JP3942146B2 - 塩基配列検出用基板の製造方法および塩基配列検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、生物の遺伝情報伝達物質であるＤＮＡあるいはＲＮＡの塩基配列を決定する技術に属し、より詳細には、ハイブリダイゼーション法により塩基配列を決定する技術に属する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡなどの核酸ポリマー中の目的遺伝子配列を検索したり、あるいは複数の核酸ポリマーの異同を判定したりする方法として、ターゲット核酸ポリマーの一部配列と相補的な一本鎖核酸ポリマーをプローブとするハイブリダイゼーション法が知られている。
ハイブリダイゼーション法では、ターゲット核酸ポリマーをスライドガラスやシリコン等の基板に固定化し、放射性同位元素（ＲＩ）もしくは蛍光物質でラベリング（標識）したプローブ核酸ポリマー水溶液を膜上に加える。プローブ核酸ポリマーがターゲット核酸ポリマーにハイブリダイズした場合には、水洗の後、膜にはターゲット核酸ポリマーとハイブリダイズしたプローブ核酸ポリマーだけが残存する。プローブ核酸ポリマーにラベリングされたＲＩからの放射能や、あるいは蛍光物質が発する光や沈殿物の色を検出することにより、ターゲット核酸ポリマー中に目的とする配列が存在するか否かを判定することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
標識としてＲＩを用いる方法は、放射性物質取り扱い施設とその維持管理に多大な費用と労力を要するばかりでなく、取り扱い者の健康の点でも問題があるため、近年では一般的に、蛍光物質を標識に用い、蛍光測定装置を用いて測定が行われている。
しかしながら、プローブ核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングするには特別な修飾処理を必要とするため手間がかかるし、励起光による蛍光物質の褪色は避けられないため、高精度に測定を行うためには専用の高価な蛍光測定装置が必要となる。
また、ターゲット核酸ポリマーの基板への固定化効率が悪く、固定化のために大量のターゲット核酸ポリマーを必要とするため、ターゲット核酸ポリマーが微少量しか入手できない場合には測定を行うことは難しい。
また、他の方法として、固体基板上に直接一本鎖プローブ核酸ポリマーを固定化し、ターゲット核酸ポリマーとのハイブリダイゼーションを行い、プラズモン共鳴法あるいは水晶振動子法などにより検出する方法もあるが、この方法の場合も、核酸ポリマーを基板に固定化するために分子構造を修飾する必要があり、その固定化の制御が難しいといった問題がある。
【０００４】
本願発明は、このような事情の下に創案されたものであり、その課題は、核酸ポリマーをＲＩまたは蛍光物質でラベリングする必要がなく、また核酸ポリマーの分子構造を修飾することなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる塩基配列検出用基板および塩基配列検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本願発明の塩基配列検出用基板は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物（アントラセン、ピレン、ナフタレン、フェナントレン、ナフタセン、等）を分散させた自己組織化単分子膜を有する。
本願発明の塩基配列検出用基板において、前記自己組織化単分子膜は、アントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜、またはピレンを有するチオールの自己組織化単分子膜であることが望ましい。
また、本願発明の塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物を有する化合物（ジスルフィド化合物、チオール化合物、等）を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属（好ましくは金または銀）からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面に非イオン性芳香族化合物を分散させた自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
アントラセンを分散させた自己組織化単分子膜を有する塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィドの化合物を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にアントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
また、ピレンを分散させた自己組織化単分子膜を有する塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターであるピレンを有するチオールの化合物を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にピレンを有するチオールの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
【０００６】
本願発明の塩基配列検出方法は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物を有する化合物（ジスルフィド化合物、チオール化合物、等）を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面に非イオン性芳香族化合物を有するチオールもしくはジスルフィドの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップと、前記基板上で前記プローブ核酸ポリマーとターゲット核酸ポリマーとのハイブリダイゼーションを実施するステップとを含む。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本願発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
［第１の実施の形態］
図１に本願発明によるＤＮＡの塩基配列検出方法における処理工程の概略を示す。
（ａ）自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）の生成
アントラセンを有するジスルフィド（Ｓ-Ｓ）化合物を含有した溶液に金薄膜１ａをコーティングした透明基板１を浸漬することにより、透明基板１上にアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭ２を生成させる。ＳＡＭ２には、Ｓ（硫黄）にアントラセンがアルキル鎖のようなスペーサーを介して結合した化合物と、末端にアントラセンが結合していない化合物とが存在する。
（ｂ）一本鎖ＤＮＡ（プローブ）の固定
プローブＤＮＡ３を含有した水溶液をＳＡＭ２上に供給し、ＳＡＭ２にプローブＤＮＡ３を吸着させることにより、透明基板１の金薄膜１ａ上にプローブＤＮＡ３を固定する。
（ｃ）相補的なＤＮＡ（ターゲット）とのハイブリダイゼーション
ターゲットＤＮＡ４を含有した水溶液をＳＡＭ２上に供給し、プローブＤＮＡ３とターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションを行う。
以上の処理の後、透明基板１を水洗処理すると、ＳＡＭ２上にはハイブリダイズしたターゲットＤＮＡ４だけが残存するので、ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を検出することによりターゲットＤＮＡ４側の塩基配列を検出することができる。
【０００８】
ＤＮＡのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭ２を金薄膜１ａ上に形成し、ＳＡＭ２上でプローブＤＮＡ３とターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションを行うようにしたことにより、プローブＤＮＡ３の金薄膜１ａへの固定化効率を高めることができるので、ターゲットＤＮＡ４が微少量しか入手できない場合でも、ターゲットＤＮＡ４の塩基配列を検出することができる。
プローブＤＮＡ３の金薄膜１ａへの固定化効率は、ＳＡＭ２の硫黄原子数に対するアントラセン数の割合を調節することにより制御できる。この割合の調節は、具体的には、下記の化学式１で表される化合物と下記化学式２で表される化合物との混合比を適宜調節することにより行うことができる。
【化３】
ただし、ｘ，ｙ，ｚは共に６〜１８、ＲはＣＨ3、ＯＨまたはＮＨ2である。
上記割合は１０％〜５０％であることが望ましい。この割合が１０％未満であると、プローブＤＮＡ３がＳＡＭ２に吸着し難くなり、５０％を越えると、ＳＡＭ２に対するプローブＤＮＡ３の吸着率が大きくなり過ぎて、ターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションが起り難くなるからである。この割合はより好ましくは１５％〜２０％であることが望ましい。
化学式１の化合物における硫黄原子数とアントラセン数との比は２：１である。したがって、化学式１の化合物を１００％使用して成膜した場合、硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が５０％のＳＡＭ２を得ることができる。
そして、化学式１の化合物に化学式２の化合物を適宜加えて成膜を行うことにより、硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が５０％未満のＳＡＭ２を得ることができる。たとえば、化学式１の化合物と化学式２の化合物との混合比を９９：１に調節してＳＡＭ２を成膜した場合における上記割合はＳＡＭ２内において約１５％となる。
ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を検出する方法としては、ラベリングしたターゲットＤＮＡ４を用いる一般的な方法も使用できるが、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）法を用いることにより、より迅速に検出を行うことができる。
【０００９】
図２は表面プラズモン共鳴法による測定原理を示したものである。図２（ａ）に示すように、プリズム等の透明部材の底面に金または銀薄膜層を形成しその上に試料を堆積させ、透明部材を通して金属膜に斜めにレーザ光を入射させる。レーザ光の入射角（?）と反射率の関係は図２（ｂ）に示したようになる。このときにみられる深い谷が表面プラズモン共鳴に相当する。表面プラズモン共鳴は、金属薄膜上の境界条件に大きく依存する。この入射角−反射率曲線をシミュレートすることより、吸着した超薄膜の膜厚や被覆率を知ることができる。
したがって、この実施の形態の場合、透明基板１に対し金薄膜１ａの反対側からレーザ光を入射させ、表面プラズモン共鳴法を用いて、ＳＡＭ２上にターゲットＤＮＡ４が存在する場合と存在しない場合との反射率の変化を増感して検知することにより、ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を迅速かつ確実に検出することができる。
【００１０】
図３に表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭへの吸着過程の観察例を示す。
ＤＮＡのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィド化合物（下記化学式３）を合成し、この化合物と11-mercapto-1-undecanol（下記化学式４）を９９：１の割合でクロロホルムに溶解させ、この溶液に金基板を２４時間浸漬することによりＳＡＭを形成させ、これをＲＮＡの固定化のための基板とした。
【化４】
この観察例では、第１段階においてPoly(A)（polyadenylic acid：ポリアデニル酸）がＳＡＭに吸着し、さらに第２段階においてPoly(A)に相補的なPoly(U)（polyuridilic acid：ポリウリジル酸）を加えることにより、Poly(U)も吸着していることがわかる。また、Poly(U)以外のＲＮＡでは吸着は観察されなかったことから、Poly(A)とPoly(U)とがＳＡＭ上において特異的に相互作用していることが示された。この実験結果から、本願発明の方法はＲＮＡの塩基配列検出にも有効に適用できることがわかる。
【００１１】
［第２の実施の形態］
以上の実施の形態では、核酸ポリマーのインターカレーターとしてアントラセンを用いた場合について説明したが、アントラセンの代わりにピレンを使用することも有効である。
ピレンを使用する場合も、図１と同様の処理を行うことによりターゲットＤＮＡの塩基配列を検出することができる。この場合も、プローブＤＮＡの金薄膜への固定化効率を高めることができるので、ターゲットＤＮＡが微少量しか入手できない場合でも、ターゲットＤＮＡの塩基配列を検出することができる。
プローブＤＮＡの金薄膜への固定化効率は、ＳＡＭの硫黄原子数に対するピレン数の割合を調節することにより制御できる。この割合の調節は、具体的には、下記の化学式５で表される化合物と下記化学式６で表される化合物との混合比を適宜調節することにより行うことができる。
【化５】
ただし、ｘ，ｚは共に６〜１８、ＲはＯＨ、ＣＨ3、ＮＨ2である。
上記割合は１５％〜５０％であることが望ましい。この割合が１５％未満であると、プローブＤＮＡがＳＡＭに吸着し難くなり、５０％を越えると、ＳＡＭ２に対するプローブＤＮＡ３の吸着率が大きくなり過ぎて、ターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションが起り難くなるからである。この割合はより好ましくは１５％〜２０％であることが望ましい。
化学式５の化合物における硫黄原子数とピレン数との比は１：１である。したがって、化学式５の化合物を１００％使用して成膜した場合、硫黄原子数に対するピレン数の割合が１００％のＳＡＭを得ることができる。
そして、化学式５の化合物に化学式６の化合物を適宜加えて成膜を行うことにより、硫黄原子数に対するピレン数の割合が１００％未満のＳＡＭを得ることができる。たとえば、化学式５の化合物と化学式６の化合物との混合比を１：１に調節してＳＡＭを成膜した場合における上記割合はＳＡＭ内において約５０％となる。
この場合も、ＳＡＭ上に残存しているターゲットＤＮＡを検出する方法としては、ラベリングしたターゲットＤＮＡを用いる一般的な方法も使用できるが、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）法を用いることにより、より迅速に検出を行うことができる。
【００１２】
図４に表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのピレンを有するチオールのＳＡＭへの吸着過程の観察例を示す。
ＤＮＡのインターカレーターであるピレンを有するチオール化合物（下記化学式７）を合成し、この化合物とメルカプトウンデカノール（下記化学式８）を１：１の割合でクロロホルムに溶解させ、この溶液に金基板を２４時間浸漬することによりＳＡＭを形成させ、これをＲＮＡの固定化のための基板とした。
【化６】
図３の図４との比較から、第１段階すなわちPoly(A)をＳＡＭに吸着させる段階における吸着能力はピレンの方がアントラセンよりも高いことがわかる。このことは、ピレンを使用することにより一本鎖ＲＮＡをより強く吸着して基板上に固定できることを意味している。
【００１３】
また、ＳＡＭのＩＲ−ＲＡＳ測定の結果より図５（ａ）に示すようにアントラセンを有するジスルフィドのアントラセン分子は基板表面に対して大きく傾いているが、図５（ｂ）に示すようにピレンを有するジスルフィドのピレン分子は基板表面に対してほぼ垂直に立っている。したがって、ピレンを有するジスルフィドのＳＡＭを用いることにより、アントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭを用いた場合より多くＤＮＡやＲＮＡをＳＡＭに吸着させることが可能になる。
なお、上記の例では、ＤＮＡのインターカレーターとしてアントラセンまたはピレンを用いた場合について説明したが、その他の非イオン性芳香族化合物たとえばナフタレン、フェナントレン、ナフタセン、等を用いることも可能である。また、上記の例では、ＳＡＭ上に残存しているプローブ核酸ポリマー、ターゲット核酸ポリマーの検出方法として表面プラズモン共鳴を用いたが水晶振動子法を用いてもよい。
また、上記の例では、金薄膜を有する基板上にアントラセンまたはピレンを有するジスルフィドおよびチオールのＳＡＭを形成したが、Ｓｉ、Ａｌ、Ａｇ、Ｃｕなどのその他の金属や、これらの合金（金との合金を含む）または酸化物を金属薄膜の材料に用いてもよい。ただし、有機分子に含まれる硫黄原子の吸着能を利用する点から、または表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法を用いる点から、金（Ａｕ）または銀（Ａｇ）が薄膜材料として最も適している。
【００１４】
【発明の効果】
以上の説明からわかるように、本願発明は以下のような優れた効果を奏するものである。
本願発明の塩基配列検出用基板を用いることにより、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる。
本願発明の塩基配列検出用基板の製造方法によれば、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる塩基配列検出用基板を製造することができる。
本願発明の塩基配列検出方法によれば、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）乃至（ｃ）は本願発明によるＤＮＡの塩基配列検出方法における処理工程の概略を示す説明図である。
【図２】（ａ）は表面プラズモン共鳴法による測定原理の説明図、（ｂ）は表面プラズモン共鳴法におけるレーザ光の入射角（θ）と反射率との関係を例示する図である。
【図３】表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのアントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜への吸着過程及びハイブリダイゼーション過程の観察結果の一例を示す図（反射率と膜厚の時間変化をプロットした図）である。
【図４】表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのピレンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜への吸着過程の観察結果の一例を示す図（反射率と膜厚の時間変化をプロットした図）である。
【図５】（ａ）はアントラセンを有するジスルフィドの基板上における形状を示した図、（ｂ）はピレンを有するチオールの基板上における形状を示した図である。
【符号の説明】
１：透明基板（基板）、１ａ：金薄膜
２：自己組織化単分子膜
３：プローブＤＮＡ（プローブ核酸ポリマー）
４：ターゲットＤＮＡ（ターゲット核酸ポリマー）
【発明の属する技術分野】
本願発明は、生物の遺伝情報伝達物質であるＤＮＡあるいはＲＮＡの塩基配列を決定する技術に属し、より詳細には、ハイブリダイゼーション法により塩基配列を決定する技術に属する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡなどの核酸ポリマー中の目的遺伝子配列を検索したり、あるいは複数の核酸ポリマーの異同を判定したりする方法として、ターゲット核酸ポリマーの一部配列と相補的な一本鎖核酸ポリマーをプローブとするハイブリダイゼーション法が知られている。
ハイブリダイゼーション法では、ターゲット核酸ポリマーをスライドガラスやシリコン等の基板に固定化し、放射性同位元素（ＲＩ）もしくは蛍光物質でラベリング（標識）したプローブ核酸ポリマー水溶液を膜上に加える。プローブ核酸ポリマーがターゲット核酸ポリマーにハイブリダイズした場合には、水洗の後、膜にはターゲット核酸ポリマーとハイブリダイズしたプローブ核酸ポリマーだけが残存する。プローブ核酸ポリマーにラベリングされたＲＩからの放射能や、あるいは蛍光物質が発する光や沈殿物の色を検出することにより、ターゲット核酸ポリマー中に目的とする配列が存在するか否かを判定することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
標識としてＲＩを用いる方法は、放射性物質取り扱い施設とその維持管理に多大な費用と労力を要するばかりでなく、取り扱い者の健康の点でも問題があるため、近年では一般的に、蛍光物質を標識に用い、蛍光測定装置を用いて測定が行われている。
しかしながら、プローブ核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングするには特別な修飾処理を必要とするため手間がかかるし、励起光による蛍光物質の褪色は避けられないため、高精度に測定を行うためには専用の高価な蛍光測定装置が必要となる。
また、ターゲット核酸ポリマーの基板への固定化効率が悪く、固定化のために大量のターゲット核酸ポリマーを必要とするため、ターゲット核酸ポリマーが微少量しか入手できない場合には測定を行うことは難しい。
また、他の方法として、固体基板上に直接一本鎖プローブ核酸ポリマーを固定化し、ターゲット核酸ポリマーとのハイブリダイゼーションを行い、プラズモン共鳴法あるいは水晶振動子法などにより検出する方法もあるが、この方法の場合も、核酸ポリマーを基板に固定化するために分子構造を修飾する必要があり、その固定化の制御が難しいといった問題がある。
【０００４】
本願発明は、このような事情の下に創案されたものであり、その課題は、核酸ポリマーをＲＩまたは蛍光物質でラベリングする必要がなく、また核酸ポリマーの分子構造を修飾することなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる塩基配列検出用基板および塩基配列検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本願発明の塩基配列検出用基板は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物（アントラセン、ピレン、ナフタレン、フェナントレン、ナフタセン、等）を分散させた自己組織化単分子膜を有する。
本願発明の塩基配列検出用基板において、前記自己組織化単分子膜は、アントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜、またはピレンを有するチオールの自己組織化単分子膜であることが望ましい。
また、本願発明の塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物を有する化合物（ジスルフィド化合物、チオール化合物、等）を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属（好ましくは金または銀）からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面に非イオン性芳香族化合物を分散させた自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
アントラセンを分散させた自己組織化単分子膜を有する塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィドの化合物を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にアントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
また、ピレンを分散させた自己組織化単分子膜を有する塩基配列検出用基板の製造方法は、核酸ポリマーのインターカレーターであるピレンを有するチオールの化合物を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にピレンを有するチオールの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップとを含む。
【０００６】
本願発明の塩基配列検出方法は、核酸ポリマーのインターカレーターである非イオン性芳香族化合物を有する化合物（ジスルフィド化合物、チオール化合物、等）を合成するステップと、前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面に非イオン性芳香族化合物を有するチオールもしくはジスルフィドの自己組織化単分子膜を生成させるステップと、前記自己組織化単分子膜にプローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に核酸ポリマーを固定するステップと、前記基板上で前記プローブ核酸ポリマーとターゲット核酸ポリマーとのハイブリダイゼーションを実施するステップとを含む。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本願発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
［第１の実施の形態］
図１に本願発明によるＤＮＡの塩基配列検出方法における処理工程の概略を示す。
（ａ）自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）の生成
アントラセンを有するジスルフィド（Ｓ-Ｓ）化合物を含有した溶液に金薄膜１ａをコーティングした透明基板１を浸漬することにより、透明基板１上にアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭ２を生成させる。ＳＡＭ２には、Ｓ（硫黄）にアントラセンがアルキル鎖のようなスペーサーを介して結合した化合物と、末端にアントラセンが結合していない化合物とが存在する。
（ｂ）一本鎖ＤＮＡ（プローブ）の固定
プローブＤＮＡ３を含有した水溶液をＳＡＭ２上に供給し、ＳＡＭ２にプローブＤＮＡ３を吸着させることにより、透明基板１の金薄膜１ａ上にプローブＤＮＡ３を固定する。
（ｃ）相補的なＤＮＡ（ターゲット）とのハイブリダイゼーション
ターゲットＤＮＡ４を含有した水溶液をＳＡＭ２上に供給し、プローブＤＮＡ３とターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションを行う。
以上の処理の後、透明基板１を水洗処理すると、ＳＡＭ２上にはハイブリダイズしたターゲットＤＮＡ４だけが残存するので、ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を検出することによりターゲットＤＮＡ４側の塩基配列を検出することができる。
【０００８】
ＤＮＡのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭ２を金薄膜１ａ上に形成し、ＳＡＭ２上でプローブＤＮＡ３とターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションを行うようにしたことにより、プローブＤＮＡ３の金薄膜１ａへの固定化効率を高めることができるので、ターゲットＤＮＡ４が微少量しか入手できない場合でも、ターゲットＤＮＡ４の塩基配列を検出することができる。
プローブＤＮＡ３の金薄膜１ａへの固定化効率は、ＳＡＭ２の硫黄原子数に対するアントラセン数の割合を調節することにより制御できる。この割合の調節は、具体的には、下記の化学式１で表される化合物と下記化学式２で表される化合物との混合比を適宜調節することにより行うことができる。
【化３】
上記割合は１０％〜５０％であることが望ましい。この割合が１０％未満であると、プローブＤＮＡ３がＳＡＭ２に吸着し難くなり、５０％を越えると、ＳＡＭ２に対するプローブＤＮＡ３の吸着率が大きくなり過ぎて、ターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションが起り難くなるからである。この割合はより好ましくは１５％〜２０％であることが望ましい。
化学式１の化合物における硫黄原子数とアントラセン数との比は２：１である。したがって、化学式１の化合物を１００％使用して成膜した場合、硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が５０％のＳＡＭ２を得ることができる。
そして、化学式１の化合物に化学式２の化合物を適宜加えて成膜を行うことにより、硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が５０％未満のＳＡＭ２を得ることができる。たとえば、化学式１の化合物と化学式２の化合物との混合比を９９：１に調節してＳＡＭ２を成膜した場合における上記割合はＳＡＭ２内において約１５％となる。
ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を検出する方法としては、ラベリングしたターゲットＤＮＡ４を用いる一般的な方法も使用できるが、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）法を用いることにより、より迅速に検出を行うことができる。
【０００９】
図２は表面プラズモン共鳴法による測定原理を示したものである。図２（ａ）に示すように、プリズム等の透明部材の底面に金または銀薄膜層を形成しその上に試料を堆積させ、透明部材を通して金属膜に斜めにレーザ光を入射させる。レーザ光の入射角（?）と反射率の関係は図２（ｂ）に示したようになる。このときにみられる深い谷が表面プラズモン共鳴に相当する。表面プラズモン共鳴は、金属薄膜上の境界条件に大きく依存する。この入射角−反射率曲線をシミュレートすることより、吸着した超薄膜の膜厚や被覆率を知ることができる。
したがって、この実施の形態の場合、透明基板１に対し金薄膜１ａの反対側からレーザ光を入射させ、表面プラズモン共鳴法を用いて、ＳＡＭ２上にターゲットＤＮＡ４が存在する場合と存在しない場合との反射率の変化を増感して検知することにより、ＳＡＭ２上に残存しているターゲットＤＮＡ４を迅速かつ確実に検出することができる。
【００１０】
図３に表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのアントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭへの吸着過程の観察例を示す。
ＤＮＡのインターカレーターであるアントラセンを有するジスルフィド化合物（下記化学式３）を合成し、この化合物と11-mercapto-1-undecanol（下記化学式４）を９９：１の割合でクロロホルムに溶解させ、この溶液に金基板を２４時間浸漬することによりＳＡＭを形成させ、これをＲＮＡの固定化のための基板とした。
【化４】
【００１１】
［第２の実施の形態］
以上の実施の形態では、核酸ポリマーのインターカレーターとしてアントラセンを用いた場合について説明したが、アントラセンの代わりにピレンを使用することも有効である。
ピレンを使用する場合も、図１と同様の処理を行うことによりターゲットＤＮＡの塩基配列を検出することができる。この場合も、プローブＤＮＡの金薄膜への固定化効率を高めることができるので、ターゲットＤＮＡが微少量しか入手できない場合でも、ターゲットＤＮＡの塩基配列を検出することができる。
プローブＤＮＡの金薄膜への固定化効率は、ＳＡＭの硫黄原子数に対するピレン数の割合を調節することにより制御できる。この割合の調節は、具体的には、下記の化学式５で表される化合物と下記化学式６で表される化合物との混合比を適宜調節することにより行うことができる。
【化５】
上記割合は１５％〜５０％であることが望ましい。この割合が１５％未満であると、プローブＤＮＡがＳＡＭに吸着し難くなり、５０％を越えると、ＳＡＭ２に対するプローブＤＮＡ３の吸着率が大きくなり過ぎて、ターゲットＤＮＡ４とのハイブリダイゼーションが起り難くなるからである。この割合はより好ましくは１５％〜２０％であることが望ましい。
化学式５の化合物における硫黄原子数とピレン数との比は１：１である。したがって、化学式５の化合物を１００％使用して成膜した場合、硫黄原子数に対するピレン数の割合が１００％のＳＡＭを得ることができる。
そして、化学式５の化合物に化学式６の化合物を適宜加えて成膜を行うことにより、硫黄原子数に対するピレン数の割合が１００％未満のＳＡＭを得ることができる。たとえば、化学式５の化合物と化学式６の化合物との混合比を１：１に調節してＳＡＭを成膜した場合における上記割合はＳＡＭ内において約５０％となる。
この場合も、ＳＡＭ上に残存しているターゲットＤＮＡを検出する方法としては、ラベリングしたターゲットＤＮＡを用いる一般的な方法も使用できるが、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）法を用いることにより、より迅速に検出を行うことができる。
【００１２】
図４に表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのピレンを有するチオールのＳＡＭへの吸着過程の観察例を示す。
ＤＮＡのインターカレーターであるピレンを有するチオール化合物（下記化学式７）を合成し、この化合物とメルカプトウンデカノール（下記化学式８）を１：１の割合でクロロホルムに溶解させ、この溶液に金基板を２４時間浸漬することによりＳＡＭを形成させ、これをＲＮＡの固定化のための基板とした。
【化６】
【００１３】
また、ＳＡＭのＩＲ−ＲＡＳ測定の結果より図５（ａ）に示すようにアントラセンを有するジスルフィドのアントラセン分子は基板表面に対して大きく傾いているが、図５（ｂ）に示すようにピレンを有するジスルフィドのピレン分子は基板表面に対してほぼ垂直に立っている。したがって、ピレンを有するジスルフィドのＳＡＭを用いることにより、アントラセンを有するジスルフィドのＳＡＭを用いた場合より多くＤＮＡやＲＮＡをＳＡＭに吸着させることが可能になる。
なお、上記の例では、ＤＮＡのインターカレーターとしてアントラセンまたはピレンを用いた場合について説明したが、その他の非イオン性芳香族化合物たとえばナフタレン、フェナントレン、ナフタセン、等を用いることも可能である。また、上記の例では、ＳＡＭ上に残存しているプローブ核酸ポリマー、ターゲット核酸ポリマーの検出方法として表面プラズモン共鳴を用いたが水晶振動子法を用いてもよい。
また、上記の例では、金薄膜を有する基板上にアントラセンまたはピレンを有するジスルフィドおよびチオールのＳＡＭを形成したが、Ｓｉ、Ａｌ、Ａｇ、Ｃｕなどのその他の金属や、これらの合金（金との合金を含む）または酸化物を金属薄膜の材料に用いてもよい。ただし、有機分子に含まれる硫黄原子の吸着能を利用する点から、または表面プラズモン共鳴法や水晶振動子法を用いる点から、金（Ａｕ）または銀（Ａｇ）が薄膜材料として最も適している。
【００１４】
【発明の効果】
以上の説明からわかるように、本願発明は以下のような優れた効果を奏するものである。
本願発明の塩基配列検出用基板を用いることにより、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる。
本願発明の塩基配列検出用基板の製造方法によれば、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる塩基配列検出用基板を製造することができる。
本願発明の塩基配列検出方法によれば、核酸ポリマーをＲＩもしくは蛍光物質でラベリングする必要がなく、プローブ核酸ポリマーの基板への固定化をハイブリダイゼーションに適した状態に制御しつつ、基板上でハイブリダイゼーションを行って、微少量のターゲット核酸ポリマーでその塩基配列を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）乃至（ｃ）は本願発明によるＤＮＡの塩基配列検出方法における処理工程の概略を示す説明図である。
【図２】（ａ）は表面プラズモン共鳴法による測定原理の説明図、（ｂ）は表面プラズモン共鳴法におけるレーザ光の入射角（θ）と反射率との関係を例示する図である。
【図３】表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのアントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜への吸着過程及びハイブリダイゼーション過程の観察結果の一例を示す図（反射率と膜厚の時間変化をプロットした図）である。
【図４】表面プラズモン共鳴法を用いたＲＮＡのピレンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜への吸着過程の観察結果の一例を示す図（反射率と膜厚の時間変化をプロットした図）である。
【図５】（ａ）はアントラセンを有するジスルフィドの基板上における形状を示した図、（ｂ）はピレンを有するチオールの基板上における形状を示した図である。
【符号の説明】
１：透明基板（基板）、１ａ：金薄膜
２：自己組織化単分子膜
３：プローブＤＮＡ（プローブ核酸ポリマー）
４：ターゲットＤＮＡ（ターゲット核酸ポリマー）
Claims (6)
- 一本鎖核酸ポリマーのインターカレーターである、下記化学式１で表されるアントラセンを有するジスルフィドの化合物、又は下記化学式１で表される化合物及び下記化学式２で表わされる化合物を含む溶液を調製するステップ、
前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にアントラセンを有するジスルフィドの自己組織化単分子膜を生成させるステップ；及び
前記自己組織化単分子膜に一本鎖プローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に一本鎖核酸ポリマーを固定するステップとを含む、塩基配列検出用基板の製造方法であって：
前記化学式１で表わされる化合物と前記化学式２で表わされる化合物との混合比が、前記自己組織化単分子膜の硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が１０％〜５０％となるような混合比である、前記の塩基配列検出用基板の製造方法。 - 前記混合比が、前記自己組織化単分子膜の硫黄原子数に対するアントラセン数の割合が１５％〜２０％となるような混合比である、請求項１に記載の塩基配列検出用基板の製造方法。
- 一本鎖核酸ポリマーのインターカレーターである下記化学式５で表されるピレンを有するチオールの化合物、又は、下記化学式５で表される化合物、及び下記化学式６で表される化合物を含む溶液を調製するステップ、
前記化合物を含有した溶液に少なくともその表面層が金属からなる基板を浸漬することにより当該基板の表面にピレンを有するチオールの自己組織化単分子膜を生成させるステップ；及び
前記自己組織化単分子膜に一本鎖プローブ核酸ポリマーを吸着させることにより、前記基板の表面に一本鎖核酸ポリマーを固定するステップとを含む、塩基配列検出用基板の製造方法であって：
前記化学式５で表される化合物と前記化学式６で表される化合物との混合比が、前記自己組織化単分子膜の硫黄原子数に対するピレン数の割合が５％〜１００％となるような混合比である、前記塩基配列検出用基板の製造方法。 - 前記混合比が、前記自己組織化単分子膜の硫黄原子数に対するピレン数の割合が１５％〜５０％となるような混合比である、請求項３に記載の塩基配列検出用基板の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法により製造された塩基配列検出用基板上で、前記一本鎖プローブ核酸ポリマーとターゲット核酸ポリマーとのハイブリダイゼーションを実施することを特徴とする塩基配列検出方法。
- 前記ハイブリダイゼーション後の前記自己組織化単分子膜に残存しているターゲット核酸ポリマーを表面プラズモン共鳴法、又は水晶振動子法により検出することを特徴とする請求項５に記載の塩基配列検出方法。
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