KR20100038330A - 입체구조적 방해 및 효소 관련 신호 증폭 기반의 고 특이성 및 고 민감도 검출 - Google Patents

입체구조적 방해 및 효소 관련 신호 증폭 기반의 고 특이성 및 고 민감도 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 내의 표적 핵산의 고민감도 및 고특이성 검출이 가능한 분자적 프로브에 관한 것이다. 이 프로브를 이용한 검출방법 또한 기재되어 있다.

Description

입체구조적 방해 및 효소 관련 신호 증폭 기반의 고 특이성 및 고 민감도 검출{HIGH SPECIFICITY AND HIGH SENSITIVITY DETECTION BASED ON STERIC HINDRANCE ＆ ENZYME―RELATED SIGNAL AMPLIFICATION}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2007년 5월 31일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/941,057호를 우선권으로 주장한다.
미연방 후원 하에 이루어진 연구 또는 개발의 권리에 관한 진술
본 발명은 NIH/NIDCR 지원 번호(grant number) UO1DE017790, UO1DE015018 및 RO1DE017593, 및 NASA/NSBRI 지원 번호 TD00406 하에 미정부 후원하에 이루어졌다. 미 정부는 본 발명의 확실한 권리를 갖는다.
1. 발명의 분야
본 발명은 핵산 프로브 및 검정 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
현장 검사(point-of-care)검출의 필요조건 중 하나는 혼합물 중의 소량의 표적 분자를 검출하는 것이다. 적은 수의 표적의 검출은 임의의 혼합물의 복잡성으로 인해 높은 민감도와 함께 높은 특이성을 필요로 한다. 그러나, 종래 분야의 검 출 방법은 특이성과 민감도 사이의 절충을 필요로 한다. 민감도를 증가시키는 것을 돕는 신호 증폭을 수득하기 위한 여러 기술이 개발되고 있다. 대부분의 검출 방법에서, 신호 강도는 검출 영역 내의 표적의 수와 관련이 있고, 상기 표적은 보통 전체 샘플 부피에 비해 매우 작다. 그러므로, 전체 샘플 부피 내의 표적의 양을 증폭시키거나 작은 검출 영역으로 표적을 축적시키는 것은 신호 강도를 높이는 것을 돕는다.
첫번째 방법은 표적, 프로브 및/또는 신호의 전체 수를 증가시켜, 높은 강도의 측정 결과를 발생시키는 것이다. 예를 들어, PCR, 프라임드 인 시츄 라벨링(Primed in situ labeling, PRINS) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 기술이 표적의 전체 양을 증가시키기 위해 적용된다. 문헌[Monis and Giglio, Infection Genetics and Evolution, 2006. 6(1): p. 2-12]를 참조하라. 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 롤링 써클 증폭(rolling circle amplification, RCA)은 프로브의 증폭을 수득한다. 브랜치드 DNA(Branched DNA, bDNA) 및 티라미드(tyramide) 신호 증폭(TSA)은 신호 증폭을 발생시킨다. 문헌[Andras et al., Molecular Biotechnology, 2001. 19(1): p. 29-44]을 참조하라.
표적/프로브/신호의 직접적인 증폭을 비교하는, 두번째 방법은 표적의 보다 많은 카피를 생성시키는 것 대신 표적의 국소 농도를 증가시키는 것에 초점을 둔다. 예를 들어, 나노기술은 나노입자 기반 기술을 적용시킴으로써 검출 영역에 샘플 내의 표적의 소수의 카피를 농축시킬 수 있다. 표적의 전체량 및 국소 농도 둘 모두의 증가는 높은 민감도를 발생시킨다. 그러나, 이는 또한 특이적 및 비특이적 신호가 증폭될 수 있으므로 높은 백그라운드 수준 및 보다 많은 위-양성(false-positive) 결과를 발생시킬 것이다.
다른 한편으로, 분자 비콘(beacon) 및 구속 구조(constraint structure)를 갖는 다른 프로브와 같은 백그라운드 잡음 수준을 감소시키기 위한 높은 특이성의 프로브가 디자인되었다. 문헌[Wei et al., Journal of the American Chemical Society, 2005. 127(15): p. 5306-5307; Broude, Trends in Biotechnology, 2002. 20(6): p. 249-256; Fan et al., Trends in Biotechnology, 2005. 23(4): p. 186-192; 및 Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology, 1996. 14(3): p. 303-308]을 참조하라. 통상적으로, 상기 방법은 거리 민감도 신호 트래듀싱(traducing) 과정, 예를 들어, FRET, 중격(intercalating) 염료(Howell et al., Genome Research, 2002. 12(9): p. 1401-1407) 및 전기화학을 기반으로 한다. 이러한 방법에서, 특정 표적의 결합은 프로브의 형태적 변화를 야기할 것이다. 형태적 변화는 신호 ON 상태로의 극적인 전환을 발생시킨다. 그러나, 특이성을 개선시킴으로써, 상기 프로브는 검출 한도를 격하시키는데, 이는 많은 양의 표적이 측정가능한 신호를 필요로 함으로써 검출 시스템에 더욱 많은 위-음성(false-negative) 결과를 도입시키기 때문이다.
따라서, 높은 민감도 및 높은 특이성 검출 둘 모두를 제공하는 검정 방법 및 시약이 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 일반적으로 프로브 및 검정 방법에 관한 것이다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 표적 핵산 분자를 검출하는 프로브를 제공한다. 프로브는 표적 핵산 분자의 서열에 특이적으로 하이브리드되는 폴리누클레오티드 서열, 및 수용체에 대한 리간드의 두 부분을 포함한다. 프로브는 표적 핵산 분자가 프로브에 결합되지 않은 제 1의 3차원 구조, 및 표적 핵산이 프로브에 결합된 제 2의 3차원 구조를 갖는다. 제 1의 3차원 구조는 리간드 결합으로부터 수용체를 억제하거나 예방하는 반면, 제 2의 3차원 구조는 수용체가 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 몇몇 구체예에서, 수용체는 검출가능한 라벨, 즉 검출가능한 신호를 제공하는 부분을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 검출가능한 신호는, 예를 들어, 효소 반응에 의해 증폭된다. 몇몇 구체예에서, 제 1의 3차원 구조는 리간드 결합으로부터 수용체를 입체구조적으로 방해한다. 몇몇 구체예에서, 프로브는 기판 또는 고체 지지체 상에 고정된다. 몇몇 구체예에서, 제 1의 3차원 구조는 기판 근처의 위치의 리간드에 배치되어, 상기 수용체가 상기 리간드 결합으로부터 억제되거나 방지된다. 몇몇 구체예에서, 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 구체예에서, 검출가능한 라벨은 플루오레세인(fluorescein), 스트렙타비딘 또는 비오틴 등이다. 몇몇 구체예에서, 검출가능한 라벨로부터의 검출 신호는 퍼옥시다아제, 라카아제(laccase), 글루코오스 산화효소, 알칼리성 인산분해효소 또는 요소분해효소 등에 의해 촉매되는 효소 반응에 의해 증폭될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로브는 헤어핀(헤어핀) 프로브 또는 4중(quadruplex) 프로브이다.
두번째 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 핵산 분자를 검정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 수용체의 존재하에서 상기 기재된 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 이후에 리간드와 수용체 사이의 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 프로브는 폴리누클레오티드 서열(표적 핵산 분자의 서열에 특이적으로 하이브리드될 수 있음) 및 리간드(수용체에 결합할 수 있음)를 포함하고, 이는 표적 핵산 분자가 프로브에 결합하지 않은 경우 제 1의 3차원 구조를 갖고, 표적 핵산이 프로브에 결합한 경우 제 2의 3차원 구조를 갖는다. 제 1의 3차원 구조는 리간드 결합으로부터 수용체를 억제하거나 방지하는 반면, 제 2의 3차원 구조는 수용체가 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 따라서, 리간드와 수용체 사이의 복합체의 존재는 샘플 내의 표적 핵산 분자의 존재를 나타내는 반면, 복합체의 부재는 샘플 내의 표적 핵산 분자의 부재를 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 수용체는 검출 신호를 제공할 수 있는 검출가능한 라벨이다. 몇몇 구체예에서, 검출가능한 신호는 증폭된다. 몇몇 구체예에서, 제 1의 3차원 구조는 리간드 결합으로부터 수용체를 입체구조적으로 방해한다. 몇몇 구체예에서, 프로브는 기판 상에 고정된다. 몇몇 구체예에서, 제 1의 3차원 구조는 기판 근처의 위치의 리간드에 배치되어, 상기 수용체가 상기 리간드 결합으로부터 억제되거나 방지된다. 몇몇 구체예에서, 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 구체예에서, 검출가느한 라벨은 플루오레세인, 스트렙타비딘 또는 비오틴 등이다. 몇몇 구체예에서, 검출가능한 라벨로부터의 검출 신호는 효소 반응에서 퍼옥시다아제, 라카아제, 글루코오스 산화효소, 알칼리성 인산분해효소 또는 요소분해효소 등의 사용에 의해 증폭될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로브는 헤어핀 프로브 또는 4중 프로브이다. 몇몇 구체예에서, 리간드에 결합되지 않은 임의의 수용체가 복합체의 검출 전에 제거된다.
본 발명은 "불결한" 샘플(높은 농도의 오염물질 및 신호 검출을 방해하는 물질을 가짐), 예를 들어, 타액 내의 매우 낮은 농도의 생체마커(biomarker)를 검출하는 방법을 제공한다. 이는 높은 품질의 샘플 제조가 이용가능하지 않거나 고비용인 상황, 예를 들어, 현장검사 상황, 및 생체마커 농도가 오염물질 및 방해 화합물(간섭제(interferent))에 비해 매우 적은 상황에 적용될 것이다. 저농도 검출을 위한 실행가능성 데이터가 구강암 mRNA 생체마커, IL8에서 제시된다.
몇몇 구체예에서, 프로브는 "즉시 사용가능(ready-to-use)"하고, 예를 들어, 프로브는 표면 상에서 예비 앵커링(anchoring)되고, 검출 동안 다른 처리가 필요하지 않다. 몇몇 구체예에서, 프로브는 생체적합성의 올리고누클레오티드 또는 앱타머(aptamer)이다.
본 발명의 프로브는 다수의 적용에 용이하게 이용될 수 있고, 고가의 기기 및 복잡한 데이터 분석을 필요로 하지 않는다. 판독 신호는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 신호, 예를 들어, 전기화학 신호, 형광 신호 등일 수 있다.
본 발명의 프로브는, 종래 분야의 방법이 상보성 및 비-상보성 표적에 대해 선택적이지 않아 위 양성(false positive) 결과를 발생시킴에 따라, 종래 분야에 비해 위 양성 결과를 감소시키거나 제거한다. 프로브 디자인에 대한 입체구조적 방해 효과는 특이성을 증가시킨다.
본 발명의 프로브는 또한, 높은 특이성을 갖는 종래 분야의 방법이 신호 감소를 발생시켜 위 음성(false negative) 결과를 발생시킴에 따라 종래 분야에 비해 위 음성 결과를 감소시키거나 제거한다. 신호 강도를 증가시킴으로써 민감도를 개선시키기 위해 특정 신호 증폭이 적용되었다.
본 발명의 프로브 및 방법은 혈액, 혈청, 뇨 및 타액 샘플 내의 생체마커에 대한 임상적 검출, 예를 들어, 본래의 타액을 이용한 타액 mRNA 검출 및 질병 초기 단계의 생체내 모니터링에 사용될 수 있다.
본 발명의 프로브 및 방법은 다중 검출, 예를 들어, 다양한 표적 핵산 분자에 특이적인 본 발명에 따른 다수의 프로브를 포함하는 마이크로어레이에 사용될 수 있다.
프로브의 상이한 상태 사이의 스위치가 가역적이므로 본 발명의 프로브는 재사용될 수 있으며, 센서도 재사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 수용체 및/또는 이에 결합된 라벨의 형태 및 크기가 입체구조적 방해 효과에 최적화되고, 예를 들어, 큰 수용체 및/또는 라벨이 비교적 작은 수용체 및/또는 라벨보다 입체구조적 방해에 더욱 민감할 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 표적 핵산 분자에 대한 프로브에 관한 것이다. 프로브는 폴리누클레오티드 서열(표적 핵산 분자의 서열, 예를 들어, IL-8 mRNA 또는 DNA 서열에 특이적으로 하이브리드됨) 및 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 이러한 프로브는 프로브에 결합되는 표적 핵산 분자의 부재하에서 제 1의 3차원 구조, 및 프로브에 결합되는 표적 핵산의 존재하에서 제 2의 3차원 구조를 갖는다. 제 1의 3차원 구조는 리간드 결합으로부터 수용체를 억제하거나 방지하는 반면, 제 2의 3차원 구조는 수용체가 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 허용한다.
몇몇 구체예에서, 프로브는 표적 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 폴리누클레오티드 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 상보적"은 온건한, 바람직하게는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 서열에 특이적으로 하이브리드되는 서열을 의미한다. 일부 예시적 폴리누클레오티드 서열이 표 2-4에 제시되어 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 하기 도면을 참조로 하여 추가로 이해된다:
도 1은 본 발명의 검정 방법의 구체예를 개략적으로 예시한다.
도 2는 본 발명에 따른 헤어핀 프로브를 갖는 프로브 구조의 영향을 도시한다.
도 3은 선형 프로브 및 헤어핀 프로브를 이용한 mRNA에 대한 검출 한도를 도시한다.
도 4는 헤어핀 프로브를 이용한 전기화학 검출에서의 특정 신호 증폭을 개략적으로 예시한다. 표적이 헤어핀 프로브에 결합되지 않는 경우, 헤어핀은 닫히게 되고, HRP는 표면 상에서 효과적인 복합체를 형성할 수 없어, 신호가 관찰되지 않는다. 표적과 하이브리드된 후, 헤어핀은 개방되고, HRP 복합체가 형성된다. 이후, TMB는 환원된 HRP를 계속 재생시켜, 전류 신호를 증폭시킨다.
도 5는 2개 세트의 헤어핀 적용 타액 RNA의 교차 보호를 나타내는 그래프이다: IL-8 및 S100A8. RNA 표적 수준은 IL-8에 대해 5 nM이고, S100A8에 대해 7 nM이다. 블랭크(blank) 신호는 6xSSC 및 10 mM MgCl2이다. 4회 수행된 실험의 평균 및 표준 편차가 제시되어 있다.
도 6은 다양한 링커를 이용한 IL-8 헤어핀 프로브를 이용한 검출을 그래프로 비교한다. 헤어핀은 블랭크 대조군에서는 닫히고, RNA 샘플을 이용하여 개방된다. IL-8 RNA의 농도는 50 nM이다. 블랭크 대조군은 6xSSC 및 10 mM MgCl2이다. 4회 수행된 실험의 평균 및 표준 편차가 제시된다. 다양한 링커 길이를 이용한 헤어핀 프로브의 형태가 개략적으로 제시된다.
도 7은 다양한 스템-루프(stem-loop) 구조를 갖는 IL-8 헤어핀 프로브를 이용한 검출을 그래프로 비교한다. 헤어핀은 블랭크 대조군에서 닫히고, RNA 샘플을 이용하여 개방된다. 밑줄이 있는 서열은 표적 RNA에 대해 상보적이다. 이탤릭체의 서열은 스템 부분이다. 굵은 글씨의 서열은 루프 부분이다. HP1: 스템에서 10 bp 및 듀플렉스(듀플렉스)에서 41 bp. HP2: 스템에서 8 bp 및 듀플렉스에서 34 bp. HP3: 스템에서 6 bp 및 듀플렉스에서 27 bp. IL-8 RNA의 농도는 50 nM이다. 블랭크 대조군은 6xSSC 및 10 mM MgCl2이다. 4회 수행된 실험의 평균 및 표준 편차가 제시된다.
도 8은 선형 및 헤어핀 프로브 사이에 비교된 타액 RNA 검출을 도시한다. (a): IL-8. 표 2에 나열된 바와 같이 선형 프로브는 IL-8 CP 및 IL-8 DP이고, 헤어핀 프로브는 IL-8 HP이다; (b): S100A8. 표 2에 나열된 바와 같이 선형 프로브는 S100A8 CP 및 S100A8 DP이고, 헤어핀 프로브는 S100A8 HP이다.
도 9는 IVT RNA을 이용한 스파이킹(spiking)된 타액의 전기화학 검출을 도시한다. 집단(Circle): (a) IL8; (b) S100A8. 타액 샘플은 임의의 처리 없이 동일한 사람의 동일 배치(batch)로부터의 전체 타액이다.
도 10은 라벨링 분자와 올리고누클레오티드 사이의 결합의 구조를 도시한다.
도 11은 HP 적용의 2개 세트의 IVT RNA를 이용한 교차 보호를 도시한다: IL-8 및 S100A8. (a) 8개 샘플에 대한 전류측정 신호. (1)-(4)은 S100A8에 대해 HP를 적용하였고, 표적 RNA는 각각 (1) 7 nM S100A8, (2) 500 nM IL-8, (3) 5 nM IL-8 및 (4) 완충액 단독이었다. (5)-(8)은 IL-8에 대해 HP를 이용하였고, 표적 RNA는 각각 (5) 5 nM IL-8, (6) 700 nM S100A8, (7) 7 nM S100A8 및 (8) 완충액 단독이었다. (b) (a)에서의 동일한 8개 샘플의 막대 차트. HP에 대한 서열은 IL-8 HP 및 S100A8 HP로서 표 3에 나열되어 있다. 4개의 개별적 실험의 평균 및 표준 편차가 제시되어 있다.
도 12는 선형 프로브(LP) 및 HP에 의한 타액 IL-8 RNA 검출을 도시한다. 표 3에 나열된 바와 같이 LP는 IL-8 CP 및 IL-8 DP였고, HP는 IL-8 HP이었다. 블랭크 대조군을 측정된 신호로부터 공제하였다. 4개 실험의 평균 및 표준 편차가 제시되어 있다. LP에 대한 4 fM 표적의 데이터 포인트는 나타내지 않았는데, 이는 이의 값이 블랭크 대조군의 값 미만이었기 때문이다.
도 13은 HP를 이용한 전류측정 신호 사이의 상관관계, 및 임상 타액 샘플의 동일 세트에 대한 IL-8 mRNA의 qPCR에 의해 결정된 농도를 도시한다. 선형회귀에 대한 R 2 는 0.99였다.
발명의 상세한 설명
형태 변화와 관련된 이전의 검출(Howell, W.M., M. Jobs, and A.J. Brookes, iFRET : an improved fluorescence system for DNA - meltmg analysis . Genome Research, 2002. 12(9): p. 1401-1407; Xiao, Y., et al., Single - step electronic detection of femtomolar DNA by target - induced strand displacement in an electrode-bound duplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103(45): p. 16677-16680; 및 Xiao, Y., et al., Label - free electronic detection of thrombin in blood serum by using an aptamer - based sensor . Angewandte Chemie-International Edition, 2005. 44(34): p. 5456-5459)에서, 표적 인지(특이성) 및 신호 증폭(민감도)은 2개의 관련되지 않은 단계이다. 인지 과정만이 특이적인 반면, 증폭은 비특이적이고, 신호 및 잡음 둘 모두에 적용된다. 본 발명에서, 증폭 및 인지는 둘 모두 특이적이다. 표적의 특이적 결합만이 신호 증폭을 야기할 것이다. 다른 간섭제(interferent)(검정되는 샘플 내의 오염물질 및 다른 분자)의 비특이적 결합은 측정되는 신호에 덜 현저하게 기여한다. 따라서, 잡음 수준은 억제되고, 표적 신호만이 증폭된다.
본원에서 사용되는 "표적"은 "표적 핵산 분자"와 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 "표적" 핵산 분자는 임의의 핵산 분자일 수 있고, 이의 존재 및/또는 양은 공지되어 있는 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 표적 핵산 분자의 서열은 공지되어 있다. 몇몇 구체예에서, 예를 들어, 돌연변이 검출에서, 표적 핵산 분자의 서열은 표준 핵산 서열로부터의 변경, 즉, 차이를 갖는 것으로 여겨지는 서열일 수 있다. 이러한 구체예에서, 표적 핵산 분자의 서열은 공지되어 있거나 공지되어 있지 않을 수 있고, "참조 핵산 서열"은 표적 핵산 분자의 서열이 비교될 수 있는 공지된 핵산 서열이다. 표적 핵산 분자에서의 변경은 하나의 누클레오티드 염기이거나 하나 이상의 누클레오티드 염기일 수 있다. 이러한 변경은 공지된 다형태 변경, 예를 들어, 하나의 누클레오티드의 다형태일 수 있다.
본원에서 사용되는 "핵산 분자", "폴리누클레오티드" 및 "올리고누클레오티드"는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥인 천연 또는 합성 기원의 DNA 및 RNA 분자를 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 핵산 분자는 공지된 누클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합, 및 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체로 통합될 수 있는 임의의 기질을 함유할 수 있다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보누클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 분리된다. 본원에서 사용되는 "분리된"은 천연 환경으로부터 분리되는 핵산 분자를 의미한다. "분리된" 핵산 분자는 실질적으로 분리되거나, 핵산 분자가 수득되는 종의 유전체 DNA로부터 정제될 수 있다. "분리된" 폴리누클레오티드는 핵산 분자가 일반적 및 천연적으로 5' 말단, 3' 말단 또는 이의 둘 모두에서 관련되는 다른 DNA 세그먼트로부터 분리되는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 천연 형태 또는 합성 변형된 형태일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 단일 가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(유전체, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 하유하고 1 대 1(one-to-one) 방식으로 DNA 분자에 해당하는 mRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 다른 핵산 분자, 지지체 물질, 리포터 분자, 켄처(quencher) 분자 또는 이의 조합물에 연결될 수 있다. 다른 핵산 분자는 프로모터, 아데닐중합체형성 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site), 다른 코딩 세그먼트 등을 포함한다. 따라서, 바람직하게는 소기의 재조합 DNA 또는 PCR 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 전체 길이와 함께 거의 임의의 길이의 핵산 단편이 이용될 수 있는 것이 고려된다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 핵산 서열이 고려된다.
본 발명의 핵산 분자는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 자동화 올리고누클레오티드 합성기, PCR 기술, 재조합 DNA 기술 등과 같이 당 분야에 공지된 방법 및 장비를 이용하여 핵산 서열을 직접 합성함으로써 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 라벨을 함유할 수 있다. 매우 다양한 라벨 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 핵산 분자를 이용하는 다양한 핵산 및 아미노산 검정에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "라벨" 또는 "검출가능한 라벨"은 방사선촬영술, 형광, 화학발광, 효소 활성, 흡광도 등을 포함하는 당 분야에 공지된 방법에 의해 검출가능한 신호를 발생시키는 조성물 또는 분자이다. 검출가능한 라벨은 방사성동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드, 예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 합텐(hapten), 양자점(quantum dot) 등을 포함한다.
"라벨링된" 핵산 분자는 핵산 분자의 존재가 핵산에 결합된 라벨의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있는 결합된 라벨을 포함한다. 라벨은 공유 결합, 예를 들어, 화학 결합, 또는 비공유 결합, 예를 들어, 이온 결합, 반 데르 발스 결합, 정전기 결합 또는 수소 결합을 통해 핵산 분자에 결합될 수 있다. 폴리누클레오티드와 관련된 서열을 검출하기 위한 라벨링된 하이브리드화 또는 PCR 프로브를 생성시키기 위해 당 분야에 공지된 방법이 이용될 수 있고, 이는 올리고라벨링(oligolabeling), 새김눈 번역(nick translation), 말단-라벨링(end-labeling) 또는 라벨링된 누클레오티드를 이용하는 PCR 증폭 등, 바람직하게는 말단-라벨링을 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 라벨은 방사성누클레오티드(radionucleotides), 효소, 형광제, 화학발광제, 또는 색소 작용제, 뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 핵산 프로브의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표적 핵산 서열에 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 천연 염기 또는 당 분야에 공지된 변형된 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[MPEP 2422, 8th ed]을 참조하라. 프로브의 누클레오티드 염기는 결합이 상보적인 핵산 분자에 결합하는 핵산 분자의 능력을 방해하지 않는 한 포스포디에스테르 결합이 아닌 결합에 의해 연결될 수 있다. 프로브는 프로브 서열에 대해 100% 미만의 상보성인 표적 서열에 결합할 수 있고, 이러한 결합은 하이브리드화 조건의 엄격성에 좌우된다. 샘플 내의 표적 서열 또는 서브서열(subsequence)의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 프로브의 존재 또는 부재가 검출될 수 있다. 프로브는 검출가능한 라벨을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 "검정하는"은 "검출하는", "측정하는", "모니터하는" 및 "분석하는"과 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "고정된", "부착된", "관련된", "컨쥬게이션된", "연결된", "커플링된", "고정된", "흡착된" 및 "연결된"은 상호교환적으로 사용되고, 이는 문맥에 명백히 달리 기술하지 않는한 가역성 또는 비가역성일 수 있는 직접적 및 간접적 연결, 부착, 결합 또는 컨쥬게이션을 포함한다.
본원에 제공된 "리간드"는 또 다른 분자, 즉 "수용체"에 결합하는 분자를 의미한다. 예를 들어, 항체에 대한 항원 결합, 상보성 올리고누클레오티드에 하이브리드되는 올리고누클레오티드, 수용체로의 호르몬 또는 신경전달물질 결합, 도는 효소에 대한 기질 또는 알로스테릭 작동자(allosteric effector) 결합은 천연 및 합성 생체분자, 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 분자, 탄수화물, 당, 지질, 지질단백질, 소분자, 천연 및 합성 유기 및 무기 물질, 합성 중합체 등을 포함한다. 본원에 제공된 "수용체"는 제공된 리간드에 특이적으로 결합하는 분자이다.
본원에서 사용되는 2개의 분자 사이의 "특이적 결합" 또는 "특이적 상호작용"은 제공된 리간드 및 이의 수용체가 제공된 샘플 내의 다른 성분 또는 오염물질의 결합 또는 이와의 상호작용과 구별되기에 충분한 특이성으로 서로 결합하거나 상호작용하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 구 "선택적(또는 특이적)으로 ~에 하이브리드된"은 엄격한 하이브리드화 내지 온건한 하이브리드화 조건하에서 다른 누클레오티드 서열에 비해 특성 누클레오티드 서열에 대한 핵산 분자의 결합, 듀플렉스화(duplexing) 또는 하이브리드화를 의미한다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화를 위해, 양성 신호는 백그라운드 하이브리드화에 비해 적어도 약 2배, 바람직하게는 약 5배, 더욱 바람직하게는 약 10배이다. 엄격한 하이브리드화 조건은 프로브의 열 융해 온도(Tm)의 약 5℃ 아래 내지 Tm의 약 10℃ 아래이다. 온건한 하이브리드화 조건은 프로브의 열 융해 온도(Tm)의 약 10℃ 아래 내지 Tm의 약 25℃ 아래이다.
높은 민감도: 민감도를 증가시키기 위해, 샌드위치(sandwich) 검출 기반 신호 증폭이 적용된다. 샌드위치 증폭의 기초 개념은 신호를 증폭시키기 위한 샌드위치 유사 복합체를 형성시키는 매개체의 적용이다. 첫번째로, 프로브에 대한 표적 결합 후, 검출 전에 리포터 라벨링된 프로브와 매개체 사이에 복합체가 형성된다. 이후, 과량의 매개체가 제거되고, 검출이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Liao, J.C., et al., Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. Journal of Clinical Microbiology, 2006. 44(2): p. 561-570; 및 Gau, V., et al., Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods, 2005. 37(1): p. 73-83]을 참조하라. 핵산의 통상적인 샌드위치 검출에서, 올리고누클레오티드 프로브는 선형이다. 따라서, 임의의 매개체 결합과 독립적으로 비특이적 및 특이적 표적 둘 모두는 백그라운드를 증가시키고, 위-양성 결과를 야기할 것이다.
높은 특이성: 특이성을 증가시키기 위해, 입체구조적 방해-샌드위치 구조(예를 들어, 스템-루프 및 앱타머)가 프로브 디자인에 도입된다. 본 발명의 프로브는 적어도 2개 상태의 구조를 갖는다. 표적이 결합되지 않는 경우, 프로브는 구조 Ⅰ로 유지된다. 구조 Ⅰ 상태에서, 리포터(대안적으로 "리간드"로 언급됨)은 매개체(대안적으로, 제공된 리간드에 특이적으로 결합하는 "수용체"로 언급됨)와 효과적인 복합체를 형성할 수 없는데, 이는 수용체가 리간드와의 접촉으로부터 입체구조적으로 방해되거나, 억제되거나, 방지되기 때문이다. 표적과의 결합 후, 프로브는 구조 Ⅱ로 변화된다. 구조 Ⅱ 상태에서, 리포터는 매개체와 효과적인 복합체를 형성하여, 신호 증폭을 발생시킨다. 입체구조적 방해 디자인은 노동 및 비용을 증가시키는 임의의 추가 화학적 반응 단계 없이 간단하고 효과적이다.
물리적 힘의 파라미터인 F a 는 형태를 구속시키는 프로브의 분자내 상호작용을 나타낸다. 보다 높은 F a 는 구조 Ⅰ 상태에서 프로브를 더욱 안정화시킨다. 또 다른 물리적 힘의 파라미터인 F b 는 표적과 프로브 사이의 분자내 상호작용을 나타낸다. 보다 높은 F b 는 프로브가 구조 Ⅱ 상태에서 안정화되는 것을 가능케 한다. F a 와 F b 사이의 경쟁은 프로브가 어떠한 상태로 유지되는지 결정한다. F b 는 표적과 프로브 사이의 상호작용으로부터 유래되므로, 특이적 표적 결합은 비특이적 표적 결합보다 높은 F b 를 발생시킬 것이다. 따라서, 검출의 특이성은 |F a -F b (특이적)|과 |F a -F b (비특이적)| 사이의 차에 의해 결정될 수 있다. 대부분의 경우, 표적 및 이에 따른 표적과 프로브 사이의 상호작용 F b 는 변경될 수 없다. 그러나, 높은 특이성을 달성하기 위해, 프로브 디자인을 변경시킴으로써 F a 를 요망되는 값으로 디자인할 수 있다.
낮은 카피 수 적용: 보통 시그널-오프(signal-off) 방법인 통상적인 형태 기반 검출 (Fan, C.H., K.W. Plaxco, and A.J. Heeger, Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100(16): p. 9134-9137)에 비해, 본 발명에 따른 검출은 시그널-온(signal-on) 방법일 수 있다. 시그널-오프 방법은 높은 백그라운드 값에서의 신호의 감소를 검출하는 반면, 시그널-온 방법은 낮은 백그라운드 값에서 신호의 증가를 검출한다. 보통, 높은 값에서의 측정은 낮은 값에서의 측정보다 큰 오차를 가지므로, 시그널-온 방법은 보다 안정된 백그라운드 잡음 수준을 갖는다. 또한, 신호 감소에 대한 동적 범위는 시그널-오프 방법에서의 본래의 백그라운드 값에 의해 제한된다. 따라서, 시그널-온 방법은 보다 높은 검출 한도, 낮은 측정 오차를 가질 뿐만 아니라, 상업적 사용에 대해 더욱 편리한데, 이는 시그널-오프 방법에 비해 적은 신호 처리 단계를 갖기 때문이다.
프로브 디자인: 프로브의 생체-인지 부분 및 구속-구조(또는 입체구조적-스위치) 부분이 개별적 또는 통합적으로 디자인될 수 있다. 도 1은 2개의 프로브 디자인 방법을 예시한다. 개별적 디자인 방법(도 1A)에서, DNA 헤어핀 구조가 프로브로 사용되었다. 루프는 표적에 대한 생체-인지 부분이다. 스템은 입체구조적-스위치 부분에 대해 디자인된다. 특정 표적 농도가 검출 한도 아래인 경우, 프로브는 닫힌 구조로 유지되어, 수용체가 매개체와 효과적인 복합체를 형성하는 것을 방지하는 형태적 제한을 발생시킨다. 그러므로, 측정되는 신호 수준이 낮다. 특정 표적과의 결합 후, 헤어핀은 개방되고, 리포터가 자유롭게 되어, 신호를 증폭시키는 매개체와의 효과적인 복합체를 형성하므로, 측정되는 신호 수준이 높다. 통합된 디자인에서, 프로브의 조성물은 프로브 디자인에 필요한 추가 부분 없이 구속 구조 자체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 G-4중(quadruplex) 프로브가 사용될 수 있다(도 1B).
도 2는 다양한 수준의 디자인된 입체구조적 방해의 효과를 도시한다. 여기서, 프로브가 결합되는 전극 표면에 대한 리포터의 근접으로 인해 다양한 수준의 입체구조적 방해를 각각 갖는, 링커(프로브와 기질 사이에 위치됨)를 갖거나 링커를 갖지 않는 2개의 헤어핀 프로브가 비교되었다. 이러한 단계에서, 특정 표적을 이용한 하이브리드화는 전극 표면과 더욱 멀리 떨어진 리포터를 분리시키는 DNA 듀플렉스를 형성하므로, 신호 결과의 감소가 측정된다. 이러한 시그널-오프 방법에서, 상기 신호로 인해 높은 백그라운드 값의 감소가 적고, 검출이 어려움을 주목하라. 링커를 갖는 프로브(보다 적게 디자인된 입체구조적 방해)에 대해서는, 헤어핀이 닫히는 경우에도, 리포터는 표면으로부터 멀리 존재하여, 리포터와 매개체 사이의 복합체가 여전히 형성될 수 있고, 유효하다. 따라서, 표적(IL-8)의 부재와 표적의 존재 사이의 측정된 결과는, "링커를 가짐"으로 라벨링된 좌측의 데이터 세트에 도시된 바와 같이 작다. 헤어핀 프로브로부터 링커를 제거함으로써 입체구조적 방해가 더욱 크도록 디자인되는 경우, 표적이 결합되지 않는 경우 리포터는 표면에 매우 근접하여, 효과적인 매개체-리포터 복합체의 형성을 방지함으로써, 매우 낮은 백그라운드 잡음이 측정된다. 표적과의 하이브리드화 후, 리포터와 표면 사이의 거리는 증가하고, 복합체가 형성되고, 신호를 효과적으로 증폭하는 것이 허용된다. 신호의 변화는 높은 신호 대 잡음 비로 급격하다. 이는 시그널-온 방법이며, 결과는 "링커 없음"으로 라벨링된 우측의 데이터 세트에 제시되어 있다.
본원에 예시된 프로브가 기판의 표면 상에 존재하나, 검출은 용액 중의 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 프로브 디자인의 중요한 혁신은 입체구조적-방해이므로, 입체구조적 방해를 야기하는 모든 유형의 구속이 적용될 수 있다. 예를 들어, 프로브는 나노입자, 자기 비드 또는 거대분자, 예를 들어, 단백질에 결합될 수 있다.
신호 판독: 본 발명은 신호 판독 유형의 다양성을 특징으로 한다. 판독 신호는 상기 예에 예시된 전기적 결과와 같은 하나의 특정 유형의 신호에 제한되지 않고, 증폭 방법에 좌우된다. 증폭이 전자 전달 방법에 관한 것인 경우, 신호는 바람직하게는 전류/전압이다. 증폭이 광학 방법에 관한 경우, 신호는 바람직하게는 형광/UV/IR 등이다. 증폭이 정교한 구조의 변형에 관한 것인 경우, 신호는 바람직하게는 미세한 스펙트럼이다. 또한, 신호는 기계적 데이터일 뿐만 아니라 자기 데이터일 수 있다. 당업자는 제공된 증폭 방법에 기초하여 적합한 검출 방법을 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 신호 판독은 리포터와 매개체 사이에 형성된 복합체에 관한 것이므로, 검출을 위한 표적은 라벨을 갖지 않을 수 있다. 라벨을 갖지 않는 검출은 시약 사용 비용을 감소시킬 뿐만 아니라, 실시간 및 고 처리량의 검출을 가능하게 한다. 이는 마이크로어레이 및 인 시츄(in situ) 검출에서의 자동장치에 적용될 수 있다.
하기 실시예는 예시를 위해 제공되며, 제한하려는 것은 아니다. 당업자는 본질적으로 동일하거나 유사한 결과를 발생시키도록 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 용이하게 인지할 것이다.
실시예 1: 헤어핀 프로브 디자인을 이용한 mRNA 의 저 농도 모니터링
타액에서의 mRNA 생체마커는 타액이 구강 질병, 가능하게는 다른 전신 질병에 대한 진단 유체로 작용할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 타액에서의 특정 mRNA 생체마커의 농도는 펨토(femto) mol/L 미만이다. 또한, 매우 과량의 비특이적 mRNA, rRNA 및 단백질이 공존한다. 중요한 점은 정제 및 증폭 없이 타액 내의 미 량의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 방법이다.
본원에 기재된 것은 구강암에 대한 mRNA 생체마커인 IL8에 대한 전기화학 어레이를 포함한다. 본 발명에 따른 프로브의 사용이 예시된다. 프로브는 헤어핀 구조로 디자인된다. 리포터는 검출 프로브(플루오레세인-그린)이다. 매개체는 항-플루오레세인-HRP 컨쥬게이트이다. 신호 증폭은 HRP 산화환원 방법을 기초로 한다. 신호 판독은 전류이다. F a 는 헤어핀 프로브의 깁스 자유 에너지이다. F b 는 프로브와 표적 사이에 형성된 듀플렉스의 깁스 자유 에너지이다.
링커 없이 헤어핀 프로브를 적용함으로써, IL8의 검출 한도(LOD)는 약 10 fg/mL(약 1 fmol/L)이다(도 3). 선형 프로브에 대해, LOD는 단지 약 100 pg/mL(10 pmol/L)이다. 헤어핀 프로브 검출에 대한 동적 범위는 10 fg/mL 내지 100 ng/mL이다.
신체 유체의 귀감으로서 타액은 신체의 정상 및 질병 상태를 반영하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌[I. D. Mandel, J. Am . Dent . Assoc, 124:85-87 (1993); I. D. Mandel. J Oral Pathol . Med ., 19:119-125 (1990); D. T. Wong, J. Am. Dent . Assoc, 137:313-321 (2006)]을 참조하라. 최근, 웡(Wong)의 그룹은 여러 타액 mRNA가 구강암 환자로부터의 타액에서 시종 일관 상승되었음이 관찰되었다. 문헌[D. T. Wong, J. Am . Dent . Assoc, 137:313-321 (2006)]을 참조하라. 이러한 mRNA에서, 조합물 중 4개(OAZ-1, SAT, IL8 및 IL1-β)는 구강암 환자의 타액을 대조군 피검체의 타액과 구별하는 생체마커로 제공될 수 있다. 문헌[Y. Li et al., Clin . Cancer Res ., 10:8442-8450 (2004)]을 참조하라. mRNA 생체마커의 확인은 타액을 가치있는 진단 유체로 만든다. 문헌[S. Hahn et al., Bioelectrochemistry, 67: 151-154 (2005)]을 참조하라. 그러나, 지금까지, 추출되지 않은 타액에서의 직접적인 RNA 검출을 위한 일치하고 확실한 기술이 없다. 다른 유체, 예를 들어, 혈액 및 뇨 기반의 검출과 비교하여, 타액 기반 진단은 환자에 대해 덜 위험하면서 현재의 방법에 비해 보다 접근가능하고, 정확하고, 저렴하다.
진단 유체로서 타액의 주요 우려사항은 생체마커가 일반적으로 혈청에서보다 타액에 적은 양으로 존재한다는 점이다. 타액 생체마커의 저 농도 및 타액의 복잡성으로 인해, 통상적인 검출 방법은 높은 신호 대 잡음 비에 대한 임상 진단 필요조건을 충족할 수 없다.
신호 증폭을 수득하기 위한 여러 기술이 개발되었고, 이는 민감도를 증가시키는 것을 돕는다. 대부분의 검출 방법에서, 신호 강도는 전체 샘플 부피에 비해 보통 매우 작은 검출 영역 내의 표적의 수와 관계가 있다. 그러므로, 전체 샘플 부피 내의 표적의 양을 증가시키거나 작은 검출 영역으로 표적을 축적시키는 것이 높은 신호 강도를 보장하기 위해 적용된다. 첫번째 방법은 표적, 프로브 및/또는 신호의 전체 수를 증가시켜, 이에 따라 높은 강도의 측정 결과를 발생시킨다. 예를 들어, PCR, 프라임드 인 시츄 라벨링(Primed in situ labeling, PRINS) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 기술이 표적의 전체 양을 증가시키기 위해 적용된다. 문헌[p. T. Monis and S. \Giglio, Infect . Genet . Evol ., 6:2-12 (2006)]을 참조하 라. 리가아제 연쇄 반응(LCR) 및 롤링 써클 증폭(rolling circle amplification, RCA)은 프로브를 증폭시킨다. 문헌[p. T. Monis and S. Giglio, Infect . Genet . Evol., 6:2-12 (2006)]을 참조하라. 브랜치드 DNA(bDNA) 및 티라미드(tyramide) 신호 증폭(TSA)은 신호 증폭을 발생시킨다. 문헌[S. C. Andras et al., Mol . Biotechnol., 19:29-44 (2001)]을 참조하라. 표적/프로브/신호의 직접적인 증폭과 비교하여, 두번째 방법은 표적의 보다 많은 카피를 발생시키는 것 대신 표적의 국소 농도를 증가시키는데 초점을 둔다. 예를 들어, 나노기술은 나노입자 기반의 기술을 적용함으로써 검출 영역으로 샘플 내의 표적의 소수의 카피를 농축시킬 수 있다. 문헌[A. N. Shipway and I. Willner, Chem . Commun ., pp. 2035-2045 (2001); A. Merkoci, Febs J., 274:310-316 (2007); J. Wang, Anal . Chim . Acta, 500:247-257 (2003); S. G. Penn et al., Curr . Opin . Chem . Biol ., 7:609-615 (2003)]을 참조하라. 표적의 전체량 및 국소 농도의 증가는 높은 민감도를 발생시킨다. 그러나, 이는 또한 특이적 및 비특이적 신호 둘 모두가 증폭될 수 있으므로 높은 백그라운드 수준 및 보다 많은 위-양성 결과를 발생시킬 것이다.
다른 한편으로, 백그라운드 잡음 수준을 감소시키기 위해 경쟁 기반의 검출이 디자인되었다. 검출 프로브는 항상 여러 준안정(quasi-stable) 상태를 갖고, 여기서 각각의 상태는 다양한 수준의 신호 강도를 나타낸다. 문헌[N. L. Goddard et al., Phys. Rev. Lett, 85:2400-2403 (2000); C. H. Fan et al., P Natl Acad Sci USA, 100:9134-9137 (2003); S. Tyagi and F. R. Kramer, Nat . Biotechnol., 14:303-308 (1996); F. Wei et al., Biosens . Bwelectron., 18: 1149-1155 (2003); F. Wei et al., J Am . Chem . Soc, 127:5306-5307 (2005)]을 참조하라. 상보성 표적과 비상보적 표적 사이의 경쟁은 프로브를 상기 상태 사이로 전환시키고, 따라서 다양한 수준의 신호로 제공된다. 전환 과정은 분자내 또는 분자간 경쟁에 의해 달성될 수 있다. 분자내 전환을 위해, 분자 비콘 및 구속 구조를 갖는 다른 프로브와 같은 2개 이상의 준안정 형태를 갖는 일반적으로 높은 특이성의 프로브가 적용된다. 문헌[C. H. Fan et al., P Natl Acad Sci USA, 100:9134-9137 (2003), S. Tyagi and F. R. Kramer, Nat . Biotechnol ., 14:303-308 (1996), F. Wei et al., J. Am . Chem . Soc ., 127:5306-5307 (2005); Y. Xiao et al., P Natl Acad Sci USA, 103:16677-16680 (2006); A. A. Lubin et al., Anal . Chem., 78:5671-5677 (2006); N. E. Broude, Trends Biotechnol ., 20:249-256 (2002)]을 참조하라. 특정 표적에 대한 결합은 프로브의 형태 변화를 야기할 것이다. 통상적으로, 형태 변화는 FRET, 중격 염료 및 전기화학과 같이 거리에 민감한 신호 수준에 영향을 미칠 것이다. 문헌[T. J. Huang et al., Nucleic Acids Research, vol. 30 (2002); V. Gau et al., Methods, 37:73-83 (2005)]을 참조하라. 비특이적 표적은 신호 변화를 발생시키지 않고, 백그라운드 수준은 낮다. 그러나, 특이성을 개선시킴으로써, 이러한 프로브는 검출 한도를 개선시키는데, 이는 측정가능한 신호에 대해 대량의 표적이 필요하며, 이에 따라 검출 시스템에 보다 많은 위-음성 결과를 도입시키기 때문이다.
형태 변화와 관련된 이전의 검출과 관련하여, 표적 인지(특이성) 및 신호 증폭(민감도)은 2개의 비-관련 단계이다. 문헌[C. H. Fan et al., P Natl Acad Sci USA, 100:9134-9137 (2003); S. Tyagi and F. R. Kramer, Nat . Biotechnol ., 14:303-308 (1996); F. Wei et al., J. Am . Chem . Soc ., 127:5306-5307 (2005)]을 참조하라. 본원에 기재된 바와 같이, 선택적 증폭을 가능케 하는 신규한 헤어핀 프로브 디자인에 의해 높은 민감도 및 높은 특이성이 동시에 달성된다. 이러한 헤어핀 프로브는 신호 보고 과정을 활성화시키는 구속-구조 성분과 함께 통합된, 표적에 매우 특이적인 생체-인지 성분을 포함한다. 생체-인지 성분이 표적의 특이성을 확인한 후에만, 구속-구조 성분이 빌트-인(built-in) 입체구조적 방해를 제거하여, 신호 증폭이 발생 되도록 하고, 이는 높은 민감도를 발생시킨다. 특이적 표적 결합이 없는 경우, 입체구조적 방해는 신호 증폭을 억제한다. 따라서, 대량의 간섭제(interferent)와의 혼합물 중에 낮은 카피 수로 존재하는 경우에도, 특정 표적만을 이용하여 측정가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 이러한 선택 증폭 방법은 비특이적 결합 및 백그라운드 수준을 크게 억제하고, 이는 임의의 현장검사 검출 시스템의 수행에서 2개의 중요한 장애물을 극복한다.
재료
모든 시약(표 1)은 구입하여 사용되거나, 임의의 전처리 없이 완충 용액으로 희석된다.
표 1 : 전기화학 RNA 검출을 위한 재료
Figure 112009082067668-PCT00001
사용된 전기화학 센서는 16-유닛의 금 어레이(gold array)였다. 문헌[V. Gau et al., Methods, 37:73-83 (2005)]을 참조하라. 전극의 어레이는 다양한 샘플의 동시적인 다중 검출을 가능케 한다. 각각의 유닛에 대해, 작업 전극(working electrode, WE), 상대 전극(counter electrode, CE) 및 기준 전극(reference electrode, RE)을 포함하는 3개 전극의 구성이 존재한다. 작은 전극 배열의 장점으로서, 16개의 전극의 신호 판독이 동시에 수득될 수 있고, 단지 4 μL의 샘플 용액이 검출에 필요하다. 본원에 예시된 바와 같이, 전기화학 신호는 보고 효소인 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)의 산환환원 과정에 의해 생성된 전류이다. HRP와 H2O2 사이의 반응 후, HRP는 산화 상태로 변환된다. 이후, TMB는 전류 신호를 증폭시키는 2-전자 단계를 통해 환원된 HRP를 계속 재생시킨다.
검출 프로토콜
금 전기화학 센서의 표면 변형은 하기와 같은 3단계를 포함한다 (V. Gau et al., Methods, 37:73-83 (2005); J. J. Gau et al., Biosens . Bioelectron ., 16:745-755 (2001):
프로브 고정: 금 전극을 카르복실기로 종결된 자가 어셈블리된 단층으로 예비 코팅시켰다. 금 표면을 10분 동안 4μL의 50% EDC 및 50% NHS에 의해 활성화시켰다. 이후, 센서를 탈이온수(DI water)(18.3 MΩ·cm)으로 헹구고, 초순수 질소 가스로 건조시켰다. 이후, 4μL의 5mg/mL Ez-비오틴을 금 표면에 로딩시킨 후, 탈이온수로 헹구고, 질소 가스로 건조시켰다. 이후, 2.5% BSA를 함유하는 PBS 완충액 중의 0.5 mg/mL 스트렙타비딘을 10분 동안 전극 상에서 인큐베이션하여, 최종적으로 스트렙타비딘 코팅된 전극을 달성하였다. 이후, 4 μL의 Tris-HCl 완충액 중의 비오티닐화 및 플루오레세인 이중 라벨링된 헤어핀 프로브(HP)를 표면 상의 스트렙타비딘과 프로브 상의 비오틴 라벨 사이의 상호작용을 통해 30분 동안 전극 상에 고정시켰다. 과량의 HP를 탈이온수로 세척하여 제거하고 질소 가스로 건조시켰다.
표적 하이브리드화: 표면을 30분 동안 10 mM MgCl2를 함유하는 6xSSC 완충액 중에서 제조되는 표적 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 하이브리드화 후, 전극을 D탈이온수로 세척하고, 질소 가스로 건조시켰다.
신호 판독: 전류는 표적의 표면 농도에 비례한다. 문헌[V. Gau et al., Methods, 37:73-83 (2005)]을 참조하라. 첫번째로, 0.5% 카세인 차단제 용액 중의 0.5 mU/mL 항-플루오레세인-HRP를 HP 상의 플루오레세인 라벨과 결합시켰다. 탈이온수로 헹구고, 질소 가스로 건조시킨 후, TMB/H2O2 기질을 첨가하였다. 각각의 전극 유닛에 -200 mV 포텐셜을 적용한 후, 60s의 평형 후의 병렬 신호 판독에 의해 전류측정 검출을 수행하였다.
전기화학 신호는 보고 효소인 호스라디쉬 퍼옥시다아제(HRP)의 산화환원 과정에 의해 생성된 전류이다. HRP와 H2O2 사이의 반응 후, HRP는 산화 상태로 전환된다. 이후, TMB는 전류 신호를 증폭시키는 2-전자 단계를 통해 환원된 HRP를 계속 재생시킨다. 첫번째로, 0.5% 카세인 차단제 용액 중의 0.5 mU/mL 항-플루오레세인-HRP를 HP 상의 플루오레세인 라벨과 결합시켰다. 탈이온수로 헹군 후, TMB/H2O2를 첨가하였다. 각각의 전극 유닛에 -200 mV 포텐셜을 적용한 후, 60s의 평형 후의 동시 신호 판독에 의해 전류측정 검출을 수행하였다. 전류는 표적의 표면 농도에 비례한다. 문헌[V. Gau et al, Methods, 37:73-83 (2005)]을 참조하라.
올리고누클레오티드 프로브 및 RNA 샘플 제조
올리고누클레오티드를 오페론(Operon)(Alabama, USA)사에서 구입하였다. 모든 헤어핀 프로브는 한쪽 말단에 비오틴으로 라벨링되고, 다른 말단에 비오틴TEG로 라벨링된다. 비오틴 라벨은 앵커로서 스트렙타비딘에 결합할 수 있고, 플루오레세인 라벨은 신호 리포터이다. 오페론사에 의해 제공된 비오틴TEG는 비오틴 및 올리고 사슬을 연결시키는 여분의 16-원자의 스페이서(spacer)를 갖는다. 이러한 간격을 둔 디자인은 비오틴에 스트렙타비딘에 대한 우수한 접근성을 제공한다.
검출을 위해 2개의 mRNA 표적을 선택하였다. 인터루킨 8(IL8)은 구강암에 대한 타액 생체마커이다. IL8의 농도는 건강한 사람에 대해 2 fM이고, 구강암 샘플에서 약 16 fM으로 증가한다. 문헌[Y. Li et al., Clin . Cancer Res ., 10:8442-8450 (2004)]을 참조하라. 타액 샘플에서 RNA 수준을 표준화시키기 위해, 구강암과 관련되지 않는 것으로 보이는 기준 유전자 S100 칼슘 결합 단백질 A8(S100A8)을 사용하였다. 타액 검출을 위해, S100A8을 각각의 전기화학 센서 상의 기준 대조군으로 사용한다.
시험관내 전사(IVT) RNA가 당 분야에 공지된 방법에 따라 제조된다. 문헌[H. Ohyama et al., Biotechniques, 29:530-+ (2000)]을 참조하라. 요컨대, 프라이머로서 T7-올리고-(dT)24를 이용한 역전사를 c-DNA의 첫번째 가닥을 합성하기 위해 수행하였다. T7 RNA 중합효소(Ambion Inc., Austin, TX, USA)를 이용하여 시험관내 전사를 수행하였다. 1 μL의 세포 RNA를 역전사시켜 cDNA를 제조하고, 1μl의 cDNA를 T7 서열을 이용한 PCR 사용 프라이머에 대한 주형으로 사용하였다. cRNA의 양 및 품질을 분광법(NanoDrop Tech., Delaware, USA)에 의해 결정하였다. IVT RNA 샘플을 분취하고, 사용 전에 -20℃에 보관하였다. 타액의 민감도 및 특이성의 평가를 위해, IVT RNA를 타액으로 스파이킹(spiking)시켰다.
결과 및 논의
핵산의 통상적인 샌드위치 검출에서, 올리고누클레오티드 프로브는 선형이다. 따라서, 임의의 매개체 결합과 독립적으로 비특이적 및 특이적 표적 둘 모두는 백그라운드를 증가시키고, 위-양성 결과를 야기한다. 특이성을 증가시키기 위해, 헤어핀 구조에 입체구조적 방해 효과를 도입시켰다. 도 4를 참조하라. 헤어핀 프로브는 이의 개방 또는 비개방(open-or-not)된 두 상태의 구조를 특징으로 한다. 표적이 결합되지 않는 경우, 헤어핀 프로브는 닫힌 상태로 유지되며, 따라서 리포터는 디자인된 입체구조적 방해로 인해 매개체와 효과적인 복합체를 형성할 수 없다. 특정 표적과의 결합 후, 프로브는 개방 상태로 전환되고, 리포터는 매개체와 효과적인 복합체를 형성하여, 신호 증폭을 발생시킨다. 입체구조적 방해 디자인은 실험을 수행하기 위한 노력이 증가할 임의의 추가적인 화학적 반응 단계가 없어 간단하고 효과적이다. 이 작업의 신호 판독은 오직 리포터와 매개체 사이에 형성된 복합체와 관련되기 때문에, 검출을 위한 표적은 라벨을 갖지 않는다. 라벨을 갖지 않는 검출은 시약 사용 비용을 감소 시킬 뿐만 아니라, 실시간으로 높은 처리량의 검출을 가능하게 한다. 이것은 마이크로어레이와 자동적인 현장검출에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 HRP/TMB 신호 증폭을 억제하는 표면 입체구조적 방해에 기초한다. 그러므로, 표면과 리포터 사이의 거리는 인지과정에 중요한 요소가 될 것이다. 이러한 단계에서, 특정 표적을 이용한 하이브리드화는 전극 표면으로부터 리포터를 더욱 멀리 분리하는 DNA 듀플렉스를 형성하고, 그러므로 신호 결 과의 감소가 측정된다. 용액 속에 표면으로부터 온 리포터 때문에 표면 제한은 감소할 수 있고 그러므로 전류 신호는 증가할 것이다.
또한, 보통 시그널-오프 방법인 통상적인 형태 기반 검출에 비해, 본 발명에 따른 검출은 시그널-온 방법일 수 있다. 시그널-오프 방법은 높은 백그라운드 값에서의 신호의 감소를 검출하는 반면, 시그널-온 방법은 낮은 백그라운드 값에서의 신호 증가를 검출한다. 보통 높은 값에서의 측정은 낮은 값에서의 측정보다 큰 오차를 가지므로, 시그널-온 방법은 보다 안정된 백그라운드 잡음 수준을 가진다. 또한, 신호 감소에 대한 동적 범위는 시그널-오프 방법에서의 본래의 백그라운드 값에 의해 제한된다. 따라서, 시그널-온 방법은 보다 높은 검출 한도, 낮은 측정 오차를 가진 뿐만 아니라, 상업적 사용에 대해 더욱 편리한데, 이는 시그널-오프 방법에 비해 적은 신호 처리 단계를 갖기 때문이다.
헤어핀 프로브 효과의 입체구조적 방해의 개념
특이적 신호 증폭은 HRP와 TMB/H2O2 그리고 헤어핀 프로브 디자인에 의한 신호의 선택에 의한 샌드위치 유사 신호 증폭의 조합물을 통해 수행된다. 본 발명 방법의 기초적인 아이디어는 HRP/TMB가 표적 없는(target-free) 프로브에 결합하는 것을 억제하는 표면의 입체구조적 방해이다. 따라서, 표면과 리포터 사이의 거리는 인지 과정의 중요한 요소가 될 것이다. 용액 속에 표면으로부터 온 리포터 때문에 표면 제한은 감소할 수 있고 그러므로 전류 신호는 증가할 것이다. 입체구조적 방해 없이, 특정 표적을 이용한 하이브리드화는 전극 표면으로부터 리포터를 더욱 멀리 분리하는 DNA 듀플렉스를 형성하고, 그러므로 신호 결과의 감소가 측정된 다.
프로브가 결합되어 있는 전극 표면에 대한 리포터의 접근 때문에 각각 다른 입체구조적 방해 수준을 갖는 링커를 이용하고 이용하지 않는 4개의 헤어핀 프로브가 비교되고 있다 (표 2). 링커의 길이는 TEG 및/또는 말단이 5-비오틴으로 라벨링 된 오버행 스페이서(overhang spacer)에 의해 조정된다. 오버행 스페이서는 9 티미딘이다(9T). 비오틴TEG의 세로 길이는 MM2 계산에 의하면 대략 3 nm이다. 문헌 [N. L. Allinger, J. Am. Chem. Soc, 99:8127-8134 (1977)]을 참조하라. 링커에 대해, 이무런 힘이 적용되지 않았을 때 통상의 단일 가닥 DNA는 전극에서 코일 상태이다. 코일 가닥은 네거티브 포텐셜과 같은 특이적 힘 아래에서는 직선으로 뻗을 것이다. 전기 화학적 검출은 -200 mV 하에서 수행되기 때문에, 9T 링커는 굽거나 누운 구조를 가진 것보다 더욱 긴 길이로 펴진다. 문헌 [A. M. van Oijen et al., Science, 301: 1235-1238 (2003); U. Rant et al., Bwphys. J., 90:3666-3671 (2006)]을 참조하라. 비록 9T 링커의 실제 길이는 정확하지 않지만, 만일 9 bp × 0.28 nm/bp 정도의 듀플렉스 DNA 에서 데이터가 수행되었다면 네거티브 포텐셜하에서 3nm 보다 더 길 것이다. HRP의 크기는 결정 정보에 따르면 대락 4x6.7x11.8 nm 이다. 문헌 [G. I. Berglund et al., Nature, 417:463-468 (2002)]을 참조하라.
표 2. 다른 링커 길이를 이용한 IL -8 헤어핀 프로브의 올리고누클레오티드 서열
Figure 112009082067668-PCT00002
도 6은 입체구조적 방해가 다른 정도로 디자인 됨에 따른 영향을 도시한다. 가장 긴 링커를 이용한 TEG+9T 프로브(가장 적은 입체구조적 방해)는, 헤어핀이 닫힐 때에도, 리포터는 표면으로부터 멀리 있어 리포터와 매개체의 복합체를 형성할 수 있고, 그것은 매우 효과적이다. 따라서 "HP L3"로 라벨링된 데이터 세트에서 도시된 바와 같이, 표적이 없는 것과 표적 (IL-8) 에 결합한 것 사이에 측정된 결과가 작다. 헤어핀 프로브로부터 링커를 제거함으로써 입체구조적 방해가 더욱 크도록 디자인되는 경우, 리포터는 표적이 결합되지 않았을 때 표면에 매우 근접하여, 효과적인 매개체-리포터 복합체의 형성을 방지함으로써, 매우 낮은 백그라운드 잡음이 측정된다. 표적과의 하이브리드화 후, 리포터와 표면 사이의 거리가 증가하고 복합체가 형성될 수 있으며 신호가 효과적으로 재생된다. 신호의 변화는 높은 신호 대 잡음의 비로 극적이다.
2 표적을 사용한 헤어핀 프로브의 특이성을 실험하였다. 도 5를 참조하라. 각각의 프로브별로, 상보적 및 비상보적 RNA 표적 간의 비교를 실행하였다. 비상 보적 표적은 블랭크 신호보다 단지 2배의 높은 표준편자(SDV)의 신호를 보낸다. 상보적 표적의 신호는 블랭크의 신호보다 20 표준편차(SDV)가 높다. 두 프로브는 IL-8에서는 5nM 그리고 S100A8에서는 7nM의 RNA 수준에서 우수한 식별력을 보인다.
하이브리드화의 효율성에 따른 SNR 의 조절
RNA 센서의 주요 관심은 신호 대 잡음의 비(SNR)이다. 본 발명의 헤어핀 프로브에서, SNR은 헤어핀 프로브의 개방 대 비개방의 비에 의해 결정된다. 높은 SNR은 표적과 하이브리드화 한 후의 전체 개방 상태 그리고 표적이 결합하지 않은 경우 우수한 비개방 상태에 의해 이루어 질 수 있다. 인지 동안의 이 비개방 또는 개방 상태는 분자내 및 분자간 모두의 하이브리드화에 대해 높은 효율을 필요로 한다.
하이브리드화의 효율성을 높이고, 본 발명의 프로브의 SNR을 최적화 시키기 위해, 헤어핀 구조는 스템(stem) 길이와 루프(loop) 길이의 변화에 의해 조절된다. 다른 스템-루프 길이를 가진 3 헤어핀 프로브가 연구되고 있다(서열은 도7의 아래부분에 나열되어 있다). 모든 3 프로브는 루프 부분과 함께, 표적 RNA와 상보적인 3-말단 스템 부분을 가진다. 도 7에서 보여진 결과로부터, 가장 긴 스템과 듀플렉스를 가진 프로브는 블랭크 샘플에서 가장 낮은 신호를 가지고 표적 샘플에서 가장 높은 신호를 가진다. 이 결과는 표적이 없을 때 더욱 비개방 상태, 그리고 표적과 하이브리드화 되었을 때 더욱 개방 상태인 것이 높은 SNR을 나타낸다는 것을 보인다. 짧은 스템과 듀플렉스를 가진 프로브는 낮은 백그라운드와 높은 신호를 가지지 않는다. 그러므로 헤어핀 프로브를 이용한 높은 SNR을 얻는 것은 편리한데, 이 는 높은 하이브리드화 효율성은 간단히 민감성 및 특이성에 이익이 되기 때문이다. 반면에, 통상적인 선형 프로브를 가진 최적화된 프로브 서열을 찾는 것은 어렵다. 긴 서열은 하이브리드화 효율성에 도움이 되나, 높은 백그라운드를 생성하고, 이것은 민감도-특이성 문제의 충돌 효과로 귀착된다.
헤어핀 프로브를 이용한 타액 RNA 검출과 선형 프로브 : 스파이킹 된 것과 스 파이킹 되지 않은 샘플
헤어핀 프로브를 갖는 것은 타액 RNA 생체 마커를 일정하게 검출할 수 있다. 도 8은 전류 신호의 농도의 관계를 도시한다. IL-8 와 S100A8 모두 헤어핀 프로브에서는 좋은 SNR을 나타내나 선형 프로브에서는 좋지 않은 SNR을 나타낸다. 신호 강도는 농도에 대해 선형이 아니고 농도의 로그에 대해서도 선형이 아니라는 점이 흥미롭다. 이 현상은 보통 복잡한 표면 화학에서 발생 된다. 본 발명에는 전체 반응의 한 복합체로의 통합되는 여러가지 반응들이 있는데 이는 헤어핀 프로브의 변환, 하이브리드화, 단백질 인지 그리고 효소적 전기 화학을 포함한다. 이것은 간단히 표적 농도의 선형 관계로 묘사될 수 없다. IL8의 검출 한도(LOD)는 약 1 fmol/L 이다. 선형 프로브에서, LOD는 단지 약 10 pmol/L 이다. S100A8의 LOD는 헤어핀 프로브에서 약 1 fmol/L 이고, 선형 프로브에서 10 pmol/L 이다.
타액 RNA 생체마커는 스파이킹 된 타액에서 헤어핀 프로브와 함께 검출된다. 도 9에 데이터가 도시되어 있다. 다른 농도에서의 RNA 샘플은 전체 타액 속에 스파이킹 되었다. 정제된 IVT RNA 샘플과 유사한, 스파이킹 된 타액 또한 낮은 LOD를 가진다. 이것은 헤어핀 프로브가 특정 표적 RNA와 타액 속에 많은 양의 간섭물 질을 구별 지을 수 있다는 것을 보여준다. LOD 는 약 1 fM이고 이것은 진정한 IL-8 타액 진단의 장비를 만족 시킬 수 있다.
도 8에서의 정제한 RNA 샘플 결과와 비교하여, 타액 샘플에서 명백한 신호 증가, 특히 백그라운드 수준이 관찰 되었다. 스파이킹된 샘플의 음성 대조군의 전류가 IVT RNA의 그것보다 훨씬 높다. 정제한 RNA의 안정한 신호 수준과 비교하여,그것의 신호 수준은 또한 심지어 같은 사람에서 온 다른 타액 샘플에 의해서도 변한다는 것이 관찰되었다. 음성 대조군의 전류는 수백의 nA에서 수천의 nA에 이르기까지 다양하다. 신호 증가에 대한 가능한 이유는 높은 점도를 가진 뮤신과 같은 타액 속의 표적 RNA 이외의 구성요소들의 방해이고, 이것은 하기 HRP의 비특이적 결합 또는 강한 특이적 결합을 초래한다. 문헌 [N. J. Park et al., Clin. Chem., 52:988-994 (2006)]을 참조하라. 타액 속에 있는 이 간섭물질 구성요소들의 농도가 샘플 속에서 변하기 때문에, 따라서 전류 강도도 변한다. 그러므로 몇몇 구체예에서, RNA 검출은 다른 간섭물질을 제거하기 위해 용해와 조합된다.
1. 헤어핀 프로브를 이용한 고 신호 대 잡음 비의 개념
본 발명에서, 고 신호 대 잡음 비는 샌드위치 유사 검출과 헤어핀 프로브의 조합에서 온다. 샌드위치 유사 검출의 개념은 신호를 증폭하는 HRP를 재생성하는 목적으로 복합체를 형성하기 위한 매개체의 적용이다. 첫째로, 표적이 프로브와 결합한다. 그리고 검출 전에, 프로브로 라벨링된 리포터(플루오레세인)와 매개체(안티-플루오레세인-HRP)사이에 복합체가 형성된다. 과량의 매개체는 세척에 의해 제거되고, TMB/H2O2 물질은 신호를 증폭하는 HRP를 재생성하기 위해 추가된다. 문헌 [V. Gau et al., Methods, 37:73-(2005); J. C. Liao et al., J. Clin . Microbiol, 44:561-570 (2006)]을 참고하라. 신호 수준은 복합체의 양과 활동성 모두에 의해 결정된다. 금속 전극과 복합체 사이의 강한 상호작용 때문에, 표면은 리포터의 활동성에 대한 억제자 뿐만 아니라 복합체 형성의 제한자로서 역할을 할 수 있다, 신호를 증폭할 수 있는 이 복합체는 효과적인 복합체("effective complex")라고 언급된다. 오직 이 효과적인 복합체가 증폭된 신호를 생성한다.
핵산의 통상적인 샌드위치 검출에서, 2 선형 올리고누클레오티드 프로브가 사용된다 : 한가지는 표적을 표면에 고정시키는 캡쳐 프로브(capture probe)이고, 다른 하나는 리포터와 함께 신호를 생성하는 디텍터 프로브(detector probe)이다. 문헌 [V. Gau et al., Methods, 37:73-83 (2005); E. Palecek et al., Anal. Chim. Acta, 469:73-83 (2002); H. Xie et al., Anal. Chem., 76: 1611-1617 (2004)]을 참고하라. 그러므로 비특이적 특이적 표적 모두, 어떤 매개체 결합과 관계없이, 백그라운드를 증가시키고, 거짓 양성 결과를 야기할 것이다. 특이성을 증가시키기 위하여, 입체구조적 방해 효과가 헤어핀 구조에 도입되었다. 헤어핀 프로브는 그것의 개방 또는 비개방의 두 상태 구조를 가지는 특징이 있다. 표적이 결합하지 않은 때, 헤어핀 프로브는 비개방 상태로 머무르며 따라서 디자인된 입체 구조적 방해 때문에 리포터는 매개체와 효과적인 복합체를 형성하지 못한다. 특이적 표적과 결합한 후에는 프로브는 개방 상태로 전환하고 리포터는 매개체와 효과 적인 복합체를 형성하고 그 결과 신호가 증폭된다. 입체구조적 방해 디자인은 간단하고 효과적이며, 실험을 수행하는 수고를 감소시키는 최초의 두 프로브 디자인으로부터 화학적 반응 단계를 제거하였다. 이 작업의 신호 판독은 오직 리포터와 매개체 사이에 형성된 복합체와 관련되기 때문에, 검출을 위한 표적은 라벨을 갖지 않는다. 라벨을 갖지 않는 검출은 시약 사용 비용을 감소시킬 뿐 만 아니라, 실시간 그리고 고 처리량 검출을 가능하게 한다. 이것은 마이크로어레이와 자동적인 현장검출에 적용될 수 있다.
2. 헤어핀 프로브 디자인에 대한 원칙
헤어핀 프로브 검출의 기본적인 아이디어는 명확하게 신호를 증폭시킬 수 있는 입체구조적 방해 디자인이다. 디자인의 3 원칙이 있다: 1. 안정한 헤어핀 구조는 안정한 스템 부분, 즉 헤어핀에 대한 긴 스템(N. L. Goddard et al, Phys. Rev. Lett, 85:2400-2403 (2000))에 의해 만족 될 수 있다; 2. 고 하이브리드화 효율성은 안정한 듀플렉스 부분 즉, 하이브리드화를 위한 긴 서열(N. L. Goddard et al., Phys. Rev. Lett., 85:2400-2403 (2000))에 의해 만족 될 수 있다.; 3. 리포터의 고 입체구조적 방해 효과는 링커 길이의 변화 또는 표면 효과를 증가시키기 위해 더 큰 매개체를 도입함으로써 얻어질 수 있다. 헤어핀 프로브 구조가 변화함으로써, 최적화된 입체구조적 방해 효과에 의해 고 SNR 이 얻어질 수 있다.
헤어핀 프로브 디자인 외에도, 표면 입체구조적 방해를 증가시키는 두개의 다른 방법이 있다. 한가지는 프로브의 표면 밀도이다. 밀집하여 채워진 헤어핀 프로브는 드문드문 채워진 프로브보다 높은 군집 효과(crowding effect)를 가진다. 그것은 HRP의 결합과 HRP의 활동성 모두의 제한을 증가시킨다. 그러나 표적의 하이브리드화 역시 프로브의 높은 표면 농도 아래에서 억제될 것이다. 올리고누클레오티드의 드문드문한 분포는 높은 하이브리드화 효율성을 제공한다. 최상의 하이브리드화를 얻기 위해 각각의 프로브 및 표면에 대한 표면 적용범위가 최적화되어야 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 1×10- 6내지 1×1O-7 M의 헤어핀 브로브의 고정 농도가 좋은 결과를 발생시킨다.
또 다른 요소는 전극에 적용되는 전위(electric potential)이다. 올리고누클레오티드는 강한 음전하이기 때문에, 포지티브 포텐셜은 하이브리드화를 향상시키고 가닥에 전극의 인력을 증가시킨다. 네거티브 포텐셜은 듀플렉스가 열리도록 하고, 가닥이 표면으로부터 떨어지도록 한다. 올리고누클레오티드는 네거티브 포텐셜하에서는 용액 속에서 곧게 뻗어 있는 반면, 강한 포지티브 포텐셜하에서는 전극에 놓일 것이다. 문헌 [U. Rant et al., Biophys. J., 90:3666-3671 (2006)]을 참고하라. 프로브가 포지티브 포텐셜하에서 전극에 놓일 경우, 프로브에 대한 비개방 그리고 개방 상태의 표면 입체구조적 방해는 거의 같을 것이다. 따라서 보완적인 표적 결합으로 차이점이 없다. 문헌 [R. G. Sosnowski, P Natl Acad Sa USA, 94: 1119-1123 (1997)]을 참고하라. 그러므로 이 관점에서 네거티브 포텐셜이 채택되어졌다. 그러나, 약간의 포지티브 포텐셜은 비개방 상태에서 결합되지 않은 헤어핀 프로브를 유지하고 표적과 함께 듀플렉스를 안정화 시킬 것이다. 이것은 높은 신호 대 잡음 비를 달성하는데 도움이 된다(데이터는 도시하지 않음). 한 편, 네거티브 포텐셜은 염기쌍의 상호작용을 파괴할 것이다. 지나치게 높은 네거티브 포텐셜이 적용된다면, 헤어핀 프로브는 표적이 결합하지 않은 때에도 개방 될 것이다. 문헌 [F. Wei et al., Langmmr, 22:6280-6285 (2006)]을 참조하라. 전류법 검출을 위한 최상의 전위는 매우 중요하고 헤어핀 프로브의 서열 구성에 대단히 민감하다. 문헌 [F. Wei et al., Langmmr, 22:6280-6285 (2006)]을 참고하라. 본원에 기재된 바와 같이, 네거티브 포텐셜(-200 mV)하에서의 검출은 좋은 SNR을 제공한다. 당업자는 주어진 응용에서 전위를 쉽게 최적화할 것이다.
3. 신호대 잡음 비에 대한 고찰
보통 시그널-오프 방법인 통상적인 형태 기반 검출에 비해, 본 발명에 따른 검출은 시그널-온 방법이다. 문헌 [C. H. Fan et al., P Natl Acad Sa USA, 100:9134-9137 (2003)]을 참고하라. 시그널-오프 방법은 높은 백그라운드 값에서의 신호의 감소를 검출하는 반면, 시그널-온 방법은 낮은 백그라운드 값에서 신호의 증가를 검출한다. 보통, 높은 값에서의 측정은 낮은 값에서의 측정보다 큰 오차를 가지므로, 시그널-온 방법은 보다 안정된 백그라운드 잡음 수준을 갖는다. 또한, 신호 감소에 대한 동적 범위는 시그널-오프 방법에서의 본래의 백그라운드 값에 의해 제한된다. 따라서, 시그널-온 방법은 보다 높은 검출 한도, 낮은 측정 오차를 가질 뿐만 아니라, 상업적 사용에 대해 더욱 편리한데, 이는 시그널-오프 방법에 비해 적은 신호 처리 단계를 갖기 때문이다.
실시예 2: 헤어핀 프로브 ( HP )를 이용한 타액 mRNA 의 전기 화학적 검출
이 프로브는 입체구조적 방해 (SH)가 비특이적 신호를 억제하고 표적 검출을 위해 시그널-온 증폭 과정을 생성하도록 하는 원리에 기초하여 디자인되었다. 스템-루프 구성은 프로브의 끝의 리포터를 표면과 아주 근접하도록 하고 매개체와 결합하는 것이 불가능하도록 만든다. 표적 결합은 프로브의 헤어핀 구조를 개방하고, 매개체는 접근가능한 리포터와 결합할 수 있다. 양고추냉이과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP))는 전기 화학적 신호를 발생시키는데 이용된다. 시그널-온 방법은 낮은 기저 신호, 강한 긍정적인 판독, 큰 동적범위가 특징이다. SH는 헤어핀 디자인과 전기장을 통해서 조절된다. 헤어핀 프로브에 전기장 조절을 적용함으로써, RNA 검출 제한은 약 0.4 fM이고 이것은 통상적인 선형 프로브보다 10000 배 더 민감하다. 내생적 IL-8 mRNA는 HP와 함께 검출되어 지고, qPCR 기술과의 좋은 상호작용으로 얻어진다. 협력 과정은 간단한 장비가 가능하게 하고, 단계의 수를 줄임으로써, 타액과 같은 복잡한 체액으로부터 특정 핵산 서열의 현장검사 검출에 적합하다.
도입
체액의 분자적 분석은 조기 암 검출 및 그 이후의 증가된 치료 효능의 가능성을 제공한다. (Mandel, LD. (1990) Journal of Oral Pathology & Medicine, 19, 119-125; Mandel, LD. (1993) Journal of the American Dental Association, 124, 85-87; Wong, D.T. (2006) Journal of 'the American Dental Association, 137, 313-321). 종양으로부터 방출된 분자적 마커는 혈액 및/또는 다른 체액 속에서 그들의 길을 찾고, 생체마커의 특이적 검출은 비침습적 및 특정 방식으로 질병 식별을 가능하게 한다(Gormally et al. (2006) Cancer Research, 66, 6871-6876; Herr et al. (2007) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 5268- 5273). 타액은 비침습적 방법으로 쉽게 얻을 수 있고, 혈액과 관계하여 환자의 불편 없이 수집할 수 있다. 게다가, 간섭물질 (세포, DNA, RNA, 단백질)과 억제물질의 수준이 낮고, 혈액 속보다 타액 속에 덜 복잡하다. 이 이점은 최근 구강암 mRNA 마커의 철저한 연구 속에서 밝혀지고 있다.(Li et al. (2004) Clinical Cancer Research, 10, 8442-8450). mRNA는 마이크로어레이를 통해 확인되어 졌고, 정량적 PCR (qPCR)에 의해 설립 지침(Pepe et al. (2001) Journal of the National Cancer Institute, 93, 1054-1061)에 따라 검증되었다. 타액 mRNA 생체마커의 검출은 유용한 진단 유체로서 타액에 새로운 차원을 부여한다. 이번 연구에서, 우리는 타액 mRNA의 현장 검사를 위한 고유한 방법론을 발전시키는데 목표하였다.
전기화학은 RNA 검출을 위한 현장검사 진단 방법의 훌륭한 후보인데 (Hahn et al. (2005) Bioelectrochemistry, 67, 151-154), 이는 그것의 높은 민감도 때문이 아니라 기구의 단순함 때문이다.(Liao and Cui (2007) Biosensors & Bioelectronics, 23, 218-224; Wei et al. (2005) Journal of the American Chemical Society, 127, 5306-5307; Wei et al. (2006) langmuir, 22, 6280-6285; Wei et al. (2003) Biosensors & Bioelectronics, 18, 1157-1163; Wei et al. (2003) Biosensors & Bioelectronics, 18, 1149-1155). 그러나, 타액 생체 마커의 낮은 농도(~fM)와 타액의 복잡한 백그라운드 때문에, 전통적인 전기 화학적 전류 측정 검출 방법은 타액의 직접적 RNA 검출을 위한 높은 신호 대 백그라운드 비(SBR)의 임상 진단상 요구조건을 충족시키지 못한다.
최근, 플락스코(Plaxco)그룹은 림프액(serum)과 소변을 포함하는 여러가지 체액에서 올리고누클레오티드 검출을 가능하게 하는 산화환원 반응-라벨링 된 헤어핀 프로브를 적용한 새로운 방법을 보고하였다(Lubin et al. (2006) Analytical Chemistry, 78, 5671-5677; Xiao et al. (2006) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 16677-16680). 이 방법은 전기 화학적 반응 동안 헤어핀 프로브 (HP)가 비개방 그리고 개방 상태 사이에서 스위치로서 사용됨을 성공적으로 증명하였다. 이 결과는 민감도 및 특이성 모두의 상당한 개선을 제공하였다. 타액 진단의 맥락에서, 타액 속의 RNA 생체 마커의 낮은 카피 수는 백그라운드 잡음을 넘는 신호를 감지하기 위해 높은 민감도를 가진 센서를 요구한다. 본원에서, 우리는 효소적 증폭 과정을 HP 프로브에 기초한 형태적 변화가 도입된 표적과 결합시킨 방법을 제안한다. 이 HP는 표적과 상보적인 서열을 가진 루프 구성요소와 한 말단에 리포터로 라벨링 된 스템 구성요소를 포함한다. 표적 결합 없이, 센서 표면에의 접근은 입체구조적 방해(SH)를 발생시키고, 이것은 매개체의 프로브 리포터 라벨로의 접근성을 막음으로써 신호 증폭을 억제한다. 이 내장된(built-in) SH는 리포터 라벨이 매개체-과산화효소 결합에 접근하도록 만들고 전기 신호를 발생시키면서, 생체 인식 구성요소가 표적 특이성을 확인한 후에 제거되어 진다. 그러므로 비록 낮은 카피 수와 복잡한 혼합물 속에 존재하더라도 오직 특이적 표적만이 증폭된 전류를 생성할 수 있다. SH 효과는 프로브 디자인 및 표면 전기장을 최적화 시킴에 의해 HP-기초 전기화학적 센서로 조 절 될 수 있다. 우리의 선택적 증폭 방법은 타액 RNA 마커 및 다른 일반적인 관행을 이용한 현장검사 핵산 검출 시스템의 발전시켜 주요 장애를 극복하면서, 백그라운드 수준을 위해 비특이적 신호를 억제한다.
재료 및 방법
올리고누클레오티드 프로브 및 RNA
HPLC-정제된 올리고누클레오티드는 관습 합성 되어진다(Operon Inc., Alabama, USA). 프로브 서열은 헤어핀 구조의 형성을 고려하였다. 루프와 헤어핀 스템의 반(3' 말단)은 표적 인지 서열을 포함하고 있고, HPs는 5'말단에 비오틴 또는 비오틴-TEG로 라벨링 되고, 3' 말단에는 플루오레세인이 있다(자세한 구조는 도 10에 제시되어 있다). 비오틴 라벨은 칩 표면에 앵커(anchor)로서 스트렙타비틴(streptavidin)에 붙어있고, 플루오레세인 라벨은 신호 매개체의 결합을 고려했다. 본 발명은 프로브로부터 칩 표면까지의 5' 링커의 이하의 구성배열을 연구했다: 비오틴 링크, 비오틴-TEG, 비오틴-9 티미딘(T9), 그리고 비오틴-TEG-T9 . 비오틴-TEG는 비오틴과 올리고 체인을 연결하는 산소 원자를 포함하고 있는 트라이에틸렌 글리콜에 기초한 혼합극성과 함께 여분의 공백을 가지고 있다. 다른 간격 디자인은 스트렙타비틴으로의 비오틴의 접근성을 더욱 좋게 할 것이고, SH 효과를 위한 조절가능한 길이 링커로서의 역할을 할 수 있다.
인터루킨 8 (IL-8) mRNA (NM_000584)(St John et al. (2004) Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, 130, 929-935)은 구강 암에 대한 타액 생체 마커로서 제안되어져 왔고 검출을 위해 선택되어 졌다. 방법의 유용성 확립의 목적을 위해, 시험관 내 전사된 (IVT) IL-8 RNAs가 표준 정량 측정을 위한 표적으로써 사용되어 졌다. IVT RNA 세대의 자세한 정보는 보충 자료 II 부분에 묘사되어져 있다. 내생적인 mRNA는 임상 샘플로부터 검출된다. 타액 샘플로부터 내생적 IL-8의 검출을 위해 세포 용해(lysis) 과정이 수행되는데 이는 타액과 AVL 바이러스성 용해 버퍼 (QIAGEN, California, USA) 를 상온에서 15분동안 1:1로 섞음으로써 이뤄진다. 타액 수집과 qPCR 측정의 상세사항은 보충 자료 III-IX에 설명되어져 있다.
RNA 마커를 위한 시험관 내 전사된 RNA 의 생성
두 mRNA 표적은 검출을 위해 선택되어 졌다. 인터루킨 8 (IL-8) (mRNA, NM_000584)(St John et al. (2004) Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, 130, 929-935)가 구강암을 위한 후보 생체 마커로서 제안되어져 왔다. 타액 속에 많이 표현되는 SlOO 칼슘-결합 단백질 A8 (S100A8) (mRNA, NM_002964)은 각각의 전기 화학적 센서의 참고로서 사용되어 지고, 구강암과의 관련성은 보이지 않는다.
방법 확립의 목적을 위해, 시험관 내 전사된 (IVT) IL-8와 S100A8의 RNAs가 이번 연구에서 검출을 위한 표적으로 사용되어 졌다. IVT RNA는 두 단계로 생성되어 진다: 첫째는 정방향 프라이머의 5'말단에서 20개 염기의 코어 T7 프로모터 서열을 가지는 프라이머인 전통적인 RT- PCR을 사용하여 시험관 내 전사를 위한 주형가닥을 생성하는 것이다. IL-8에서, 정방향 프라이머는 5'-CTAATACG ACTCACTATAGGGaaggaaaactgggtgcagag-3', 이고 역방향 프라이머는 5'-attgcatctggcaaccctac-3' 이다. S100A8에서, 정방향 프라이머는 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGatcatgttgaccgagctgga-3', 그리고 역방향 프라이머는 5'-gtctgcaccctttttcctga-3' 이다. 생성물은 각각, 177 bp 및 159 bp 이중 나선 DNA이다. 일반적인 RT-PCR은 전체 구강 편평 상피 세포 암종 (oral squamous cell carcinoma (OSCC)) 세포계 RNA와 함께 수행되는데 이는 50 U MuLV 역전사효소 (Applied Biosystems), 20 U RNAse 억제자 (Applied Biosystems), 10 mM dNTPs 그리고 5 nmol 랜덤 헥사머(hexamers)가 포함된 주형가닥과 cDNA 역전사 반응 혼합물 20μl 안에서 합성되어 지기 때문이다. 그 혼합물은 우선 25℃에서 10분 동안 배양되어 진 후, 42℃에서 45분 동안 역전사된 다음 95℃에서 5분 동안 역전사가 최종 비활성화 되어 지고, 4℃에서 5분 동안 냉각된다. 1 마이크로리터 cDNA 는 20 μl PCR 반응에서 400 nM 프라이머와 함께 사용된다. PCR 반응은 이하 프로토콜에 의해 수행되어 진다: 3분 동안 95℃ 그 후에 30초 동안 95℃, 30초동안 60℃, 30초동안 72℃의 40번 반복, 그리고 7분 동안 72℃ 에서 최종 신장하는 단계이다. RT-PCR 생성물은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 2% 아가로즈 겔에서 확인되어 진다. 두번째 단계는 IVT RNA를 생성하는 것이다. 시험관 내 전사는 제조자의 지침에 따라 T7 MEGAshort transcribe kit (Invitrogen)를 사용하여 수행된다. 간단히, 첫번째 단계에서 온 8 μl PCR 생성물은 37℃에서 3시간동안 시험관 내 전사되어 지고, 추가적으로 20분동안 2 μl rDNaseⅠ (Invitrogen) 처리된다. 그 결과 단일가닥 RNA 전사물은 깨끗이 정제되었다.(Arcturus, Mountain View, CA). 재조합된 RNA는 A260/A280 비로 나노 편광 분광법에 의해 질량이 정량되어 진다. RNA 결과물은 RNase 없는 증류수(Invitrogen) 안에 베이커 효모 tRNA (30 μg/ml, Roche)와 함께 운반자로서 용해되어 진다.
타액 수집
자극을 받지 않은 전체 타액은 우리의 발표된 프로토콜에 따라 수집되어 진다.(Li, Yang 2004). 간단히, 모든 타액 샘플은 얼음에 보관하는 동안 수집되어 진다. 수집시, 상온에서 RNA레이터(RNAlater) (QIAGEN, Valencia, CA)가 타액 샘플로 1:1 (부피) 비로 추가되고, 볼텍싱(vortexing)에 의해 섞여진다. 전체 타액과 1:1 비율로 섞인 RNA레이터와 -80℃에서 저장된 샘플은 신속한 그리고 충분한 타액 RNA 분해의 억제를 제공한다. 샘플 분취량은 나중 사용을 위해 -80℃에서 저장된다.
전체 타액 RNA 추출
전체 RNA는 이하 절차에 따라 추출되어 진다: RNA레이터에 의해 보호된 언 타액은 얼음 상태에서 녹여지고 전체 RNA 는 다음과 같은 예외가 있는 제조자의 지침에 따라 바이러스성 미니 키트(viral mini kit (QIAGEN))를 이용해 추출되어 진다. 이전 보고된 지침(Li, Yang, 2004)과 비교가 가능하도록 하기 위해, RNA레이터에 의한 타액 희석을 보충하기 위해 2배의 타액 RNA레이터 혼합물의 시작 부피(2x560 ul)가 사용되어 졌다. 그 결과물 전체 RNA는 40 μl의 용리 완충액 속에서 용리 되어지고, 유전적 DNA 오염을 제거하기 위해 37℃ 에서 30분 동안, 40 μl RNA, 4.5 μl 10x DNaseI 버퍼, 0.5 μl rDNaseⅠ을 포함하고 있는 용액 속에서 rDNaseⅠ(Ambion, Austin TX) 과 함께 처리되어 진다. DNase 불활성 물질과 함께 정화 된 후에, 35 μl까지의 전체 RNA가 재생되어 지고 사용할 때까지 -80℃에서 열려진다.
프라이머 디자인
IL8에 대해 60 ℃ 부근의 용융 온도를 갖는 인트론-스패닝 프라이머 페어를 프라이머3 프로그램으로 디자인하였다. OF 및 OR은 RT-PCR에 대한 프라이머이고 IF 및 IR을 qPCR에 대해 디자인하였다.
Figure 112009082067668-PCT00003
RT - PCR 사전 증폭
원스텝 RT 및 PCR 사전 신호증폭을 슈퍼스크립트 III 플래티늄 원스텝 qRT-PCR 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 20-40 μl 반응에서 수행하였고, 프라이머 농도는 모든 표적에 대해 300 nM 이었다. 반응은 PCR 플레이트 냉각기 상의 96-웰 플레이트내로 BioMek 3000 리퀴드 핸들링 플랫폼을 사용하여 셋업하였고 아래의 프로그램으로 수행하였다: 60 ℃에서 1 분, 50 ℃에서 15 분, 95 ℃에서 2 분, 및 15 싸이클의 95 ℃에서 15초, 50 ℃에서 30초 및, 60 ℃에서 10초, 및 72 ℃에서 10초, 72 ℃에서 5분간 최종 연장하고 4 ℃로 냉각.
사전 신호증폭 반응의 클린업
RT-PCR 후 즉시, 5 μl의 반응을 37 ℃에서 15분간 2 μl의 Exo-SAP-IT® (USB, Cleveland, OH)로 처리하여 과량의 프라이머 및 dNTPs를 제거한 다음, 80 ℃에서 15 분간 가열하여 효소 혼합물을 비활성화시켰다. 달리 보고되지 않는 한 상기 반응을 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 40배로 희석하였다. 희석 비율은 Exo-SAP-IT 처리 이전에 사전 신호증폭의 부피를 나타낸다.
정량 실시간 PCR
모든 반응을 96-웰 플레이트내로 BioMek 3000 리퀴드 핸들링 플랫폼을 사용하는 자동화에 의해 셋업하였다. 4 μl 일정부분(aliquot)의 사전 신호증폭된 희석액을 300 nM의 세미-네스티드(semi-nested) 검정으로 증폭시켰다. SYBR 그린 파워 반응 믹스(Applied Biosystems (AB), Foster City, CA)로 10 μl의 반응을 얼음상에 셋업하고 SDS 7500 패스트 인스트루먼트(AB)에서 수행시켰다. 95 ℃에서 10 분간 중합효소의 활성화 후, 40 싸이클의 95 ℃에서 15초 및 60 ℃에서 60 초를 수행하였고, 다음에 용융 곡선 분석을 수행하였다.
qPCR 분석
qPCR 분석을 위해 7500 패스트 시스템 v1.3.1 소프트웨어(AB)의 자동 베이스라인 세팅을 사용하였다.
표면 제조
금 전기화학 센서의 표면 제조를 아래와 같이 수행하였다(Gau et al. (2001) Biosensors & Bioelectronics, 16, 745-755; Gau et al. (2005) Methods, 37, 73-83):
프로브 고정: 금 전극을 머캅토운데칸산(MUDA)의 자가 조립 단분자막으로 사 전 코팅하고, 카르복실기 (18)로 종결하였다. 금 표면을 50% 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, Biacore Inc., New Jersey, USA) 및 50% N-하이드록시석신이미드(NHS) (Biacore)의 4 μL 혼합물로 10 분간 활성화시켰다. 센서를 탈이온수(18.3 MΩ·cm)로 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 총 4 μL의 5 mg/mL 아민-PEO2-비오틴 라벨링 시약(Ez-비오틴) (Pierce Inc., Illinois, USA)을 금 표면에 로딩한 다음, 세척하고 건조시켰다. 에탄올아민-HCl(1.0 M, pH 8.5, Biacore)을 비반응성 EDC/NHS 활성 표면의 비활성화를 위해 로딩하였다. 다음에, PBS(pH 7.2, Invitrogen, California, USA) 내 0.5 mg/mL 스트렙타비딘(VWR Corp., California, USA)을 전극에서 10 분간 인큐베이션하여 스트렙타비딘-코팅된 전극을 제조하였다. 총 4 μL의 Tris-HCl완충액(pH 7.5, Invitrogen, California, USA)내의 5'-비오티닐화 및 3'-플루오레세인 이중-라벨링된 HP를 표면 상의 스트렙타비딘과 프로브 상의 비오틴 라벨 사이의 상호작용을 통해 30분 동안 전극 상에 고정시켰다. 이 고정 전략을 이용하여 달성된 올리고 프로브의 표면 밀도는 ~ 3.4 × 1012 분자/cm2(Su et al. (2005) Langmuir, 21, 348-353)이 되는 것으로 보고되었다. 과량의 HP를 탈이온수로 세척하여 제거하고 질소 가스로 건조시켰다.
표적 하이브리드화: 표면을 10 mM MgCl2(Sigma Corp., Missouri, USA)이 첨가된 6x 셀린-소듐 시트레이트 완충액(6x SSC, 0.9 M NaCl과 함께 0.09 M 소듐 시트레이트, pH 7.0, Invitrogen, California, USA)에서 제조된 표적-함유 샘플과 함 께 5분동안 인큐베이션하였다. 하이브리드화 과정 동안, 고리형 스퀘어-웨이브 전기장을 30 싸이클의 1초 동안 +200 mV 및 9초 동안 -300 mV에서 적용하였다. 하이브리드화 후, 전극을 DI 물로 헹구고, 질소 가스로 건조시켰다.
전기화학 검출
전기화학 판독을 제조사의 지시에 따라 전기화학 워크스테이션을 사용하여 수행하였다. 요약하면, PBS와 0.5% 카세인 차단 완충액(Blocker Casein in PBS, Pierce, pH 7.4) 내에서 희석된 항-플루오레세인-HRP(Roche, Indiana, USA)를 HP 또는 검출기 프로브 상의 플루오레세인 라벨에 첨가하였다. 다음에, 3, 3', 5, 5' 테트라메틸벤지딘 저 활성(TMB/H2O2, Neogen Corp., Kentucky, USA) 기질을 로딩하고, 각 전극 유닛에 -200 mV 포텐셜(vs. 금)을 적용한 후, 60s의 평형 후의 병렬 신호 판독에 의해 전류법(amperometric) 검출을 수행하였다(Gau et al. (2001) Biosensors & Bioelectronics, 16, 745-755; Gau et al. (2005) Methods, 37, 73-83).
전기화학 센서는 16-유닛 금 어레이였다. 각 유닛에 대해, 작업 전극(WE), 상대 전극(CE) 및 기준 전극(RE) (Gau et al. (2005) Methods, 37, 73-83)을 포함하는 세 전극이 있다. 기준 전극은 0.1 mM [Fe(CN)6]3-/4-의 고리형 포텐셜 전류(voltammetric) 곡선을 측정함에 의해 +218 mV(vs. SCE)로 검출되었다. 이 보고서에 기재된 모든 전극 포텐셜은 금 기준 전극(+218 mV vs. SCE)과 관련된다. 이 작은 전극 배열의 장점은 16개의 전극의 신호 판독이 동시에 수득될 수 있고, 단지 4 μL의 샘플 용액만이 검출에 필요하다는 점에 있다. 우리의 실험에서, 전기화학 신호는 전기화학 신호는 HRP 보고 효소의 산환환원 과정에 의해 생성된 전류이다. TMB는 전류 신호를 증폭시키는 2-전자 단계를 통해 환원된 HRP를 계속 재생시킨다. 전류는 하이브리드화된 표적의 표면 농도에 비례한다(Gau et al. (2005) Methods, 37, 73-83). 모든 실험을 실온에서 수행하였다.
결과 및 의견
1. 헤어핀-유도 특정 증폭
현재의 접근법을 사용한 특정 표적의 검출을 HP 디자인에 의한 선택적 하이브리드화뿐 아니라 HRP 및 TMB/H2O2에 의한 샌드위치 유사 신호 증폭의 조합을 통해 달성하였다. 이 방법은 SH 효과를 기반으로 한다: HP에 가까운 표면은 표적이 없는 프로브에 결합한 HRP 컨쥬게이트를 억제한다. 따라서, 표면 및 프로브 상의 리포터 라벨 사이의 거리가 검출 과정의 주요 인자이다. 표적에 결합하면, 개방된 HP 및 리포터는 표면으로부터 멀어지고, 그 결과로 인해 표면으로부터의 제한이 감소된다. 컨쥬게이트된 HRP는 플루오레세인에 결합하며 시그널-온 프로세스로 구성되는 전류를 생성한다.
5'-링커가 있거나 없는 4개의 IL-8 특정 HP들을 비교하면, 리포터와 전극 표면 사이의 다양한 거리로 인해 SH의 서로 다른 수준을 보여준다(표 3). 링커의 길이 및 신축성은 5'-비오틴 라벨된 말단에서 TEG 또는 오버행 스페이서(T9)의 길이에 의해 조절된다. 비오틴-TEG의 세로 크기는 분자 역학 계산(MM2)으로부터 약 3 nm 였다(Allinger, N.L. (1977) Journal of the American Chemical Society, 99, 8127-8134). 아무런 힘이 적용되지 않는 경우, 외가닥 DNA는 전극상에서 감긴 상태였다. 네거티브 포텐셜에서 전기화학 검출을 수행하는 경우, 코일은 아마 펴져서 컨쥬게이트 결합을 가능하게 할 것이다(Rant et al. (2006) Biophysical Journal, 90, 3666-3671; van Oijen et al. (2003) Science, 301, 1235-1238). 비록 T9 링커의 정확한 길이를 알 수는 없지만, 만약 듀플렉스 DNA가 9 bp × 0.28 nm/bp라면, 그것은 네거티브 포텐셜하에서 >3 nm일 것 같다. 단백질 결정 데이터에 따르면, HRP의 크기는 약 4 × 6.7 × 11.8 nm이다(Berglund et al. (2002) Nature, 417, 463-468).
도 6은 서로 다른 HP 디자인들로부터의 SH 효과를 보여준다. 가장 긴 링커(TEG-T9)를 갖는 프로브에 대해, 플루오레세인은 헤어핀이 닫힌 경우라도 표면으로부터 멀어진다. 매개체 착물이 형성되었고, SH 효과는 매우 적었다. 표적에 대한 하이브리드화는 단지 전극으로부터 HRP 착물의 거리만을 증가시켰다. 따라서, 신호는 결합으로 감소되며, 인식은 매우 약한 시그널-오프 방법을 야기한다(도 6). 결합된 표적을 갖는 신호는 모든 4개 프로브에 대해 유사한 수준에 있으며, 감소된 링커 길이와 함께 블랭크 신호가 감소되었다. 링커가 없는 HP에 대하여, 리포터는 닫힌 상태에서 표면에 매우 가깝다. 따라서, SH 효과는 매우 강력하며, 가장 낮은 백그라운드가 관찰되었다(SBR = 8:1).
2. 특이성
링커가 없는 HP의 특이성을 2 표적들의 교차-검출로 테스트하고, 결과를 도 11에 나타내었다. 참조 대조군으로써, 우리는 S 100 칼슘-결합 단백질 A8(S100A8 mRNA, NM_002964)에 대한 mRNA를 사용하였고, 그것은 타액에서 고도로 발현되며 경구암 관련성을 갖지 않는다. 각 프로브에 대해, 상보성 및 비상보성 IVT RNA 표적 사이의 비교를 IL-8에 대해 5 nM 및 500 nM, 및 S100A8에 대해 7 nM 및 700 nM의 농도에서 수행하였다. 100배로 과발현된 비상보성 표적도 IL-8- 및 S100A8-특정 프로브에 대해 작은 신호 증가를 주었다. 상보성 표적 신호는 블랭크 대조군보다 높은 >20 표준 편차(SDV)였다. 두 프로브 모두 5 nM의 IL-8 및 7 nM의 S100A8에 대해 우수한 RNA 식별을 보여주었다.
3. 하이브리드화 효율성을 갖는 SBR 의 조절
RNA 센서의 주 관심사는 SBR이다. 현재 HP 디자인에 있어, SBR은 개방되거나 닫힌 HP를 갖는 수의 비율에 의존한다. 특정 표적이 결합되지 않은 경우, 백그라운드 수준은 닫힌 상태와 관련이 있으며, 신호는 표적 하이브리드화 후 개방된 상태로부터 생성된다. 인지 동안 이들 닫히거나 개방된 상태는 분자내 및 분자간 하이브리드화 모두에 대해 고효율성을 필요로 한다.
하이브리드화 효율성을 증대시키고 이 센서의 SBR을 최적화하기 위해, 우리는 스템 및 루프 길이 모두의 변화에 의해 헤어핀 구조를 바꾸었다. 서로 다른 스템-루프 길이를 갖는 3개의 HP들을 연구하였다(시퀀스는 표 4에 목록화됨). 모든 3개의 프로브에서, 3'-말단 스템 요소가, 루프를 포함하여, 표적 RNA에 상보성이다. 단 스템(6 bp) 및 듀플렉스(21 + 6 bp)를 갖는 프로브는 높은 백그라운드 및 낮은 신호(도 7에서 HPS3)를 갖는다. 장 스템(10 bp) 및 듀플렉스(10 + 31 bp)를 갖는 프로브는 최저 블랭크 신호 및 표적(HPS1)에 대해 최고의 신호을 가지며, 표적과 결합되지 않은 경우 더 나은 닫힌 상태를 나타내고, 표적과 하이브리드화되는 경우, 더 나은 개방 상태를 나타낸다. 상보성 HP 시퀀스는 전체 루프 및 절반의 스템에 포함되며, 표적 하이브리드화 후 더욱 낮은 자유 에너지를 제공한다. 따라서, 일단 표적이 루프에 결합되면, 매우 긴 스템도 표적에 대한 자체의 상보성 시퀀스로 인해 개방될 수 있다. 높은 하이브리드화 효율성이 민감도 및 특이성에 유익하기 때문에, 우수한 SBR이 달성되었다. 대조적으로, 일반적인 선형 프로브(LP) (Liao et al. (2006) Journal of Clinical Microbiology, 44, 561-570)를 갖는 최적화된 프로브 시퀀스를 결정하기란 어렵다. 긴 시퀀스는 하이브리드화 효율성에 유익하지만, 높은 백그라운드를 생성한다.
4. 타액에서 스파이킹된 RNA 의 검출:
SH 효과로부터 적당한 HP 디자인 및 협력(cooperation)을 갖는, 타액의 RNA 생체마커 시퀀스는 표적 농도의 넓은 동적 범위에 걸쳐 검출될 수 있다. 도 12는 완충액에서 농도 및 전류 신호 사이의 관계를 보여준다. 비교를 위해, 이전에 공지된 방법들을 사용하여 각 표적에 대한 두 LP들을 갖는 오리지널 시스템을 또한 조사하였다(Liao et al. (2006) Journal of Clinical Microbiology, 44, 561- 570). 요약하면, 모든 프로브들을 표적 시퀀스의 인접 스트레치(stretches)로 상보성이 되도록 디자인하였다. '포착 프로브'는 5' 말단 비오틴 라벨을 갖는 전극 상에 고정화되었다. '검출기 프로브'는 항-플루오레세인-HRP와 결합하는 3' 플루 오레세인 라벨을 갖는다. 우리의 결과들은 IL-8을 검출하기 위한 우수한 SBR이 HP와 함께 얻어지지만, LP와는 좋지 못한 수행을 보여준다는 것을 보여준다.
검출(LOD)의 한계는 백그라운드 수준을 초과하는 적어도 2 SDV의 신호를 갖는 농도로서 정의된다. 기준에 따르면, HP에 대한 LOD는 약 0.4 fM이었다. LP에 대해, IL-8의 LOD는 약 400 pM이었고, 이는 HP에 대한 것보다 약 10,000배 높다(도 12).
5. 타액에서 내인성 mRNA 의 검출:
우리는 다음에 타액 샘플에서 내인성 IL-8 mRNA를 검출하고자 하였다. 서로 다른 타액 샘플 사이에서 신호 수준의 변화를 관찰하였다. 7개의 임상 타액 샘플에서 현재 최적화된 HP 디자인을 사용하여 IL-8 mRNA를 측정하였다. 타액에서의 내인성 mRNA가 검출을 가리는 다른 거대분자와 결합되기 때문에, 전기화학 검정 이전에 용해 공정이 수행되어 결합(masked) RNA를 방출한다. 도 13에서 보여주는 바와 같이, 우수한 상관관계가 타액 샘플에 대한 전기화학 신호 및 qPCR 결과 사이에서 관찰되었다. qPCR 측정에 의해 검출되는 바와 같이 보다 높은 전기화학 신호가 더욱 높은 수준의 IL-8 mRNA를 함유하는 타액 샘플에서 관찰되었다. PCR 측정에 더하여, 이들 결과들은 타액 내에서 mRNA의 존재를 지지한다. 결과들은 또한 내인성 mRNA가 PCR 증폭없이 전기화학 방법에 의해 타액 내에서 검출될 수 있고, 이는 현장(point-of-care) 타액 진단을 위해 요구되는 민감도를 충족시킴을 보여준다.
다양한 전기화학-관련 방법을 사용하여 DNA 올리고누클레오티드를 검출하기 위해, fM 영역에서 LOD가 달성되어왔다. 이들 방법들은 나노-입자-연결된 이차 프 로브(Park et al. (2002) Science, 295, 1503-1506), 다단계 환원 과정에서 증착된 은 나노입자의 양극 벗김 전압전류법(Hwang and Kwak (2005) Anal Chem, 77, 579-584), 및 표적-유도된 가닥 대치 기전에 기반한 전기 DNA 센서(Xiao et al. (2006) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 16677-16680)를 포함한다. mRNA는 올리고보다 더욱 긴 시퀀스 및 보다 복잡한 이차 구조를 갖는다. 특정 mRNA 표적을 포착하기 위해, mRNA의 특징적 분절은 조심스럽게 선택되어야 한다. 이차 mRNA 구조는 프로브 및 표적 사이에서 하이브리드화를 감소시킬 수 있다. 이 연구에서, Mfold 웹 서버에 의해 계산되는 것처럼, 본 발명자들은 최소한의 이차 구조를 갖는 mRNA 분절을 선택하였다(Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Research, 31, 3406-3415). 프로브 디자인은 또한 루프 시퀀스, 스템 길이, 및 프로브 이차 구조의 철저한 고려를 요구한다. RNA의 내인성 2-D 또는 3-D 구조를 고려하면, 다음의 원칙이 선형 및 헤어핀 프로브 디자인 모두에 적용된다:
(1) 표적 mRNA에 대한 프로브의 친화성: 4중 및 헤어핀을 포함하는, 표적 RNA에 상보성인 mRNA 이차 구조 및 프로브 시퀀스의 이차 구조가 고려된다. 안정된 이차 구조가 없는 시컨스는 4중 및 M-fold 계산에 근거하여 선택된다. 자가-이합체의 형성 및 하이브리드화 안정화가 또한 열역학적 계산에 근거하여 고려된다.
(2) 최적의 헤어핀 프로브 수행을 위해, 루프를 포함하는, 절반의 스템(3' 말단)이 표적 RNA에 상보성이 되도록 디자인된다. 이 연구에서 스템의 5' 말단이 모든 HP에 대한 비오틴-스트렙타비딘을 통해 표면상에 고정되기 때문에, 하이브리 드화 과정 동안 3' 스템만이 없어진다. 듀플렉스 형성을 위한 루프를 갖는 스템의 3' 말단 공유는 하이브리드화 효율성이 더 높아지고 SH 효과가 더 변화되는 결과를 낳는다.
요약하면, 본 발명자들은 고 민감도, 고 특이성, 및 더 큰 동적 범위(완충액 시스템 및 스파이킹된 타액에서 fM - nM)를 갖는 HP를 사용하여 mRNA의 전기화학 검출에 효과적인 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 또한 이 기술이 PCR 증폭이 필요하지 않으면서도 내인성 mRNA를 직접 검출하는데 잘 기능한다는 것을 보여준다.
표 3. IL-8 및 S100A8에 대한 올리고누클레오티드 시퀀스.
Figure 112009082067668-PCT00004
* 헤어핀 프로브 디자인은 MFoId 프리 웹 서버(27, 28)에 의해 계산되었다.
† 표적 인지 시퀀스는 이탤릭체로 목록화되었다. 헤어핀의 스템 부분은 밑줄화되었다.
‡ IL-8 CP는 이중 프로브 검출에서 비오틴 라벨을 갖는 포착 프로브이다. IL-8 DP는 이중 프로브 검출에서 플루오레세인 라벨을 갖는 검출 프로브이다.
표 4. 서로 다른 스템-루프 구조를 갖는 IL-8 HP에 대한 올리고누클레오티드 시퀀스.
Figure 112009082067668-PCT00005
* 모든 프로브는 5'-비오틴 및 3'-플루오레세인으로 이중 라벨화된다.
† 헤어핀 프로브 디자인은 MFoId 프리 웹 서버(27, 28)에 의해 계산되었다.
‡ 표적 인지 시퀀스는 이탤릭체로 목록화되었다. 헤어핀의 스템 부분은 밑줄화되었다.
공개된 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는, 본 출원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 다른 문헌들은 모든 목적들에 대해 전체에서 참조에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Wei, Fang Zimmermann, Bernhard G. Wong, David T.W. The Regents of the University of California <120> High Specificity and High Sensitivity Detection Based on Steric Hindrance & Enzyme-Related Signal Amplification <130> 023407K-190410PC <140> WO PCT/US08/65286 <141> 2008-05-30 <150> US 60/941,057 <151> 2007-05-31 <160> 25 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe target <400> 1 gagggttgtg gagaagtttt tgaagagggc tgagaattca taaaaaaatt cat 53 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe HP1 <400> 2 ctcccaacac ctcttcaaaa acttctcccg actcttaagt agtgttggga g 51 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe HP2 <400> 3 ctcccaacac ctcttcaaaa acttctcccg actcgttggg ag 42 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe HP3 <400> 4 ctcccaacac ctcttcaaaa 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fluorescein with amino hexyl linker <400> 13 cactcggtct ctagcaattt c 21 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic S100 calcium-binding protein A8 (S100A8) hairpin probe oligonucleotide S100A8 HP <221> modified_base <222> (1)...(1) <223> g modified by 5' biotin with amino hexyl linker <221> modified_base <222> (54)...(54) <223> c modified by 3' fluorescein with amino hexyl linker <400> 14 gtgtcctctt tgaaccagac gtctgcaccc tttttcctga tatactgagg acac 54 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) RT-PCR forward primer <400> 15 ctaatacgac tcactatagg gaaggaaaac tgggtgcaga g 41 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) RT-PCR reverse primer <400> 16 attgcatctg gcaaccctac 20 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic S100 calcium-binding protein A8 (S100A8) RT-PCR forward primer <400> 17 ctaatacgac tcactatagg gatcatgttg accgagctgg a 41 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic S100 calcium-binding protein A8 (S100A8) RT-PCR reverse primer <400> 18 gtctgcaccc tttttcctga 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) intron-spanning qPCR forward primer IL8_IF <400> 19 ccaaggaaaa ctgggtgcag 20 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) intron-spanning qPCR reverse primer IL8_IR <400> 20 cttggatacc acagagaatg aattttt 27 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) intron-spanning RT-PCR forward primer IL8_OF <400> 21 tttctgatgg aagagagctc tgtct 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) intron-spanning RT-PCR reverse primer IL8_OR <400> 22 atcttcactg attcttggat accaca 26 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe oligonucleotide IL-8 HPS1 <221> modified_base <222> (1)...(1) <223> g modified by 5' biotin with amino hexyl linker <221> modified_base <222> (51)...(51) <223> c modified by 3' fluorescein with amino hexyl linker <400> 23 gagggttgtg atgaattctc agccctcttc aaaaacttct ccacaaccct c 51 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe oligonucleotide IL-8 HPS2 <221> modified_base <222> (1)...(1) <223> g modified by 5' biotin with amino hexyl linker <221> modified_base <222> (42)...(42) <223> c modified by 3' fluorescein with amino hexyl linker <400> 24 gagggttgct cagccctctt caaaaacttc tccacaaccc tc 42 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic interleukin 8 (IL-8) hairpin probe oligonucleotide IL-8 HPS3 <221> modified_base <222> (1)...(1) <223> g modified by 5' biotin with amino hexyl linker <221> modified_base <222> (33)...(33) <223> c modified by 3' fluorescein with amino hexyl linker <400> 25 gagggtctct tcaaaaactt ctccacaacc ctc 33

Claims (25)

  1. 표적 핵산 분자의 서열에 특이적으로 하이브리드되는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 표적 핵산 분자 및 수용체에 대한 리간드에 대한 프로브로서, 상기 프로브가 이에 결합되는 표적 핵산 분자의 부재하에서 제 1의 3차원 구조 및 이에 결합되는 표적 핵산의 존재하에서 제 2의 3차원 구조를 갖고, 상기 제 1의 3차원 구조가 상기 리간드 결합으로부터 수용체를 억제하거나 방지하고, 상기 제 2의 3차원 구조가 수용체가 상기 리간드에 특이적으로 결합하도록 하는 프로브.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 수용체가 검출가능한 라벨을 포함하는 프로브.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨로부터의 검출 신호가 증폭되는 프로브.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제 1의 3차원 구조가 상기 리간드 결합으로부터 상기 수용체를 입체구조적으로 방해하는 프로브.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 프로브가 기판 상에 고정되는 프로브.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 제 1의 3차원 구조가 상기 기판 근처의 위치의 리간 드에 배치되어, 상기 수용체가 상기 리간드 결합으로부터 억제되거나 방지되는 프로브.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 수용체가 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인 프로브.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨이 플루오레세인(fluorescein), 스트렙타비딘 또는 비오틴인 프로브.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 검출 신호가 퍼옥시다아제, 라카아제(laccase), 글루코오스 산화효소, 알칼리성 인산분해효소 또는 요소분해효소에 의해 증폭되는 프로브.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 프로브가 헤어핀(hairpin) 프로브 또는 4중(quadruplex) 프로브인 프로브.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자가 IL-8 핵산인 프로브.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드 서열이 표 2-4로부터 선택되는 프로브.
  13. 제 1항의 프로브와 샘플 및 수용체를 접촉시키는 단계, 및 리간드와 수용체 사이의 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 표적 핵산 분자를 검정하는 방법으로서, 상기 복합체의 존재가 샘플 내의 표적 핵산 분자의 존재를 나타내고, 상기 복합체의 부재가 샘플 내의 표적 핵산 분자의 부재를 나타내는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 수용체가 검출가능한 라벨을 포함하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨로부터의 검출 신호를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 제 1의 3차원 구조가 상기 리간드 결합으로부터 상기 수용체를 입체구조적으로 방해하는 프로브.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 프로브가 기판 상에 고정되는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 제 1의 3차원 구조가 상기 기판 근처의 위치의 리간드에 배치하여, 상기 수용체가 상기 리간드 결합으로부터 억제되거나 방지되는 방법.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 수용체가 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  20. 제 13항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨이 플루오레세인, 스트렙타비딘 또는 비오틴인 방법.
  21. 제 15항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨로부터의 상기 검출 신호가 퍼옥시다아제, 라카아제, 글루코오스 산화효소, 알칼리성 인산분해효소 또는 요소분해효소에 의해 증폭되는 방법.
  22. 제 13항에 있어서, 상기 프로브가 헤어핀 프로브 또는 4중(quadruplex) 프로브인 방법.
  23. 제 13항에 있어서, 복합체의 검출 전에 리간드에 결합되지 않은 임의의 수용체를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제 13항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자가 IL-8 핵산인 방법.
  25. 제 13항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드 서열이 표 2-4로부터 선택되는 방 법.
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