JP2007289046A - 検出表面、相互作用促進方法、並びにハイブリダイゼーション検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】固相基板上などに形成された二本鎖核酸を、インターカレーターを用いて検出する場合における精度・定量性などを向上させること。
【解決手段】検出用のプローブ核酸２と標的核酸３とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分４を、インターカレーター５で検出する際に用いる検出表面Ａであって、プローブ核酸２が所定長のリンカー１を介して検出表面Ａに固定され、かつ、プローブ核酸２の固定間隔ｎが、リンカー１の鎖長ｌ及びハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸部分が形成された場合における二本鎖核酸部分の鎖長ｍを合わせた距離と同等かそれ以上である検出表面。これにより、二本鎖核酸部分４へのインターカレーター５の結合（符号Ｘ）を促進させることができるため、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分を、インターカレーターで検出する際に用いる検出表面、該検出表面を用いて、二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用を促進させる相互作用促進方法、該検出表面に固定されたプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法などに関する。

医学・生理学などの分野における遺伝子解析技術などとして、プローブ核酸を用いた方法が実用化され始めている。例えば、ＤＮＡチップなどの場合、固相基板上などに検出用のプローブ核酸を多種・多数固定し、その検出用のプローブ核酸とハイブリダイゼーションする標的核酸を網羅的に解析する。

現在、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを定量的かつ高精度に検出する手段の一つとして、インターカレーターを用いる手段が検討されている。インターカレーターは二本鎖核酸の間に入り込む性質を有する蛍光物質である。例えば、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分とインターカレーターとを相互作用させ、インターカレーターによる蛍光の強度を検出することにより、核酸を定量的かつ高精度に解析できる可能性がある。

なお、例えば、特許文献１及び特許文献２には、ＤＮＡチップなどにおいて、インターカレーターを用いて二本鎖核酸を検出する技術などが開示されている。
特開２００６−１０６２１号公報 特開２００６−１０５８２号公報

固相基板上などに固定された検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを、インターカレーターを用いて検出する場合、均一液相中などでハイブリダイゼーションを検出する場合と比較して、より厳密な条件設定が必要である。

例えば、固相基板上などに固定した検出用のプローブ核酸を用いて二本鎖核酸を検出する場合、立体障害による相互作用阻害などにより、インターカレーター自体の性能・感度が、均一液相中などよりも低下する可能性がある。

また、固相基板上などに固定した検出用のプローブ核酸を用いて二本鎖核酸を検出する場合、立体障害などにより、二本鎖核酸部分に三次元立体構造の異常が生じる場合が想定できる。その場合、二本鎖核酸が形成されていてもその立体構造に異常があり、インターカレーターの一部がその二本鎖核酸部分に相互作用できないため、ハイブリダイゼーション検出の精度や定量性が低下する可能性がある。

一方、固相基板上などに形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における好適な条件などは、充分検討されていない。

そこで、本発明は、固相基板上に形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における好適な条件を提供することにより、固相基板上などに形成された二本鎖核酸を、インターカレーターを用いて検出する場合における精度・定量性などを向上させることを主な目的とする。

本発明者は、固相基板上などに形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における好適な条件などを詳細に検討した。そして、所定長のリンカーを介して検出用のプローブ核酸を固定し、かつ、そのプローブ核酸の固定間隔を調整することにより、固相基板上に形成された二本鎖核酸の検出精度及び定量性などを向上できることを新規に見出した。

そこで、本発明では、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分を、インターカレーターで検出する際に用いる検出表面であって、検出用のプローブ核酸が所定長のリンカーを介して検出表面に固定され、かつ、そのプローブ核酸の固定間隔が、ハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸部分が形成された場合におけるその二本鎖核酸部分の鎖長と、リンカーの鎖長とを合わせた長さと同等かそれ以上である検出表面を提供する。

所定長のリンカーを介して検出用のプローブ核酸を固定し、かつ、検出用のプローブ核酸の固定間隔を上記の通り設定することにより、検出表面に形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に対する立体障害などの影響を極力排除でき、その相互作用量を均一液相中と同様にすることができる。

従って、この検出表面を用いることにより、二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用を促進させることができるため、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。

以下、本発明に係る技術用語について説明する。

「検出表面」は、固相基板などの表面のうち、ハイブリダイゼーションなどの反応場に臨む部分である。

「核酸」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブ核酸を含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）などを広く含む。

「プローブ核酸」は、標的核酸を検出するための検出子として機能する核酸（ヌクレオチド鎖）であり、検出表面などに固定されて存在する。

「標的核酸」は、全長又は一部に、検出用のプローブ核酸の塩基配列と相補的な配列を有する核酸であり、ハイブリダイゼーションを検出する際に、反応場に滴下又は供給される。

「リンカー」は、所定の鎖長を有し、検出表面とプローブ核酸とを連結するスペーサー分子であり、原則として、連結したプローブ核酸以外の核酸やインターカレーターとは相互作用しない分子である。

「インターカレーター」は、二本鎖核酸部分に結合して蛍光を発する物質である。なお、二本鎖核酸部位に対するインターカレーターの結合様式については、特に限定されない。

「相互作用」は、２つの物質が相互に結合することである。

「ハイブリダイゼーション」は、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であり、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の特異的な結合、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ間の特異的な結合、などを広く含む。

本発明により、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分を、インターカレーターで検出するにおいて、ハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。

＜本発明に係る検出表面について＞
はじめに、図１を用いて、本発明に係る検出表面の例について、以下説明する。

図１では、検出表面Ａ上に反応場Ｂが形成され、また、検出表面Ａに所定長のリンカー１を介して検出用のプローブ核酸２が固定されている。図１に例示する通り、検出用のプローブ核酸２と標的核酸３とがハイブリダイゼーションし、二本鎖核酸部分４を形成する。そして、二本鎖核酸部分４にインターカレーター５が結合する（符号Ｘ参照）とインターカレーター５が蛍光励起する。その蛍光を検出することにより、ハイブリダイゼーションを定量的かつ高精度に検出できる。

検出表面Ａを含む固相基板などの材質などは特に限定されないが、所定波長の励起光（例えば、蛍光励起光）を透過可能な材質の方が、相互作用検出時などに基板側から励起できるなどの観点から、好ましい。例えば、ＣＤ（ｃｏｍｐａｃｔ ｄｉｓｃ）、ＤＶＤ（ｄｅｇｉｔａｌ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｄｉｓｃ）、ＭＤ（ｍｉｎｉ ｄｉｓｃ）など、公知の光情報記録媒体と同様の基材を用いることができ、石英などのガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの材料が好適である。

反応場Ｂは、検出用のプローブ核酸２と標的核酸３とのハイブリダイゼーションの場である。反応場Ｂでは、試料（標的核酸３などを含む）、媒質（緩衝液など）、試薬（インターカレーター５などを含む）などが供給・貯留される。

リンカー１は、所定の鎖長を有し、検出表面Ａとプローブ核酸２とを連結でき、かつ、原則として、連結したプローブ核酸以外の核酸やインターカレーターとは相互作用しない分子であればよい。リンカー１には、公知のスペーサー分子を用いることができる。例えば、炭素（Ｃ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）などからなる鎖分子で、かつ、鎖長が約４０〜５０Åのものが好適である。

検出用のプローブ核酸２には、検出したい核酸の塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するものを用いる。プローブ核酸２は、合成核酸であるかどうかにより、狭く限定されない。鎖長（ｍｅｒ数）は、目的などに応じ、適宜設定可能である。

リンカー１及び検出用のプローブ核酸２の固定手段は公知の方法を用いることができ、特に限定されない。例えば、検出表面Ａをアビジン処理し、リンカー１の一端をビオチン化し、リンカー１の他端にプローブ核酸２を結合させてもよい。この場合、アビジン−ビオチン結合により、比較的簡易に、プローブ核酸２を検出表面Ａに、検出表面Ａ−リンカー１−プローブ核酸２の順で固定できる。

本発明では、検出用のプローブ核酸２の固定間隔（固定密度）ｎを、例えば、ハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸部分が形成されたと想定した場合におけるその二本鎖核酸部分の鎖長（符号ｍ）と、リンカーの鎖長（符号ｌ）との和以上の長さに設定する。これにより、検出表面に形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に対する立体障害などの影響を極力排除できるため、、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。

標的核酸３には、例えば、人体などから採取した生物試料から公知の方法で核酸を抽出・調製・合成などしたものを用いることができる。その場合、例えば、目的の試料から核酸を抽出などして用いてもよいし、目的の試料から核酸を抽出後、公知の方法により、ｃＤＮＡなどを合成して用いてもよい。

インターカレーター５には、公知のものを用いることができる。インターカレーターとして、例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（以上、米モレキュラー プローブス社製）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などを挙げることができる。

＜本発明に係る方法について＞
続いて、本発明に係る相互作用促進方法及びハイブリダイゼーション検出方法について、以下説明する。

本発明に係る検出表面を用いることにより、検出表面に形成された二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に対する立体障害などの影響を極力排除できるため、二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用を促進させることができる。従って、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。

例えば、まず、検出用のプローブ核酸が固定された検出表面上の反応場を緩衝液などで満たし、その中に、試料となる核酸を滴下などし、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを形成させる。次に、その反応場にインターカレーターを滴下などし、ハイブリダイゼーションを蛍光励起により検出する。なお、標的核酸及びインターカレーターの滴下手段・時期などは適宜設計変更が可能である。

緩衝液には、公知のもの、例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液などのグット緩衝液、トリス緩衝液などを用いることができる。緩衝液の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２など）の濃度を調整することにより、核酸などの基板表面などへの非特異的吸着を防止できる。また、緩衝液として、塩を含むＨＥＰＥＳ緩衝液などを用いた場合も、核酸などの基板表面などへの非特異的吸着を防止できる。

実施例１では、検出用のプローブ核酸の固定密度が、そのプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用に与える影響について、ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス）装置を用いて検証した。

本実施例では、ＱＣＭ装置に「ＡｆｆｉｎｉｘＱ（「Ａｆｆｉｎｉｘ」は登録商標、株式会社イニシアム製）」を用いた。この装置に付属するセンサーチップは、Ａｕ電極（直径２．５ｍｍ）と水晶発振子（直径８ｍｍ）とを備える。Ａｕ電極に物質が付着すると、水晶発振子の発振周波数が、物質の付着重量に比例して変化する。従って、発振周波数の変化（ΔＦ）をＱＣＭ装置で測定することにより、Ａｕ電極への物質の付着重量を測定できる。なお、本実施例において、発振周波数１Ｈｚの変化は、０．６２ｎｇ／ｃｍ^２の重量変化に相当する。

実験手順の概要を以下に示す。

はじめに、二本鎖核酸の調製を行った。プローブ核酸（配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）、及び、その相補鎖のオリゴヌクレオチド（配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）をそれぞれ準備し、プローブ核酸の５’末端にリンカー修飾及びビオチン化を行った後、プローブ核酸とその相補鎖をアニーリングさせ、二本鎖核酸を調製した。

リンカーの修飾及びビオチン化は、１−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ−３−Ｏ−（Ｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｙｌ−ｇｌｙｃｅｒｙｌ−２−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、及び、１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて、両化合物の付属プロトコルに従って行い、５’末端に、リンカー及びビオチンが「オリゴヌクレオチド−リンカー−ビオチン」の順で結合するように行った。本実施例では、両オリゴヌクレオチドの合成、並びにプローブ核酸のリンカー修飾及びビオチン化を、つくばオリゴサービス株式会社に受託した。プローブ核酸におけるビオチンからリンカーまでの部分の化学構造式を「化１」に示す。

なお、本実施例では、同社より購入した両合成オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣで精製し、実験に用いた。カラムに「ＳｕｎＦｉｒｅ ３．５μｍ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ製）」を用いて、６０℃条件下で、５０ｍＭ蟻酸アンモニウムとアセトニトリルによりグラジエントをかけて精製した。精製後、オリゴヌクレオチドを０．１ＭのＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭの塩化マグネシウム含有、ｐＨ７．７）に溶解し、酵素分解法により、Ｐ１ヌクレアーゼ（独Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、アルカリホスファターゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、濃度を決定した。

続いて、二本鎖核酸をＡｕ電極基板上に固定した。まず、予め、装置付属プロトコルに従い、センサーチップのＡｕ表面をアビジンで被覆しておいた。アビジンは、和光純薬工業株式会社製のもの（製品名「アビジン」）を用いた。また、装置内の反応槽に、調製した二本鎖核酸のバッファー溶液を入れた。そして、反応槽にセンサーチップを浸し、アビジン−ビオチン結合により、二本鎖核酸をＡｕ電極基板上に結合させ、固定した。

その際、二本鎖核酸がＡｕ電極基板と結合することにより、水晶発振子の発振周波数が変動する。そこで、ＱＣＭ装置を用いて、発振周波数の変動を経時的に測定しながら、二本鎖核酸の固定を行った。そして、二本鎖核酸の固定量（固定密度）が所定値になった時点で、センサーチップを反応槽から取り出して洗浄し、二本鎖核酸とＡｕ電極基板との結合反応を止めた。これにより、固定密度を調節できた。本実施例では、固定密度を、２．０５〜１０．３×１０^１０個／ｍｍ^２の間の１０箇所の値に設定した。

続いて、反応槽をインターカレーター溶液が入ったものに取り替え、その中に、センサーチップを浸し、ＱＣＭ装置により、発振振動数の変動を測定した。インターカレーターには、「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（米モレキュラー プローブス社製）」を用いた。

一例として、以上の各手順における発振振動数の変動を図２に示す。なお、図２は、二本鎖核酸の固定密度を５．４２×１０^１０個／ｍｍ^２に設定した場合におけるグラフである。グラフ中の横軸は時間（ｍｉｎ）を、縦軸は水晶発振子の発振周波数ΔＦ（Ｈｚ）を表す。

図２中、「１」の時点は、二本鎖核酸のバッファー溶液が入った反応槽にセンサーチップを浸した段階を示す。「２」の時点は、センサーチップを反応槽から取り出して、Ａｕ電極基板への二本鎖核酸の固定を止めた段階を示す。「３」の時点は、インターカレーター溶液が入った反応槽にセンサーチップを浸した段階を示す。

図２中、「（ａ）」の段階では、アビジン−ビオチン結合により二本鎖核酸がＡｕ電極基板に経時的に固定され、発振振動数が経時的に変動する。なお、図２に示す通り、二本鎖核酸をＡｕ電極基板に固定する際には、発振振動数の変動は比較的緩やかなため、「２」の時点を調節することにより、二本鎖核酸の固定量（固定密度）を調節できる。

図２中、「（ｂ）」の段階では、センサーチップを反応槽に浸した時点（「３」の時点）で、二本鎖核酸にインターカレーターが結合することにより、発振振動数が下がっている。

結果を表１及び図３に示す。

表１は、二本鎖核酸の固定密度を各値に設定した場合における二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量（二本鎖核酸へのインターカレーターの結合量）を示す。なお、相互作用量（ｍｏｌ）は、発振振動数（ΔＦ）の変動をインターカレーターの結合量に換算した値である。

図３は、表１の値を片対数プロットしたグラフである。グラフの横軸は二本鎖核酸の固定密度（×１０^１０個／ｍｍ^２、自然対数）を、縦軸は二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量（ｍｏｌ）をそれぞれ表す。なお、これらの値について、「数１」に示す線形近似式が得られた。

表１及び図３に示す通り、二本鎖核酸の固定密度が２．９９〜１０．３×１０^１０個／ｍｍ^２であった場合、固定密度の低下とともに、徐々に相互作用量が増加した。

一方、二本鎖核酸の固定密度が２．０５×１０^１０個／ｍｍ^２であった場合、相互作用量が急激に増加した。二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量は、約１８ｍｏｌだった。

実施例２では、リンカーの長さが、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用に与える影響について、ＱＣＭ装置を用いて検証した。

はじめに、二本鎖核酸の調製を行った。それぞれ、鎖長が１５ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒであるプローブ核酸及びその相補鎖のオリゴヌクレオチドを準備し、プローブ核酸の５’末端に短い又は長いリンカーの修飾及びビオチン化を行った後、プローブ核酸とその相補鎖をアニーリングさせ、二本鎖核酸を調製した。

それぞれ、鎖長が１５ｍｅｒの場合におけるプローブ核酸の塩基配列を配列番号３に、その相補鎖オリゴヌクレオチドを配列番号４に、鎖長が２０ｍｅｒの場合におけるプローブ核酸の塩基配列を配列番号５に、その相補鎖オリゴヌクレオチドを配列番号６に、鎖長が２５ｍｅｒの場合におけるプローブ核酸の塩基配列を配列番号７に、その相補鎖オリゴヌクレオチドを配列番号８に、鎖長が３０ｍｅｒの場合におけるプローブ核酸の塩基配列を配列番号９に、その相補鎖オリゴヌクレオチドを配列番号１０に示す。

短いリンカーの修飾及びビオチン化は、１−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ−２−（Ｎ−ｂｉｏｔｉｎｙｌ−４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−３−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて、両化合物の付属プロトコルに従って行い、５’末端に、リンカー及びビオチンが「オリゴヌクレオチド−リンカー−ビオチン」の順で結合するように行った。これらのプローブ鎖における、ビオチンからリンカーまでの部分の化学構造式を「化２」に示す。

長いリンカーの修飾及びビオチン化は、実施例１と同様の手順で行った。なお、各オリゴヌクレオチドの合成、並びにプローブ鎖オリゴヌクレオチドのリンカー修飾及びビオチン化は、実施例１と同様、つくばオリゴサービス株式会社に受託した。その他、用いたオリゴヌクレオチドの精製、濃度決定などについても、実施例１と同様に行った。

続いて、実施例１と同様の方法により、二本鎖核酸をＡｕ電極基板上に固定した。本実施例では、二本鎖核酸の鎖長の影響を考慮し、二本鎖核酸の固定量（固定密度）を、それぞれ、１５ｍｅｒの二本鎖核酸の場合では１．０ｐｍｏｌ、２０ｍｅｒの二本鎖核酸の場合では０．７５ｐｍｏｌ、２５ｍｅｒの二本鎖核酸の場合では０．６０ｐｍｏｌ、３０ｍｅｒの二本鎖核酸の場合では０．５ｐｍｏｌに設定した。

続いて、実施例１と同様の手順で、反応槽をインターカレーター溶液が入ったものに取り替え、その中に、センサーチップを浸し、ＱＣＭ装置により、発振振動数の変動を測定した。インターカレーターには、実施例１と同様、「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（米モレキュラー プローブス社製）」を用いた。

結果を表２及び図４、図５に示す。

表２は、それぞれ、短いリンカー又は長いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合における二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量（二本鎖核酸へのインターカレーターの結合量）を示す。なお、相互作用量（ｍｏｌ）は、発振振動数（ΔＦ）の変動をインターカレーターの結合量に換算し、二本鎖核酸の固定量で除した値である。

図４は、表２中、短いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合における相互作用量を片対数プロットしたグラフである。図５は、表２中、長いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合における相互作用量を片対数プロットしたグラフである。両グラフの横軸は二本鎖核酸の鎖長を、縦軸は二本鎖核酸１ｍｏｌ当たりの二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量（ｍｏｌ）をそれぞれ表す。

なお、図４及び図５のグラフに示した値について、それぞれ、「数２」及び「数３」に示す線形近似式が得られた。

表２及び図４、図５が示す通り、長いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合、短いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合と比較して、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量が増加した。この結果は、リンカーの長さを最適化することにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用反応性を高くできることを示す。

実施例３では、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を、ＩＴＣ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；等温適定カロリメトリー、以下同じ）により、熱力学的に検証した。

物質間の反応などの際には、熱の発生又は吸収がおこる。その熱量を測定することにより、物質間の反応の結合定数、結合比、エンタルピー変化、エントロピー変化などに関する知見を得られる。そこで、ＩＴＣにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用に関する熱学的プロファイルを取得し、その内容を検証した。

本実施例では、ＩＴＣ装置には「ＶＰ−ＩＴＣ（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を、同装置の制御及びデータ解析には「Ｏｒｉｇｉｎ ｖｅｒ７．０（米ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）」を用いた。

手順の概要を以下に示す。

まず、配列番号１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした二本鎖核酸を準備した。本実施例では、実施例１などと同様、この二本鎖核酸の合成を、つくばオリゴサービス株式会社による受託した。

次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）に二本鎖核酸９μＭを入れ、その中にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その溶液を、ＩＴＣ装置のセルに入れた。

次に、０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にインターカレーターを１．７５ｍＭになるように溶解した後、シリンジを用いて、そのインターカレーター溶液を６分ごとに６μＬずつ、ＩＴＣ装置のセルに滴下した。インターカレーターには、実施例１などと同様、「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（米モレキュラー プローブス社製）を用いた。

そして、インターカレーター溶液を滴下しながら、ＩＴＣ装置を用いて熱量（反応熱）の変化を測定した。本実施例では、ＩＴＣによる測定を、２５℃、３００ｒｐｍの撹拌条件下で実施した。

また、対照として、希釈熱の測定を行った。０．１Ｍリン酸バッファー（ＮａＣｌ ２００ｍＭ含有、ｐＨ７．４）にＤＭＳＯを濃度が８．７５％になるように混合し、その対照溶液を、インターカレーター溶液の代わりに、ＩＴＣ装置のセルに滴下した。そして、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値をデータ解析などに用いた。

結果を図６に示す。図６は、ＩＴＣによる測定結果を表すグラフである。

図６中、上段のグラフは、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）の変化を表す。グラフの横軸はインターカレーター溶液を滴下した時間（ｍｉｎ）を、縦軸は１秒間の熱量（反応熱）の変化（μｃａｌ／ｓｅｃ）を、それぞれ表す。時間経過とともに値が減少した場合が吸熱反応、値が増加した場合が発熱反応である。

図６中、下段のグラフは、インターカレーター溶液を滴下した場合における熱量（反応熱）から、その対照溶液を滴下した場合における熱量（希釈熱）を除した値、即ち、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における熱量を表す。グラフの横軸は滴下した総インターカレーター量（Ｍｏｌａｒ Ｒａｔｉｏ；試料室中における二本鎖核酸（定量）とインターカレーターのモル比）を、縦軸は滴下したインターカレーター１ｍｏｌにおける熱量（ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ ｏｆ ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）を、それぞれ表す。

図６の結果は、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用では、二種類の結合サイトが存在することを示唆する。そこで、ＩＴＣにより得られた測定結果について、ｔｗｏ ｓｉｔｅ ｍｏｄｅｌを用いて解析を行い、熱力学的プロファイルを取得した。

結果を表３に示す。

表中、「Ｓｉｔｅ１」及び「Ｓｉｔｅ２」は予測される二種類の結合サイトを表す。表中、「ｎ」は二本鎖核酸に存在する各結合サイトにおけるインターカレーターの結合数を、「Ｋａ（×１０^６Ｍ）」は二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用における結合定数を、「ΔＨ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」はエンタルピー変化を、「ＴΔＳ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」はエントロピー変化を、「ΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）」は自由エネルギー変化を、それぞれ表す。

表３の結果は、二本鎖核酸に存在する各結合サイトのうち、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用比が、第一の結合サイトでは１：約６．５５、第二の結合サイトでは１：約１１．７、合計では、１：約１８．２５であることを示す。即ち、二本鎖核酸１モルに対し、両結合サイトを合わせ、インターカレーターが約１８．２５モル結合することを示す。

実施例１（表１及び図３）では、固定密度が２．０５×１０^１０個／ｍｍ^２の時、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量が１８．６６モルであった。この固定密度の場合、隣接するプローブ核酸間の距離は１．２×１０^−５ｍｍである。一方、２０ｍｅｒの核酸の鎖長は約０．７１４×１０^−５ｍｍ、実施例２で用いた長いリンカーの鎖長は約０．５×１０^−５ｍｍである。即ち、隣接するプローブ核酸間の距離は、プローブ核酸の鎖長とリンカーの鎖長を合わせた距離にほぼ一致する。

従って、実施例１から実施例３までの結果は、プローブ核酸の固定間隔を、プローブ核酸の鎖長とリンカー鎖長を合わせた距離と同等かそれ以上にすることにより、二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用を促進できること、即ち、ハイブリダイゼーションの検出精度を向上できることを示す。

本発明により、二本鎖核酸部分とインターカレーターとの相互作用を促進させることができるため、検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの検出精度及び定量性を向上させることができる。従って、例えば、固相基板上などに固定した検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する系（ＤＮＡチップなど）において、インターカレーターを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合に本発明は有用である。

本発明に係る検出表面の例を示す断面模式図。 実施例１において、各手順における発振振動数の変動の例を示すグラフ。 実施例１において、二本鎖核酸の固定密度を各値に設定した場合における二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量を示す片対数グラフ。 実施例２において、短いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合における二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量を示す片対数グラフ。 実施例２において、長いリンカーを二本鎖核酸に修飾した場合における二本鎖核酸とインターカレーターとの相互作用量を示す片対数グラフ。 実施例３において、ＩＴＣによる測定結果を表すグラフ。

符号の説明

１ リンカー
２ 検出用のプローブ核酸
３ 標的核酸
４ 検出用プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分
５ インターカレーター
Ａ 検出表面
ｌ リンカーの鎖長
ｍ 検出用のプローブ核酸の鎖長（ハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸が形成されたと想定した場合におけるその二本鎖核酸部分の鎖長）
ｎ 検出用のプローブ核酸の固定間隔

Claims (3)

1. 検出用のプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸部分を、インターカレーターで検出する際に用いる検出表面であって、
   前記プローブ核酸が所定長のリンカーを介して前記検出表面に固定され、
   かつ、前記プローブ核酸の固定間隔が、前記ハイブリダイゼーションにより二本鎖核酸部分が形成された場合における該二本鎖核酸部分の鎖長と、前記リンカーの鎖長との和以上の長さである検出表面。
2. 請求項１記載の検出表面を用いて、前記二本鎖核酸部分と前記インターカレーターとの相互作用を促進させる相互作用促進方法。
3. 請求項１記載の検出表面を用いて、該検出表面に固定された前記プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法。