JP2003043037A - ハイブリダイゼーション用基板、この基板の製造方法及び使用方法 - Google Patents
ハイブリダイゼーション用基板、この基板の製造方法及び使用方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Abstract
(57)【要約】
【課題】表面被覆率及び活性度を高めた、基板表面にＤ
ＮＡ鎖を固定化したハイブリダイゼーション用基板及び
その製造方法を提供し、さらにはこの基板を用いた相補
性試験方法を提供すること。 【解決手段】基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮＡ鎖
は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されてい
るハイブリダイゼーション用基板。金属基板または金属
被覆を有する基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖
部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を
有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属
表面に固定化させる、基板の製造方法。上記基板のＤＮ
Ａ鎖を固定化した表面にターゲットＤＮＡを接触させ、
ターゲットＤＮＡと二重鎖部分及び一重鎖部分を有する
ＤＮＡ鎖の一重鎖部分との相補性を試験する方法。
ＮＡ鎖を固定化したハイブリダイゼーション用基板及び
その製造方法を提供し、さらにはこの基板を用いた相補
性試験方法を提供すること。 【解決手段】基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮＡ鎖
は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されてい
るハイブリダイゼーション用基板。金属基板または金属
被覆を有する基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖
部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を
有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属
表面に固定化させる、基板の製造方法。上記基板のＤＮ
Ａ鎖を固定化した表面にターゲットＤＮＡを接触させ、
ターゲットＤＮＡと二重鎖部分及び一重鎖部分を有する
ＤＮＡ鎖の一重鎖部分との相補性を試験する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハイブリダイゼー
ション用基板、この基板の製造方法及びこの基板を使用
する相補性試験方法に関する。
ション用基板、この基板の製造方法及びこの基板を使用
する相補性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決すべき課題】遺伝子診断や
病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の
核酸(標的核酸)を検出する目的で核酸プローブが用いら
れる。核酸プローブは標的核酸と混合され、核酸プロー
ブと標的核酸とのハイブリダイズの有無を、例えば、核
酸プローブが有する、蛍光標識等の標識を用いて検知す
る。上記核酸プローブとしては、DNA合成機により容易
に合成できるという理由から、DNAプローブが主に使用
されている。また、標的核酸とハイブリダイズした核酸
プローブを検知しやすいという観点から、蛍光標識を用
いられることが多いが、蛍光標識以外に、RIなどが用い
られる場合もある。そして、近年、多数の核酸プローブ
核酸を基材に固定したDNAチップやDNAマイクロアレーが
実用されるようになり、標的核酸の検出に使用されてい
る。
病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の
核酸(標的核酸)を検出する目的で核酸プローブが用いら
れる。核酸プローブは標的核酸と混合され、核酸プロー
ブと標的核酸とのハイブリダイズの有無を、例えば、核
酸プローブが有する、蛍光標識等の標識を用いて検知す
る。上記核酸プローブとしては、DNA合成機により容易
に合成できるという理由から、DNAプローブが主に使用
されている。また、標的核酸とハイブリダイズした核酸
プローブを検知しやすいという観点から、蛍光標識を用
いられることが多いが、蛍光標識以外に、RIなどが用い
られる場合もある。そして、近年、多数の核酸プローブ
核酸を基材に固定したDNAチップやDNAマイクロアレーが
実用されるようになり、標的核酸の検出に使用されてい
る。
【０００３】DNAチップやDNAマイクロアレーの作製にお
いては、基板にDNAを固定化する必要がある。DNAの固定
化には、例えば、チオールを一本鎖ＤＮＡに接合させ、
チオール化した一本鎖ＤＮＡを、例えば、金属基板に固
定化する方法が取られていた。しかし、この方法で固定
化したＤＮＡは、基板上で倒れた構造となってしまう。
そのため、表面被覆率、活性度がともに著しく低いとい
う問題があった。これに対して、一本鎖ＤＮＡとチオー
ルとの間にアルキル鎖を導入することによって、表面被
覆率、活性度を高める試みが数多く報告されている（例
えば、J.Am.Chem.Soc.1998,120,9787-9792参照）。しか
し、この手法では、一本鎖ＤＮＡへの修飾（長鎖アルキ
ル鎖の導入）に多大なの手間とコストが掛かる上、表面
への混合物の導入も必要であることから実用化は困難で
あった。
いては、基板にDNAを固定化する必要がある。DNAの固定
化には、例えば、チオールを一本鎖ＤＮＡに接合させ、
チオール化した一本鎖ＤＮＡを、例えば、金属基板に固
定化する方法が取られていた。しかし、この方法で固定
化したＤＮＡは、基板上で倒れた構造となってしまう。
そのため、表面被覆率、活性度がともに著しく低いとい
う問題があった。これに対して、一本鎖ＤＮＡとチオー
ルとの間にアルキル鎖を導入することによって、表面被
覆率、活性度を高める試みが数多く報告されている（例
えば、J.Am.Chem.Soc.1998,120,9787-9792参照）。しか
し、この手法では、一本鎖ＤＮＡへの修飾（長鎖アルキ
ル鎖の導入）に多大なの手間とコストが掛かる上、表面
への混合物の導入も必要であることから実用化は困難で
あった。
【０００４】そこで本発明の目的は、表面被覆率及び活
性度を高めた、基板表面にＤＮＡ鎖を固定化したハイブ
リダイゼーション用基板及びその製造方法を提供し、さ
らにはこの基板を用いた相補性試験方法を提供すること
にある。
性度を高めた、基板表面にＤＮＡ鎖を固定化したハイブ
リダイゼーション用基板及びその製造方法を提供し、さ
らにはこの基板を用いた相補性試験方法を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決する本発
明は以下のとおりである。 ［請求項１］基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮＡ鎖
は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されてい
るハイブリダイゼーション用基板。 ［請求項２］前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記ＤＮＡ鎖が
硫黄原子を介して固定化されている請求項１に記載の基
板。 ［請求項３］前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を
介して固定化されている請求項１に記載の基板。 ［請求項４］前記二重鎖部分の塩基数は10〜80の範囲で
あり、前記一重鎖部分の塩基数は20〜90の範囲である請
求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。 ［請求項５］前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前
記基板の表面にさらに固定化されている請求項１〜４の
いずれか１項に記載の基板。 ［請求項６］前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記二重鎖部分
のみを有するＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されて
いる請求項５に記載の基板。 ［請求項７］前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記二重鎖部分のみを有す
るＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている請求項
５に記載の基板。 ［請求項８］前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定
化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である請求項
５〜７のいずれか１項に記載の基板。 ［請求項９］前記金属基板または金属被覆が金製である
請求項２または６に記載の基板。 ［請求項１０］金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接
触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させ
る、請求項２に記載の基板の製造方法。 ［請求項１１］金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び
末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮ
Ａ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定
化させる、請求項６に記載の基板の製造方法。 ［請求項１２］ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前
記表面に固定化させる、請求項３に記載の基板の製造方
法。 ［請求項１３］ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二
重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮ
Ａ鎖を前記表面に固定化させる、請求項７に記載の基板
の製造方法。 ［請求項１４］ヘテロ２官能性架橋剤が、スクシンイミ
ジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキ
シ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイ
ミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤である請
求項１２または１３に記載の製造方法。 ［請求項１５］前記ＤＮＡ鎖の表面への接触を、２価金
属イオンの存在下で行う請求項１０〜１４のいずれか１
項に記載の製造方法。 ［請求項１６］２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１５に記載の製造方法。 ［請求項１７］請求項１〜９のいずれか１項に記載の基
板の前記ＤＮＡ鎖を固定化した表面にターゲットＤＮＡ
を接触させ、前記ターゲットＤＮＡと前記二重鎖部分及
び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一重鎖部分との相補性
を試験する方法。 ［請求項１８］ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲッ
トＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行う請求
項１７に記載の方法。 ［請求項１９］２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１８に記載の方法。 ［請求項２０］ターゲットＤＮＡと前記ＤＮＡ鎖の一重
鎖部分とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズ
モン共鳴法または水晶振動子法により検出する請求項１
７〜１９のいずれか１項に記載の方法。 ［請求項２１］ターゲットＤＮＡが蛍光標識を有するＤ
ＮＡであり、前記ＤＮＡ鎖の一重鎖部分とのハイブリダ
イゼーションの有無を蛍光により検出する請求項１７〜
１９のいずれか１項に記載の方法。 ［請求項２２］塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮ
Ａを検出するための請求項１７〜２１のいずれか１項に
記載の方法。
明は以下のとおりである。 ［請求項１］基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮＡ鎖
は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されてい
るハイブリダイゼーション用基板。 ［請求項２］前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記ＤＮＡ鎖が
硫黄原子を介して固定化されている請求項１に記載の基
板。 ［請求項３］前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を
介して固定化されている請求項１に記載の基板。 ［請求項４］前記二重鎖部分の塩基数は10〜80の範囲で
あり、前記一重鎖部分の塩基数は20〜90の範囲である請
求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。 ［請求項５］前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前
記基板の表面にさらに固定化されている請求項１〜４の
いずれか１項に記載の基板。 ［請求項６］前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記二重鎖部分
のみを有するＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されて
いる請求項５に記載の基板。 ［請求項７］前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記二重鎖部分のみを有す
るＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている請求項
５に記載の基板。 ［請求項８］前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定
化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である請求項
５〜７のいずれか１項に記載の基板。 ［請求項９］前記金属基板または金属被覆が金製である
請求項２または６に記載の基板。 ［請求項１０］金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接
触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させ
る、請求項２に記載の基板の製造方法。 ［請求項１１］金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び
末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮ
Ａ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定
化させる、請求項６に記載の基板の製造方法。 ［請求項１２］ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前
記表面に固定化させる、請求項３に記載の基板の製造方
法。 ［請求項１３］ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二
重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮ
Ａ鎖を前記表面に固定化させる、請求項７に記載の基板
の製造方法。 ［請求項１４］ヘテロ２官能性架橋剤が、スクシンイミ
ジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキ
シ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイ
ミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤である請
求項１２または１３に記載の製造方法。 ［請求項１５］前記ＤＮＡ鎖の表面への接触を、２価金
属イオンの存在下で行う請求項１０〜１４のいずれか１
項に記載の製造方法。 ［請求項１６］２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１５に記載の製造方法。 ［請求項１７］請求項１〜９のいずれか１項に記載の基
板の前記ＤＮＡ鎖を固定化した表面にターゲットＤＮＡ
を接触させ、前記ターゲットＤＮＡと前記二重鎖部分及
び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一重鎖部分との相補性
を試験する方法。 ［請求項１８］ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲッ
トＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行う請求
項１７に記載の方法。 ［請求項１９］２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１８に記載の方法。 ［請求項２０］ターゲットＤＮＡと前記ＤＮＡ鎖の一重
鎖部分とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズ
モン共鳴法または水晶振動子法により検出する請求項１
７〜１９のいずれか１項に記載の方法。 ［請求項２１］ターゲットＤＮＡが蛍光標識を有するＤ
ＮＡであり、前記ＤＮＡ鎖の一重鎖部分とのハイブリダ
イゼーションの有無を蛍光により検出する請求項１７〜
１９のいずれか１項に記載の方法。 ［請求項２２］塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮ
Ａを検出するための請求項１７〜２１のいずれか１項に
記載の方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】[基板]本発明のハイブリダイゼー
ション用基板は、基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部
分を有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮ
Ａ鎖は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化され
ていることを特徴とする。
ション用基板は、基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部
分を有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮ
Ａ鎖は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化され
ていることを特徴とする。
【０００７】従来のＤＮＡを固定化した基板は、ＤＮＡ
が一本鎖であった。それに対して本発明では、二重鎖部
分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖を用いる。即ち、本
発明で使用するＤＮＡ鎖は、一方の鎖が他方の鎖よりも
長く、ある部分は二重鎖であり、残りの部分が一重鎖で
ある。そして、本発明で使用するＤＮＡ鎖は、二重鎖部
分から始まり、途中から最後まで一重鎖部分である。二
重鎖部分の塩基数及び一重鎖部分の塩基数には特に制限
や限定はないが、二重鎖部分の塩基数は、例えば、二重
鎖部分の安定性という観点から10〜80の範囲とすること
ができ、一重鎖部分の塩基数は、一重鎖部分の動きやす
さという観点から20〜90の範囲であることができる。上
記のようなＤＮＡ鎖は、長さが異なる2本の一本鎖であ
って、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本
鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的であ
る、2本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製する
ことができる。
が一本鎖であった。それに対して本発明では、二重鎖部
分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖を用いる。即ち、本
発明で使用するＤＮＡ鎖は、一方の鎖が他方の鎖よりも
長く、ある部分は二重鎖であり、残りの部分が一重鎖で
ある。そして、本発明で使用するＤＮＡ鎖は、二重鎖部
分から始まり、途中から最後まで一重鎖部分である。二
重鎖部分の塩基数及び一重鎖部分の塩基数には特に制限
や限定はないが、二重鎖部分の塩基数は、例えば、二重
鎖部分の安定性という観点から10〜80の範囲とすること
ができ、一重鎖部分の塩基数は、一重鎖部分の動きやす
さという観点から20〜90の範囲であることができる。上
記のようなＤＮＡ鎖は、長さが異なる2本の一本鎖であ
って、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本
鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的であ
る、2本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製する
ことができる。
【０００８】本発明の基板では、上記二重鎖部分及び一
重鎖部分を有するＤＮＡ鎖が、前記二重鎖部分側で基板
表面に固定化されている。このような構造を有すること
で、基板表面寄りには、二重鎖部分があるが、基板表面
から離れた場所では、ＤＮＡ鎖は一重鎖部分となり、一
重鎖部分の周囲にはある程度の空間が生じ、一重鎖部分
をハイブリダイズ用の配列として利用し易くなり、かつ
基板表面に近い場所では二重鎖部分を密に存在させて、
ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
重鎖部分を有するＤＮＡ鎖が、前記二重鎖部分側で基板
表面に固定化されている。このような構造を有すること
で、基板表面寄りには、二重鎖部分があるが、基板表面
から離れた場所では、ＤＮＡ鎖は一重鎖部分となり、一
重鎖部分の周囲にはある程度の空間が生じ、一重鎖部分
をハイブリダイズ用の配列として利用し易くなり、かつ
基板表面に近い場所では二重鎖部分を密に存在させて、
ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
【０００９】ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例え
ば、基板が金属基板または金属被覆を有する基板である
場合、基板の金属表面にＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固
定化させることができる。金属基板としては、例えば、
金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の
金属製の基板を挙げることができる。また、金属被覆を
有する基板としては、ガラス、マイカ(雲母)等の基板の
表面に、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジ
ウム等の金属被覆を設けた基板を挙げることができる。
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定
化については基板の製造方法において詳述する。
ば、基板が金属基板または金属被覆を有する基板である
場合、基板の金属表面にＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固
定化させることができる。金属基板としては、例えば、
金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の
金属製の基板を挙げることができる。また、金属被覆を
有する基板としては、ガラス、マイカ(雲母)等の基板の
表面に、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジ
ウム等の金属被覆を設けた基板を挙げることができる。
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定
化については基板の製造方法において詳述する。
【００１０】また、ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、
例えば、基板がガラス基板またはシリコン基板である場
合、基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定
化させることができる。ガラス基板としては、一般的な
スライドガラス等のガラス基板を挙げることができる。
また、シリコン基板は、シリコンウエハ等であることが
できる。基板の表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての
固定化については基板の製造方法において詳述する。
例えば、基板がガラス基板またはシリコン基板である場
合、基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定
化させることができる。ガラス基板としては、一般的な
スライドガラス等のガラス基板を挙げることができる。
また、シリコン基板は、シリコンウエハ等であることが
できる。基板の表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての
固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１１】本発明の基板は、前記二重鎖部分及び一重
鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有
するＤＮＡ鎖が前記基板の表面にさらに固定化されてい
るものであることもできる。基板の表面に二重鎖部分の
みを有するＤＮＡ鎖をさらに固定化することで、基板表
面から離れた場所での一重鎖部分の周囲にある空間がよ
り広がり、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列として
より利用し易くなるとともに、基板表面に近い場所では
二重鎖部分をさらに密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れ
を防止できるという利点がある。
鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有
するＤＮＡ鎖が前記基板の表面にさらに固定化されてい
るものであることもできる。基板の表面に二重鎖部分の
みを有するＤＮＡ鎖をさらに固定化することで、基板表
面から離れた場所での一重鎖部分の周囲にある空間がよ
り広がり、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列として
より利用し易くなるとともに、基板表面に近い場所では
二重鎖部分をさらに密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れ
を防止できるという利点がある。
【００１２】上記基板は、例えば、金属基板または金属
被覆を有する基板であることができ、その場合、基板の
金属表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮ
Ａ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も硫黄
原子を介して固定化される。また、上記基板は、ガラス
基板またはシリコン基板であることもでき、その場合、
かつ基板の表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有す
るＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖
が硫黄原子を介して固定化される。
被覆を有する基板であることができ、その場合、基板の
金属表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮ
Ａ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も硫黄
原子を介して固定化される。また、上記基板は、ガラス
基板またはシリコン基板であることもでき、その場合、
かつ基板の表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有す
るＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖
が硫黄原子を介して固定化される。
【００１３】上記のように二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮ
Ａ鎖も基板表面に固定化する場合、二重鎖部分及び一重
鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮ
Ａ鎖との固定化数の割合は、ハイブリダイズ用の配列で
ある一重鎖部分の密度(密集度)を考慮して適宜決定でき
るが、例えば、９９：１〜１：９９の範囲、好ましくは
９９：１〜２５：７５の範囲であることが適当である。
有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮ
Ａ鎖も基板表面に固定化する場合、二重鎖部分及び一重
鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮ
Ａ鎖との固定化数の割合は、ハイブリダイズ用の配列で
ある一重鎖部分の密度(密集度)を考慮して適宜決定でき
るが、例えば、９９：１〜１：９９の範囲、好ましくは
９９：１〜２５：７５の範囲であることが適当である。
【００１４】［基板の製造方法］本発明の基板は、例え
ば、基板が、金属基板または金属被覆を有する基板の場
合、これら基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部
分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有
するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表
面に固定化させることで製造することができる。二重鎖
部分及び一重鎖部分を有する二本鎖ＤＮＡは、前述のよ
うに、長さが異なる2本の一本鎖であって、短鎖の一本
鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれ
かの端からの塩基配列と、相補的である、2本の一本鎖
をハイブリダイズすることで作製することができる。そ
して、例えば、短鎖の一本鎖ＤＮＡの5'端にチオール基
を導入し、この短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と3'端側が相
補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズ
させれば、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記
二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖が得ら
れる。一本鎖ＤＮＡの5'端へのチオール基の導入は、例
えば、公知のC6合成方法を用いて行うことができる。
(例えば、化学と生物実験ライン22、丹羽峰雄著、"ＤＮ
Ａの化学合成"38〜43頁、廣川書店参照) また、短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と3'端側が相補的配列
である長鎖の一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズも通常の
方法と条件で適宜行うことができる。
ば、基板が、金属基板または金属被覆を有する基板の場
合、これら基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部
分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有
するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表
面に固定化させることで製造することができる。二重鎖
部分及び一重鎖部分を有する二本鎖ＤＮＡは、前述のよ
うに、長さが異なる2本の一本鎖であって、短鎖の一本
鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれ
かの端からの塩基配列と、相補的である、2本の一本鎖
をハイブリダイズすることで作製することができる。そ
して、例えば、短鎖の一本鎖ＤＮＡの5'端にチオール基
を導入し、この短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と3'端側が相
補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズ
させれば、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記
二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖が得ら
れる。一本鎖ＤＮＡの5'端へのチオール基の導入は、例
えば、公知のC6合成方法を用いて行うことができる。
(例えば、化学と生物実験ライン22、丹羽峰雄著、"ＤＮ
Ａの化学合成"38〜43頁、廣川書店参照) また、短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と3'端側が相補的配列
である長鎖の一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズも通常の
方法と条件で適宜行うことができる。
【００１５】基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の固定化は、
二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末
端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を金属表面と接触させ
ることが行うことができる。チオール基を有するＤＮＡ
鎖の金属表面への固定化は例えば、J.Am.Chem.Soc.199
8,120,9787-9792に記載され、公知の方法である。
二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末
端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を金属表面と接触させ
ることが行うことができる。チオール基を有するＤＮＡ
鎖の金属表面への固定化は例えば、J.Am.Chem.Soc.199
8,120,9787-9792に記載され、公知の方法である。
【００１６】さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖の所定割合の混合物を金属基板または金
属被覆を有する基板の金属表面に、上記と同様に接触さ
せることで、所定の割合で二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を
金属表面に固定化させることもできる。
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖の所定割合の混合物を金属基板または金
属被覆を有する基板の金属表面に、上記と同様に接触さ
せることで、所定の割合で二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を
金属表面に固定化させることもできる。
【００１７】本発明の基板は、基板がガラス基板または
シリコン基板の場合、例えば、これらの基板の表面をヘ
テロ２官能性架橋剤で表面処理し、表面処理した表面
に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖
部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させ
て、前記ＤＮＡ鎖を前記表面にさせることで製造でき
る。二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分
の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖は上記の方法で製
造することができる。
シリコン基板の場合、例えば、これらの基板の表面をヘ
テロ２官能性架橋剤で表面処理し、表面処理した表面
に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖
部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させ
て、前記ＤＮＡ鎖を前記表面にさせることで製造でき
る。二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分
の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖は上記の方法で製
造することができる。
【００１８】上記のように、二重鎖部分及び一重鎖部分
を有するＤＮＡ鎖の二重鎖部分の末端にチオール基を導
入するが、チオール基を導入する鎖は、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の短鎖であっても、長鎖で
あっても良い。但し、二重鎖部分のみを構成する短鎖に
チオール基を導入することが好ましい。何故なら、ハイ
ブリダイゼーションに関与することになる一重鎖部分を
有する長鎖を、短鎖とハイブリダイゼーションさせる以
外の処理することなく、使用できるという利点があるか
らである。
を有するＤＮＡ鎖の二重鎖部分の末端にチオール基を導
入するが、チオール基を導入する鎖は、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の短鎖であっても、長鎖で
あっても良い。但し、二重鎖部分のみを構成する短鎖に
チオール基を導入することが好ましい。何故なら、ハイ
ブリダイゼーションに関与することになる一重鎖部分を
有する長鎖を、短鎖とハイブリダイゼーションさせる以
外の処理することなく、使用できるという利点があるか
らである。
【００１９】この固定化方法は、例えば、Nucleic Acid
s Research, 1996, Vol.24, No.15,3031-3039に記載さ
れている。上記ヘテロ２官能性架橋剤は、スクシンイミ
ジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキ
シ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイ
ミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤であるこ
とができる。
s Research, 1996, Vol.24, No.15,3031-3039に記載さ
れている。上記ヘテロ２官能性架橋剤は、スクシンイミ
ジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキ
シ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイ
ミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤であるこ
とができる。
【００２０】さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を、ヘテロ２官
能性架橋剤を表面処理したガラス基板またはシリコン基
板の表面に接触させることで、前記２種のＤＮＡ鎖を所
定割合で表面に固定化させることができる。
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を、ヘテロ２官
能性架橋剤を表面処理したガラス基板またはシリコン基
板の表面に接触させることで、前記２種のＤＮＡ鎖を所
定割合で表面に固定化させることができる。
【００２１】上記基板の金属表面に、二重鎖部分及び一
重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を
有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、
前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させる方法におい
ては、前記ＤＮＡ鎖の金属表面への接触を、２価金属イ
オンの存在下で行うことが好ましい。２価金属イオンの
存在下で行うことで、二重鎖部分の安定性が増加し、さ
らに二重鎖部分が凝集し、基板上で安定に存在するとい
う利点がある。また、２価金属イオンとしては、例え
ば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルト
イオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カド
ミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることが
できる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、1〜1
000mMの範囲とすることが適当である。
重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を
有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤ
ＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみか
らなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、
前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させる方法におい
ては、前記ＤＮＡ鎖の金属表面への接触を、２価金属イ
オンの存在下で行うことが好ましい。２価金属イオンの
存在下で行うことで、二重鎖部分の安定性が増加し、さ
らに二重鎖部分が凝集し、基板上で安定に存在するとい
う利点がある。また、２価金属イオンとしては、例え
ば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルト
イオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カド
ミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることが
できる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、1〜1
000mMの範囲とすることが適当である。
【００２２】同様に、上記ヘテロ２官能性架橋剤で表面
処理した基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ
鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記
二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末
端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ
鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖
を前記表面に固定化させる方法においても、前記ＤＮＡ
鎖の表面への接触を、上記と同様の２価金属イオンの存
在下で行うことが、上記と同様の理由で好ましい。
処理した基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有
し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ
鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記
二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末
端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ
鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖
を前記表面に固定化させる方法においても、前記ＤＮＡ
鎖の表面への接触を、上記と同様の２価金属イオンの存
在下で行うことが、上記と同様の理由で好ましい。
【００２３】［相補性を試験する方法］本発明の相補性
試験方法は、上記本発明の基板のＤＮＡ鎖を固定化した
表面にターゲットＤＮＡを接触させ、このターゲットＤ
ＮＡと二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一
重鎖部分との相補性を試験することを含む。より具体的
には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一
重鎖部分とハイブリダイズしたターゲットＤＮＡの存在
を適当な手段で検出して、相補性を試験する。
試験方法は、上記本発明の基板のＤＮＡ鎖を固定化した
表面にターゲットＤＮＡを接触させ、このターゲットＤ
ＮＡと二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一
重鎖部分との相補性を試験することを含む。より具体的
には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一
重鎖部分とハイブリダイズしたターゲットＤＮＡの存在
を適当な手段で検出して、相補性を試験する。
【００２４】ターゲットＤＮＡとＤＮＡ鎖の一重鎖部分
とのハイブリダイゼーションの有無の検出は、公知の方
法を適宜使用使用できるが、例えば、表面プラズモン共
鳴法または水晶振動子法により検出する方法を挙げるこ
とができる。表面プラズモン共鳴法は、基板表面にレー
ザ光を照射し、基板表面で生じる表面プラズモン共鳴を
測定することで基板表面に存在する膜等の厚みを測定す
る方法であり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンしたＤＮＡ鎖の存在の有無を膜厚の違いとして認識
し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。表面プ
ラズモン共鳴法では、ターゲットＤＮＡや基板に固定す
るＤＮＡ鎖に標識を付す必要がなく、簡便にハイブリダ
イゼーションの有無を検出することができる。
とのハイブリダイゼーションの有無の検出は、公知の方
法を適宜使用使用できるが、例えば、表面プラズモン共
鳴法または水晶振動子法により検出する方法を挙げるこ
とができる。表面プラズモン共鳴法は、基板表面にレー
ザ光を照射し、基板表面で生じる表面プラズモン共鳴を
測定することで基板表面に存在する膜等の厚みを測定す
る方法であり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンしたＤＮＡ鎖の存在の有無を膜厚の違いとして認識
し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。表面プ
ラズモン共鳴法では、ターゲットＤＮＡや基板に固定す
るＤＮＡ鎖に標識を付す必要がなく、簡便にハイブリダ
イゼーションの有無を検出することができる。
【００２５】水晶振動子法は、水晶振動子の電極への物
質の付着による振動数の減少から付着物の質量を求める
方法である(例えば、Chem. Rev.,1992,92,1355-1379参
照)。
質の付着による振動数の減少から付着物の質量を求める
方法である(例えば、Chem. Rev.,1992,92,1355-1379参
照)。
【００２６】ターゲットＤＮＡとＤＮＡ鎖の一重鎖部分
とのハイブリダイゼーションの有無の検出は、例えば、
ターゲットＤＮＡが蛍光標識を有するＤＮＡであり、前
記ＤＮＡ鎖の一重鎖部分とのハイブリダイゼーションの
有無を蛍光により検出することによっても行うことがで
きる。蛍光標識を有するＤＮＡ及びハイブリダイゼーシ
ョンの有無を蛍光により検出する方法も公知であり、本
発明では、それら公知の技術をそのまま使用することが
できる。
とのハイブリダイゼーションの有無の検出は、例えば、
ターゲットＤＮＡが蛍光標識を有するＤＮＡであり、前
記ＤＮＡ鎖の一重鎖部分とのハイブリダイゼーションの
有無を蛍光により検出することによっても行うことがで
きる。蛍光標識を有するＤＮＡ及びハイブリダイゼーシ
ョンの有無を蛍光により検出する方法も公知であり、本
発明では、それら公知の技術をそのまま使用することが
できる。
【００２７】本発明の相補性試験方法では、塩基のミス
マッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもでき
る。即ち、本発明の相補性試験方法では、完全相補的な
ターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをする
が、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡは、ハイ
ブリダイゼーションをせず、その結果、一塩基ミスマッ
チを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。
マッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもでき
る。即ち、本発明の相補性試験方法では、完全相補的な
ターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをする
が、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡは、ハイ
ブリダイゼーションをせず、その結果、一塩基ミスマッ
チを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。
【００２８】本発明の相補性試験方法では、ＤＮＡ鎖を
固定化した表面へのターゲットＤＮＡの接触を、２価金
属イオンの存在下で行うことがハイブリダイゼーション
後の二重鎖部分の安定性という観点から好ましい。２価
金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カ
ルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ス
トロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、
鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオ
ンの濃度は、例えば、1〜1000mMの範囲とすることが適
当である。
固定化した表面へのターゲットＤＮＡの接触を、２価金
属イオンの存在下で行うことがハイブリダイゼーション
後の二重鎖部分の安定性という観点から好ましい。２価
金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カ
ルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ス
トロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、
鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオ
ンの濃度は、例えば、1〜1000mMの範囲とすることが適
当である。
【００２９】尚、本発明では基板にＤＮＡ鎖を固定する
態様について説明した。しかし、例えば、二重鎖部分及
び一重鎖部分のいずれかの一本鎖がＲＮＡであってもよ
い。また、二重鎖部のみからなる鎖のいずれかの一本鎖
がＲＮＡであってもよい。
態様について説明した。しかし、例えば、二重鎖部分及
び一重鎖部分のいずれかの一本鎖がＲＮＡであってもよ
い。また、二重鎖部のみからなる鎖のいずれかの一本鎖
がＲＮＡであってもよい。
【００３０】
【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例１
図１に示すスキームに従って、チオール化したＤＮＡオ
リゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖
（５０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（１））及び二
重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０マーと２０マーと
の２本鎖ＤＮＡ（２）））を調製し、基板に固定化し、
さらにハイブリダイゼーションに使用した。
リゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖
（５０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（１））及び二
重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０マーと２０マーと
の２本鎖ＤＮＡ（２）））を調製し、基板に固定化し、
さらにハイブリダイゼーションに使用した。
【００３１】［チオール化したＤＮＡオリゴマーの合
成］5'末端チオール化したHS-5'-ATGCATGCATTAGCATGCTA
-3'(20merSH)を公知のC6合成方法を用いて合成した。
(例えば、化学と生物実験ライン22、丹羽峰雄著、"ＤＮ
Ａの化学合成"38〜43頁、廣川書店参照)
成］5'末端チオール化したHS-5'-ATGCATGCATTAGCATGCTA
-3'(20merSH)を公知のC6合成方法を用いて合成した。
(例えば、化学と生物実験ライン22、丹羽峰雄著、"ＤＮ
Ａの化学合成"38〜43頁、廣川書店参照)
【００３２】［チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマー
の金表面への固定化］上記で合成した5'末端チオール化
したHS-5'-ATGCATGCATTAGCATGCTA-3'(20merSH)と5'-TAG
CATGCTAATGCATGCATTTTTTTTTTTTGGAGAACTGATCGACACAG-3'
（50mer）を緩衝溶液中で95℃まで過熱し、徐々に冷却
することによって、一部が二重らせん化した50mer/20me
rSH 複合体（1）を形成させ、プローブDNAとした。同様
の手順により、 5'-TAGCATGCTAATGCATGCAT-3'（20mer）
と20merSHの複合体20merC/20merSH（2）を形成させ、混
合希釈化合物として用いた。上記50mer/20merSH 複合体
（1）及び20merC/20merSH複合体（2）を用い、以下の条
件でチオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金基板表
面への固定化を行った。 バッファーの種類：MgCl2(H2O)6を20mMの濃度に調整
し、この溶液を１２０℃で２０分間滅菌した後、溶媒と
して使用した。 チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマー濃度：１．３Ｏ
Ｄ（約3.0マイクロモル）。 温度:20℃ 後処理: 溶媒でリンスして過剰のＤＮＡを洗い流した。
の金表面への固定化］上記で合成した5'末端チオール化
したHS-5'-ATGCATGCATTAGCATGCTA-3'(20merSH)と5'-TAG
CATGCTAATGCATGCATTTTTTTTTTTTGGAGAACTGATCGACACAG-3'
（50mer）を緩衝溶液中で95℃まで過熱し、徐々に冷却
することによって、一部が二重らせん化した50mer/20me
rSH 複合体（1）を形成させ、プローブDNAとした。同様
の手順により、 5'-TAGCATGCTAATGCATGCAT-3'（20mer）
と20merSHの複合体20merC/20merSH（2）を形成させ、混
合希釈化合物として用いた。上記50mer/20merSH 複合体
（1）及び20merC/20merSH複合体（2）を用い、以下の条
件でチオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金基板表
面への固定化を行った。 バッファーの種類：MgCl2(H2O)6を20mMの濃度に調整
し、この溶液を１２０℃で２０分間滅菌した後、溶媒と
して使用した。 チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマー濃度：１．３Ｏ
Ｄ（約3.0マイクロモル）。 温度:20℃ 後処理: 溶媒でリンスして過剰のＤＮＡを洗い流した。
【００３３】［ハイブリダイゼーション実験］上記で得
られた二重鎖ＤＮＡオリゴマーを固定化した基板にター
ゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。プロー
ブ DNA のプローブ部位へ相補的に相互作用が期待され
る5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCCA-3'（20merM）をターゲット
DNAとして用いた。さらに塩基の互変異性構造（塩基の
ミスマッチング）の検出実験のために、20merMと1つだ
け塩基配列が異なる 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20m
erS）をコントロールDNAとして用いた。ハイブリダイゼ
ーションのためにDNAを溶解させる溶媒としては20mMのM
gCl2水溶液を用いた。ハイブリダイゼーションの温度は
２０℃とし、２時間行った。
られた二重鎖ＤＮＡオリゴマーを固定化した基板にター
ゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。プロー
ブ DNA のプローブ部位へ相補的に相互作用が期待され
る5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCCA-3'（20merM）をターゲット
DNAとして用いた。さらに塩基の互変異性構造（塩基の
ミスマッチング）の検出実験のために、20merMと1つだ
け塩基配列が異なる 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20m
erS）をコントロールDNAとして用いた。ハイブリダイゼ
ーションのためにDNAを溶解させる溶媒としては20mMのM
gCl2水溶液を用いた。ハイブリダイゼーションの温度は
２０℃とし、２時間行った。
【００３４】［ＤＮＡ単分子膜の評価の具体的方法］金
属固体基板上へ吸着およびターゲットDNAと基板に固定
化したプローブDNAとの相互作用（ハイブリダイゼーシ
ョン）は表面プラズモン共鳴によりその場観察を行なっ
た。また、DNA単分子膜の評価は原子間力顕微鏡（AF
M）、光電子分光法（XPS）、反射赤外分光法（IR-RAS）
により行なった。
属固体基板上へ吸着およびターゲットDNAと基板に固定
化したプローブDNAとの相互作用（ハイブリダイゼーシ
ョン）は表面プラズモン共鳴によりその場観察を行なっ
た。また、DNA単分子膜の評価は原子間力顕微鏡（AF
M）、光電子分光法（XPS）、反射赤外分光法（IR-RAS）
により行なった。
【００３５】［ＤＮＡ固定化の確認］上記50mer/20merS
H 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体（2）の比率を
０:１００、５０：５０、１００：０と変化させたとき
の金基板表面への固定化の状況を、表面プラズモン共鳴
によりその場観察し、結果を図２に示す。MgCl2含有バ
ッファーを使用した場合、どの比率でも金基板表面に複
合体が固定化されていることが確認された。
H 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体（2）の比率を
０:１００、５０：５０、１００：０と変化させたとき
の金基板表面への固定化の状況を、表面プラズモン共鳴
によりその場観察し、結果を図２に示す。MgCl2含有バ
ッファーを使用した場合、どの比率でも金基板表面に複
合体が固定化されていることが確認された。
【００３６】［ハイブリダイゼーションの確認］上記50
mer/20merSH 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体
（2）の比率を０:１００、２５：７５、５０：５０、７
５：２５、１００：０と変化させて上記複合体を金基板
表面に固定化した基板を用い、この基板にターゲットDN
A 5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCCA-3'（20merM）をハイブリダ
イズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察
した。結果を図３に示す。50mer/20merSH 複合体（1）
の比率が高くなる程、ハイブリダイゼーションの比率も
高まり、７５：２５及び１００：０では、ほぼ同様の結
果が得られた。
mer/20merSH 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体
（2）の比率を０:１００、２５：７５、５０：５０、７
５：２５、１００：０と変化させて上記複合体を金基板
表面に固定化した基板を用い、この基板にターゲットDN
A 5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCCA-3'（20merM）をハイブリダ
イズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察
した。結果を図３に示す。50mer/20merSH 複合体（1）
の比率が高くなる程、ハイブリダイゼーションの比率も
高まり、７５：２５及び１００：０では、ほぼ同様の結
果が得られた。
【００３７】［一塩基ミスマッチの確認］上記50mer/20
merSH 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体（2）の比
率を１００：０として上記複合体を金基板表面に固定化
した基板を用い、この基板にターゲットDNA 5'-CTGTGTC
GATCAGTTCTCCA-3'（20merM）及び1つだけ塩基配列が異
なるコントロールDNA 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20
merS）をハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共
鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。図４に示
す結果から、本発明の方法によれば、一塩基ミスマッチ
を識別できることが分かる。
merSH 複合体（1）及び20merC/20merSH複合体（2）の比
率を１００：０として上記複合体を金基板表面に固定化
した基板を用い、この基板にターゲットDNA 5'-CTGTGTC
GATCAGTTCTCCA-3'（20merM）及び1つだけ塩基配列が異
なるコントロールDNA 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20
merS）をハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共
鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。図４に示
す結果から、本発明の方法によれば、一塩基ミスマッチ
を識別できることが分かる。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、表面被覆率及び活性度
を高めた、基板表面にＤＮＡ鎖を固定化したハイブリダ
イゼーション用基板及びその製造方法を提供でき、さら
にはこの基板を用いた相補性試験方法を提供することが
できる。
を高めた、基板表面にＤＮＡ鎖を固定化したハイブリダ
イゼーション用基板及びその製造方法を提供でき、さら
にはこの基板を用いた相補性試験方法を提供することが
できる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> Substrate for hybridization, method for preparation of the substra
te and the use thereof
<130> A15120H
<160> 5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgcatgcat tagcatgcta 20
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tagcatgcta atgcatgcat tttttttttt tggagaactg atcgacacag 50
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tagcatgcta atgcatgcat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctgtgtcgat cagttctcca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctgtgtcaat cagttctcca 20
【図１】実施例における、チオール化したＤＮＡオリゴ
マー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（50
mer/20merSH 複合体（1））及び二重鎖部分のみからな
るＤＮＡ鎖（20merC/20merSH複合体（2））の調製、基
板への固定化、及びハイブリダイゼーションのスキーム
を示す。
マー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（50
mer/20merSH 複合体（1））及び二重鎖部分のみからな
るＤＮＡ鎖（20merC/20merSH複合体（2））の調製、基
板への固定化、及びハイブリダイゼーションのスキーム
を示す。
【図２】50mer/20merSH 複合体（1）及び20merC/20merS
H複合体（2）の比率を０:１００、５０：５０、１０
０：０と変化させたときの金基板表面への固定化の状況
を、表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
H複合体（2）の比率を０:１００、５０：５０、１０
０：０と変化させたときの金基板表面への固定化の状況
を、表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
【図３】基板にターゲットDNA 5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCC
A-3'（20merM）をハイブリダイズさせた状況を表面プラ
ズモン共鳴によりその場観察した結果。
A-3'（20merM）をハイブリダイズさせた状況を表面プラ
ズモン共鳴によりその場観察した結果。
【図４】ターゲットDNA 5'-CTGTGTCGATCAGTTCTCCA-3'
（20merM）及び1つだけ塩基配列が異なるコントロールD
NA 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20merS）をハイブリ
ダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観
察した結果。
（20merM）及び1つだけ塩基配列が異なるコントロールD
NA 5'-CTGTGTCAATCAGTTCTCCA-3'（20merS）をハイブリ
ダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観
察した結果。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ａ ４Ｂ０２９
33/483 Ｃ
33/566
33/566 33/58 Ａ
33/58 37/00 １０２
37/00 １０２ 21/35 Ｚ
// Ｇ０１Ｎ 21/35 31/22 １２１Ｐ
31/22 １２１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ
(72)発明者 中嶋 健
埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所
内
(72)発明者 伊藤 英輔
埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所
内
Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 CA10 CB03 DA08
FA11 FB02 FB05 HA02
2G043 AA03 BA16 DA02 EA01 LA01
2G045 AA35 BB22 DA13 FA03 FA11
FB02 FB12 GC15
2G059 AA05 BB12 CC16 EE02 HH01
JJ01 KK01
4B024 AA11 BA80 CA04 CA05 CA09
HA11 HA12 HA13
4B029 AA07 AA21 BB20 CC03 FA02
FA10 FA15
Claims (22)
- 【請求項１】基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を
有するＤＮＡ鎖が固定化されており、かつ前記ＤＮＡ鎖
は、前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されてい
るハイブリダイゼーション用基板。 - 【請求項２】前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記ＤＮＡ鎖が
硫黄原子を介して固定化されている請求項１に記載の基
板。 - 【請求項３】前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を
介して固定化されている請求項１に記載の基板。 - 【請求項４】前記二重鎖部分の塩基数は10〜80の範囲で
あり、前記一重鎖部分の塩基数は20〜90の範囲である請
求項１〜３のいずれか１項に記載の基板。 - 【請求項５】前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前
記基板の表面にさらに固定化されている請求項１〜４の
いずれか１項に記載の基板。 - 【請求項６】前記基板が金属基板または金属被覆を有す
る基板であり、かつ該基板の金属表面に前記二重鎖部分
のみを有するＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されて
いる請求項５に記載の基板。 - 【請求項７】前記基板がガラス基板またはシリコン基板
であり、かつ該基板の表面に前記二重鎖部分のみを有す
るＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている請求項
５に記載の基板。 - 【請求項８】前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤ
ＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定
化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である請求項
５〜７のいずれか１項に記載の基板。 - 【請求項９】前記金属基板または金属被覆が金製である
請求項２または６に記載の基板。 - 【請求項１０】金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接
触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させ
る、請求項２に記載の基板の製造方法。 - 【請求項１１】金属基板または金属被覆を有する基板の
金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前
記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び
末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮ
Ａ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定
化させる、請求項６に記載の基板の製造方法。 - 【請求項１２】ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前
記表面に固定化させる、請求項３に記載の基板の製造方
法。 - 【請求項１３】ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガ
ラス基板またはシリコン基板の表面に、二重鎖部分及び
一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオー
ル基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二
重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮ
Ａ鎖を前記表面に固定化させる、請求項７に記載の基板
の製造方法。 - 【請求項１４】ヘテロ２官能性架橋剤が、スクシンイミ
ジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキ
シ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイ
ミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤である請
求項１２または１３に記載の製造方法。 - 【請求項１５】前記ＤＮＡ鎖の表面への接触を、２価金
属イオンの存在下で行う請求項１０〜１４のいずれか１
項に記載の製造方法。 - 【請求項１６】２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１５に記載の製造方法。 - 【請求項１７】請求項１〜９のいずれか１項に記載の基
板の前記ＤＮＡ鎖を固定化した表面にターゲットＤＮＡ
を接触させ、前記ターゲットＤＮＡと前記二重鎖部分及
び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の一重鎖部分との相補性
を試験する方法。 - 【請求項１８】ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲッ
トＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行う請求
項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】２価金属イオンがマグネシウムイオンで
ある請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】ターゲットＤＮＡと前記ＤＮＡ鎖の一重
鎖部分とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズ
モン共鳴法または水晶振動子法により検出する請求項１
７〜１９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２１】ターゲットＤＮＡが蛍光標識を有するＤ
ＮＡであり、前記ＤＮＡ鎖の一重鎖部分とのハイブリダ
イゼーションの有無を蛍光により検出する請求項１７〜
１９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２２】塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮ
Ａを検出するための請求項１７〜２１のいずれか１項に
記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001228374A JP2003043037A (ja) | 2001-07-27 | 2001-07-27 | ハイブリダイゼーション用基板、この基板の製造方法及び使用方法 |
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