッキ、無電界メッキを用いることが可能である。この時、金属の被覆の厚さが厚くなるにしたがって、表面が粗くなり、反射率が低下するため、例えば、にかわやゼラチン等の光沢剤を添加してもよい。無電界メッキや電着塗装は、３次元基板のような複雑な形状のものにも一様な厚さの被覆を行うことができるので、特に好ましい。

これらのメッキ技術により析出させる金属としては、Ａｕ，Ｐｔ，Ｐｄ等がある。これらの貴金属は化学的な耐性が高く、またプローブを容易に固相化可能であるので、特に好ましい。但し、チップ基板は、メッキ溶液に対する耐性が求められるため、特に溶液のｐＨには注意を払う必要がある。

このメッキ技術に好適するチップ基板は、樹脂基板、Ａｌ,Ｈｆ,Ｔａ,Ｔｉ,Ｗ, Ｚｒ等の金属の陽極酸化膜がある。さらに好適するものとしては、特表平９−５０４８６４号公報に開示されているようなシリコンウエハをエッチングして製造した多孔形成ウエハやナノチャンネルガラス等が挙げられる。樹脂からなるチップ基板は、中空の繊維、例えば、中空糸を並べて溶着したり、接着剤で接着したりすることにより製造することが可能である。

また、フォトリソグラフィ技術を利用する方法がある。紫外線硬化樹脂からなるフォトレジスト膜をチップ基板上に塗布し、ネガティブマスクまたはポジティブマスクを用いて紫外線による露光を行い、所望のパターン構造を作製することも可能である。

さらに、シリコンウエハやガラス等で孔を有するチップ基板を形成した場合で、孔の内径が小さい場合などは、例えば、化学気相成長（ＣＶＤ：プラズマＣＶＤ、選択ＣＶＤ等）やスパッタリング（マグネトロンスパッタリング等）又はＥＣＲ（ＥＣＲスパッタリング、ＥＣＲプラズマＣＶＤ等）の薄膜形成技術により金属膜を被覆させて、化学処理やアニール処理等により表面研磨を行って、高反射率の物質を形成しても良い。但し、内径が小さく深い孔、即ちアスペクト比が大きい場合、さらに有底孔であった場合などは、同じ薄膜形成技術における真空蒸着は、孔内へ蒸気が入り込めず、成膜しなかったり、膜厚ムラが発生するため好適せず、また膜密着性が低くプローブ固相や反応の際のストレスにより膜剥離が発生する虞があるため、本実施形態では採用していない。

次に前述した第１乃至第３の実施形態におけるマイクロアレイ用チップの作製例について説明する。
第１の作製例は、前述した第１の実施形態におけるマイクロアレイ用チップの構成を利用するものであり、チップ基板３表面にＡｕをメッキによる成膜及び、Ａｌ陽極酸化処理により、マイクロアレイ用チップを作製する一例である。

まず、シアン化金カリウム２ｇ、塩化アンモニウム７５ｇ、クエン酸ナトリウム５０ｇ、次亜リン酸ナトリウム１０ｇを１０００mlの純水に溶解し、９０℃程度に加温する。この溶液にアルミニウムの陽極酸化膜（例えば、ワットマン製アノディスク）を浸漬し、無電界メッキを行ない金Ａｕを被覆させる。

次に、チップ基板３の表面にチオール基を末端に付加した核酸をプローブとして固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。このチップ基板３の構造は、孔２が液体を通過することのできる構造である。

この核酸プローブと完全にマッチするオリゴＤＮＡに蛍光標識して、ハイブリダイゼーションを行なう。このマイクロアレイ用チップ１を横倍率が１倍の光学系で結像して、撮像素子（ＣＣＤ）によるデジタルカメラで撮像した。この画像から図示しないコンピュータ等の処理により、出力輝度値を算出する。

図７には、求められた出力輝度値（階調値）のプロファイルを、高反射率の金属膜を設けていない無処理のマイクロアレイ用チップと共に示す。この図から明らかなように、バックグラウンドが検出値に影響しない高い信頼性のあるデータを取得することかできる。

次に第２の作製例について説明する。
第２の作製例は、第３の実施形態におけるマイクロアレイ用チップの構成を利用するものである。この第２の作製例は、前述した第１の作成例のチップ基板３の裏面に反射鏡等の反射部材６を密着するように取り付けた構成である。この構成によれば、発光分子から発光した光を検出する場合、反射部材６による反射光が重畳して、図８に示すように、図７に示した出力輝度値の２倍の値を検出することができ、Ｓ／Ｎが更に高いデータを得ることが可能となった。

次に第３の作製例について説明する。

この第３作製例は、孔の内壁に成膜する膜に金属酸化物を用いる例である。例えば、組成が１０ＣｕＯ-５Ｋ_２Ｏ-５Ａｌ_２Ｏ_３-８０ＳｉＯ_２ (mol%)となるように、Ｓiの原料のテトラエトキシシラン、銅の原料の酢酸銅・１水和物、カリウムの原料の無水酢酸カリウム、アルミニウムの原料の硝酸アルミニウム・６水和物を計量した。

次に、テトラエトキシシランをエタノールで希釈し、酢酸銅・１水和物、無水酢酸カリウム、硝酸アルミニウム・６水和物を１mol/Lの硝酸に溶解した。この溶液を混合し、テトラエトキシシランの加水分解を行いゾル溶液を調製した。このゾル溶液にアルミニウムの陽極酸化膜（例えば、ワットマン製アノディスク）を浸漬し、室温で乾燥後、１００℃で更に乾燥を行った。

その後、酸素雰囲気の電気炉で３００℃で熱処理を行い、脱脂及び酸化を行なった。冷却後に水素雰囲気の電気炉を室温から４００℃まで昇温しながら還元処理を行い、酸化銅を還元して銅の金属を析出させた。このチップ基板の表面にエポキシシランを処理し、アミノ基を末端に付加した核酸をプローブとしてチップ基板（孔の内壁）に固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。

次に第５の作製例について説明する。
この第５の作製例は、第２の実施形態におけるマイクロアレイ用チップの構成を利用するものである。この第２の作製例のチップ基板３には、有底孔５が設けられている。

まず、チップ基板３となるアルミニウム板をエタノールと６０％の過酸化水素水の４：１の溶液中で電界研磨した後、５vol.％のリン酸と2vol.％のクロム酸の混合溶液中で１０分間煮沸して、表面についている自然酸化膜を除去する。

次に、チップ基板３を２５℃に保持された０．４mol/lのリン酸水溶液に浸漬して、２０Ｖの電圧を印加して、陽極酸化を行なう。この処理によりチップ基板３のアルミニウム表面上には陽極酸化膜が生成され、その生成後にチップ基板３を洗浄する。その後、チップ基板３表面にエポキシシランを処理し、アミノ基を末端に付加した核酸をプローブとして有底孔５内の内壁上に固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。

次に、第６の作製例について説明する。
この第６の作製例は、チップ基板自体が金属により形成されるものである。
アルミニウムの陽極酸化膜（例えば、ワットマン製アノディスク）を鋳型に用いてチップ基板を作製する。その後、メチルメタクリレートモノマーに重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイドを添加し、アルミニウムの陽極酸化膜の孔に注入した。次に、紫外線を照射して、メチルメタクリレートモノマーを重合させた。１０％の水酸化ナトリウム水溶液で鋳型を溶解して除去し、鋳型のネガティブとなったポリメチルメタクリレートを得る。次に、チップ基板上のポリメチルメタクリレート表面に無電界ニッケルメッキを施し、さらに、３３０ｇのＮｉ（Ｈ_２ＮＳＯ_３）_２・４Ｈ_２Ｏ、３０ｇのＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．９ｇのＮｉＣＯ３、３０ｇ／lのＨ_３ＢＯ_４と、０．３ｇのＣＨ_３（ＣＨ_２）_１０ＣＨ_２ＳＯ_３Ｎａを１リットルの純水に溶解し、５０℃とした溶液に鋳型のポリメチルメタクリレートを入れ、１０mA/cm^２の一定電流でニッケルを電鋳した。

鋳型のポリメチルメタクリレートを徐々に剥離し、鋳型と同じ形状をしたニッケル金属の基板を製造した。このチップ基板には、鋳型と同じ、直径が約０．２μｍの多数の貫通した孔を有していた。その後、チップ基板の表面にエポキシシランを処理し、アミノ基を末端に付加した核酸をプローブとして孔の内壁に固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。

次に第７の作製例について説明する。
この第７の作製例は、ガラスからなり、多数の孔が形成されたチップ基板の表面（孔の内壁面）に銀（Ａｇ）をメッキ技術で成膜するものである。

まず、塩化ニッケル３０ｇ、次亜リン酸ナトリウム１０ｇ、クエン酸ナトリウム１０ｇを１０００mlの純水に溶解し、約９０℃に保った。

この溶液に穴径が１２マイクロメートルのガラス管を２次元的に配列してあるキャピラリプレート（例えば、浜松ホトニクス）を浸漬し、無電界ニッケルメッキを行なった。次に、この基板の表面にエポキシシランを処理し、アミノ基を末端に付加した核酸をプローブとして基板に固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。

次に第８の作製例について説明する。
この第８の作製例は、無電界メッキ法を用いて樹脂からなるチップ基板の表面（孔の内壁）に銀（Ａｇ）膜を形成するものである。
まず、純水１０００mlに硝酸銀２０ｇを溶解し、アンモニア水を加える。この溶液中では酸化銀が沈殿するため、この酸化銀が溶解するまで、さらにアンモニア水を追加して攪拌して銀の溶液を調整する。次に、酒石酸ナトリウムカリウム１００ｇを３００mlの純水に溶解し、更に純水を加えて全量で７００mlとして還元液を調整する。

穴径５０μmのポリプロピレンの中空線維を束ねてカーボンブラックを含有した接着剤で固相し、チップ基板を作製した。このチップ基板を銀液に浸漬して撹拌しながら、還元液を加え、銀の無電界メッキを行なった。

次に、この基板の表面にエポキシシランを処理し、アミノ基を末端に付加した核酸をプローブとして孔の内壁に固相化して、核酸検出を行うためのマイクロアレイ用チップを作製した。この例により作製したマイクロアレイ用チップは、すべて、第１の作製例と同様にバックグラウンドノイズの低い信頼性の高いデータを得ることが可能である。

また、前述した第１乃至第３の実施形態において、生体関連物質として核酸を検出対象として、核酸プローブを固相化した例について説明したが、勿論、これに限定されない。例えば、核酸プローブの他には、ホルモン類、酵素、抗体、抗原、アブザイム又は、その他のタンパク質等と特異的に結合する物質をプローブとして固相化し、これらの物質を検査することも可能である。さらに、プローブとしては、例えば、ホルモン等のリガンドとその受容体、酵素とその基質、抗原とその抗体、特定配列を有する核酸とこれに相補的な配列を有する核酸等を固相化して、マイクロアレイ用チップとして使用することができる。

以上説明したように、本発明の各実施形態によれば、マイクロアレイ用チップのチップ基板に設けられたプローブを固相するための孔の内壁に高反射率を有する反射膜を形成することにより、プローブとの間で特異的な反応が起こった生体関連物質に、直接的又は間接的に標識された物質から放射される光が各孔の内壁を透過せずに、殆どの光が内壁上で反射して、チップ基板表面及び裏面から、隣接する孔間で光強度プロファイルが干渉しないように放射される。チップ基板表面の近傍に配置された撮像部により、放射された光を入射して光電変換を行い出力輝度値が得られ、正確に散在する発光分子数を検出して、厚さ方向に発生する反応情報を正確に得ることができる。

また、孔の内壁に高反射率を有する金属膜を被覆させるのに代わって、チップ基板自体を金属材料で作製し、設けられる多数の孔の内壁が高反射率を有するように研磨処理又は形成する。この金属チップ基板により同等の効果を得ることができる。

チップ基板への孔の作製や孔の内壁に金属膜を形成は、半導体製造技術を用いて実現することができる。その技術としては、フォトレジストマスクを利用したエッチング処理やＣＶＤ及びスパッタリングによる成膜処理、又はメッキ処理を利用することができる。

第１の実施形態のマイクロアレイ用チップについて説明するための図である。 第２の実施形態のマイクロアレイ用チップについて説明するための図である。 第３の実施形態のマイクロアレイ用チップについて説明するための図である。 マイクロアレイ用チップにおける複数の孔を１プローブとして扱う例について説明するための図である。 マイクロアレイ用チップの孔の内壁膜の反射率により得られる輝度信号のデータの一例である。 図５におけるデータマイクロアレイ用チップの孔の内壁膜の反射率により得られる輝度信号に基づく特性図である。 第１の実施形態を利用した第１の作製例における出力輝度値（階調値）を説明するための図である。 第３の実施形態を利用した第２の作製例における出力輝度値（階調値）を説明するための図である。 従来の３次元マイクロアレイ用チップにおける干渉が生じている光強度プロファイルのボケについて説明するための図である。 従来の３次元マイクロアレイ用チップにおける隣接するプローブに散在する発光分子について説明するための図である。

符号の説明

１…マイクロアレイ用チップ、２…孔、３…チップ基板、４…金属膜、５…有底孔、５ａ…内壁表面、５ｂ…底表面、６…反射部材。

Claims (11)

1. チップ基板の主面に対して略垂直方向で、生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブが固相可能で微小な内径の複数の孔を備え、
   少なくとも前記孔の内壁上に、光の不透過性を有し、且つ入射角３０°の計測波長の光に対して、４０％以上の反射率を有する金属膜を被覆することを特徴とするマイクロアレイ用チップ。
2. 金属材料により形成されるチップ基板の主面に対して略垂直方向で、生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブが固相可能で微小な内径の複数の孔を備え、
   少なくとも前記孔の内壁面が入射角３０°の計測波長の光に対して、４０％以上の反射率を有することを特徴とするマイクロアレイ用チップ。
3. 前記マイクロアレイ用チップにおいて、
   前記孔の内径が１μm以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロアレイ用チップ 。
4. 前記マイクロアレイ用チップにおいて、
   前記孔がチップ基板の一方の主面に開口された有底孔であることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロアレイ用チップ。
5. 前記マイクロアレイ用チップにおいて、
   前記チップ基板の主面の一方側に、少なくとも４０％以上の反射率を有する反射部材を前記孔を塞ぐように設けられることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロアレイ用チップ。
6. 前記マイクロアレイ用チップにおいて、
   前記孔は、マトリックス状に配置された真円形状、楕円形状又は多角形形状を成し又は、ハニカム状に配置された６角形形状のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロアレイ用チップ。
7. 透明部材からなる平板形状のチップ基板の主面に対して垂直方向で微小な内径の複数の孔を形成する工程と、
   少なくとも前記孔の内壁上に、光の不透過性を有し、且つ入射角３０°の計測波長の光に対して、４０％以上の反射率を有する金属膜を被覆する工程と、
   前記孔の内壁上に被覆した金属膜上に所望する生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブを固相する工程と、
   で作製されることを特徴とするマイクロアレイ用チップの製造方法。
8. 前記マイクロアレイ用チップの製造方法において、
   前記孔の内壁上に前記金属膜を被覆する工程は、
   鋳型より前記金属膜に転写を行うことを特徴とする請求項７に記載のマイクロアレイ用チップの製造方法。
9. 前記マイクロアレイ用チップの製造方法において、
   前記金属膜は、前記チップ基板の少なくとも孔の内壁を含む表面に、メッキ処理、又は電着処理により形成することを特徴とする請求項７に記載のマイクロアレイ用チップの製造方法。
10. 前記マイクロアレイ用チップの製造方法において、
    前記孔はフォトレジストマスクを用いた異方向性エッチングにより形成され、
    前記金属膜が化学気相成長又はスパッタリングにより、前記孔の内壁上に被覆することを特徴とする請求項７に記載のマイクロアレイ用チップの製造方法。
11. チップ基板の主面に対して略垂直方向で、生体関連物質に対して特異的に結合する物質からなるプローブが固相される孔を備え 前記孔の内壁上に、入射角３０°の計測波長の光に対して４０％以上の反射率を有する金属膜を被覆するマイクロアレイ用チップに固相されたプローブと直接的又は間接的に標識された生体関連物質との間で、結合反応を生じせしめ、前記生体関連物質の標識からの放射光で前記孔の深さ方向と同じ方向に放射される光を検出して画像解析により、前記マイクロアレイ用チップ上での反応情報を得ることを特徴とするマイクロアレイ用チップの検出方法。

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