CN116660345A - 一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学分析检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。本发明提供的一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸；所述报告分子为非特异性核酸分子；本发明无需将报告分子固定在电极表面，可以建立均相、实时、无固定化CRISPR/Cas传感体系。打破了以往电极修饰对于电化学检测技术精密性、重现性、重复性的限制，实现了均相下电化学核酸检测进程的实时监测、均相流动下电极对电化学核酸体系的反复检测，检测准确度高、灵敏度高，提升检测性能。
Description
技术领域
本发明涉及电化学分析检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。
背景技术
近年来，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术作为核酸的主要检测方式得到了大规模、大范围应用，但该技术依然存在操作步骤繁琐、仪器便携程度较低、检测灵敏度有待提高、专业人员专业环境依赖度极高等显著缺陷。开发更为简便、快速的新一代核酸检测技术，有望脱离专业实验室、专业人员。
规律成簇间隔短回文重复探针（Cluste Redregularly Interspaced ShortPalindromic Repeats, CRISPR）与CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）所构成的CRISPR/Cas工具，是新一代基于核酸剪切的基因编辑工具，自发现以来广受关注。CRISPR/Cas工具因其灵敏度高、特异性强、反应快速、操作简单、效率高等显著优势，除了在基因编辑上的独特应用外，也为核酸检测带来了新的可能。CRISPR/Cas核酸检测工具，由Cas蛋白、crRNA、报告分子构成。Cas蛋白、crRNA可以形成稳定的二元复合物，根据Cas蛋白属性不同（如Cas9、Cas12、Cas13和Cas14等），crRNA可根据序列匹配性选择性的与样本中的RNA或ssDNA结合，从而形成Cas/crRNA/RNA或Cas/crRNA/ssDNA三元复合物，由此使得Cas蛋白构象变化具有RNA剪切酶或ssDNA剪切酶的反式切割活性。报告分子由DNA或RNA序列偶联信号分子构成，Cas三元复合物剪切报告分子中的DNA或RNA序列，释放游离的信号分子，从而产生可检测的光学信号、颜色信号等。
经典CRISPR/Cas工具始终聚焦生物分子特异识别与光信号响应的结合，即报告分子中选用荧光物质作为信号分子，但光信号探测对较为复杂光路系统的依赖，增大了仪器体积、提高了检测成本，限制了其广泛普及使用。新型的CRISPR/Cas工具逐步关注电化学检测简便快速与高灵敏为CRISPR/Cas核酸检测带来性能进一步提升的可能，电化学仪器体积小，构造简单、成本低廉、响应速度快、检测灵敏度高，且以血糖仪为代表的电化学仪器已经成功实现产品化和商业化。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子上包含：
至少一个电化学活性分子；和
至少一个核苷酸。
所述报告分子为非特异性核酸分子，即不发生配对识别的非特异性核酸分子。
可选的，所述报告分子上包含有至少一个修饰基团：
所述修饰基团修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或
所述修饰基团为具有一定空间位阻，在电活性物质氧化还原峰附近不产生干扰峰的大分子物质。
可选的，所述修饰基团为羧基荧光素、生物素和地高辛中的至少一种；和/或
所述电化学活性分子修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或
所述电化学活性分子包括二茂铁、亚甲基蓝和硫堇中的至少一种。
可选的，所述非特异性核酸分子为DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链；和/或
所述非特异性核酸分子的长度为1~ 26个碱基。
可选的，还包括Cas蛋白、crRNA和/或反应缓冲液。
可选的，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14中的至少一种；和/或
所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为4 : 1 ~ 1 : 4；和/或
所述报告分子浓度范围为1 ~ 50 μM；和/或
所述反应缓冲液中含有Tris-HCl为10~50 mM、KCl或NaCl为30~120 mM、MgCl2为1~20 mM和BSA为80~130 μg/ml。
可选的，所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为2:1；和/或
所述报告分子浓度范围为5~ 10 μM；和/或
所述反应缓冲液中含有Tris-HCl为20~40 mM、KCl或NaCl为40~80 mM、MgCl2为1.5~ 10 mM和BSA为90~100 μg/ml。
一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，包括：
利用所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件构建CRISPR/Cas反应体系，然后加入待测样本，进行反应，采用非修饰电极进行实时电化学信号检测。
可选的，所述反应时间为5 ~ 60 min，反应温度为5 ~ 50℃；和/或
所述非修饰电极包括丝网印刷电极。
可选的，所述反应时间为15 ~ 30 min，反应温度为20~ 40℃；和/或
所述非修饰电极包括金电极、铂电极、石墨电极或碳电极。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸；所述报告分子为不发生配对识别的非特异性核酸分子；本发明在研究过程中发现，基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测中，一般均是报告分子一端连接电化学活性分子，另一端固定在电极表面，随着反应的进行对报告分子进行剪切，释放电活性物质，使得电活性物质远离电极表面，电信号下降，实现电化学检测，研究思路局限在报告分子固定电极-远离电极的方式中，然而本发明发现，采用上述的固定电极-远离电极的方法，在“精密性、重复性”方面，存在由于电极表面需修饰报告分子，使得电极的制备工艺复杂、批间差大、无法重复使用；在“灵敏度、特异性”方面，存在由于固相-液相反应模式限制布朗运动分子碰撞效率又无法阻止碰撞发生，使得灵敏识别时报告分子剪切效率低、特异检测时游离活性分子碰撞电极产生干扰信号；在“定量性、检测限”方面，存在由于检测信号与靶标浓度反比，使得检测结果的高噪声无法剔除线性响应差、弱信号难于提取检测限差，综合导致检测性能提升受到严重制约。本发明发现当该报告分子无固定化游离在反应体系内时，由于报告分子与CRISPR/Cas复合物均为均相，极大提升了二者碰撞效率提升带来的高剪切效率，同时当报告分子被剪切后，被释放的电活性物质分子更小扩散速率更大，比报告分子具有更为优势的碰撞电极产生信号的能力，从而呈现了明确的检测靶标浓度正相关的电信号增强，因而实现了灵敏度的提升、正相关响应的构建。综上，本发明取代报告分子电极固定的思路，建立了均相、无固定化CRISPR/Cas识别体系，使得电化学检测具有低背景信号和优良的信噪比，进而检测准确度高、灵敏度高，提升检测性能。
2. 本发明提供的一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，所述报告分子上包含有至少一个修饰基团：所述修饰基团修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或所述修饰基团为具有一定空间位阻，在电活性物质氧化还原峰附近不产生干扰峰的多种大分子物质；本发明在研究过程中发现当将连接电化学活性分子的报告分子上修饰基团后，报告分子空间位阻将增大，较大的空间位阻、修饰基团及核酸分子的包裹缠绕，使得电化学活性物质电子传递受到阻碍，从而基本消除了游离报告分子的背景信号，因而实现了低检测限弱信号的提取。据此，可以利用上述机制，将报告分子无固定化游离在CRISPR/Cas反应体系内，同时将报告分子上不仅修饰电化学活性分子还修饰基团，报告分子被剪切前，由于报告分子上修饰基团，使得电信号极其微弱，降低背景信号；报告分子被剪切后，电化学活性分子被释放，位阻变小、充分游离，大幅增加了电化学活性分子的扩散系数和电极接触概率，极大的增强了电信号，提升特异识别信号。综上，本发明取代了简单的非修饰报告分子的思路，构建了多样化多元修饰的报告分子传感元件，降低了背景噪声、提升了弱信号探测，实现了均相检测灵敏度的进一步提升。
3.本发明提供的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，利用所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件构建CRISPR/Cas反应体系，然后加入待测样本，进行反应，以及非修饰电极的实时电化学信号检测；本发明所述的电化学核酸检测方法，在电化学检测方面，打破了以往电极修饰对于电化学检测技术精密性、重现性、重复性的限制，实现了均相下电化学核酸检测进程的实时监测、均相流动下电极对电化学核酸体系的反复检测。在CRISPR/Cas工具核酸检测应用方面，通过报告分子与修饰基团、电化学活性分子的偶联，实现均相、实时、反复与电化学检测的结合，在提高检测性能的同时，带来了简单、快速、低成本的实用能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中的使用实施例1和实施例7方法的电信号检测结果；
图2是本发明实验例2中的使用实施例4和实施例8方法的电信号检测结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括：
报告分子：由RNA链、二茂铁（Fc）和生物素（Biotin）构成；RNA链的序列与Cas13a蛋白的剪切倾向性相一致，长度为6个碱基，其核苷酸序列为Cas13a-SHERLOCK(参考Ding R,Shen Y, Yuan M, Zheng X, Chen S, Duan G. Rapid and facile detection of HBVwith CRISPR/Cas13a. New Journal of Chemistry. 2022;46(41):19997-20004.)中的生物素报告基因的核苷酸序列（参见表格S1中的ssRNA reporter项表格中的biotinreporter），生物素修饰在5’末端，Fc修饰在3’末端。
报告分子的制备方法：
① 将5’端生物素标记的固相载体CPG（市售）装入自动合成仪（ABI，394型）中，按照5’→3’方向合成寡核苷酸链，序列完成后取出CPG粉；
② 加入0.5mL 25%的氨水于55℃下氨解8h，将寡核苷酸链从固体载体CPG上释放出来；
③ 加入2 eq 的1 mol/L TBAF的THF溶液，室温孵育5h，将2’位的硅羟基暴露出来；
④ 分离掉杂质后，将获得的产物和5 eq 的0.5 mol/L Fc-NHS的DMSO溶液一起投入在PH=9的碳酸氢钠溶液中，50℃孵育8h，得到既定的序列；
⑤ 将样品超滤后上制备型HPLC制备出报告分子。
构建的CRISPR/Cas13a反应体系，包括：
7 μM报告分子、40 nM Cas13a蛋白、20 nM crRNA、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50mM KCl、2.5 mM MgCl2、100μg/ml BSA，余量为超纯水。
本实施例提供了一种利用上述基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件进行电化学核酸检测的方法，包括如下步骤：
将金电极与电化学工作站进行连接，并浸入CRISPR/Cas13a反应体系。将6μL待测样本加入到上述构建的CRISPR/Cas13a反应体系中，置于37℃下反应25 min。待测样本可以是免提取产物也可以是提取纯化后的核酸。在反应结束后，通过方波伏安法完成对CRISPR/Cas13a反应体系中二茂铁电信号的检测。
上述检测方法的原理为：当待测样本中有靶标RNA时，靶标RNA能够和Cas13a蛋白以及crRNA形成三元复合物，激活Cas13a蛋白的反式切割活性，剪切报告分子中的RNA链，释放二茂铁。而当待测样本中无靶标RNA时，Cas13a蛋白的反式切割活性不会被激活，报告分子中的RNA链不会被剪切，修饰在其中的二茂铁不会被释放。由于游离的完整报告分子修饰了基团，空间位阻较大且为核酸及修饰基团包裹，修饰在其中的二茂铁无法与电极进行电子传递。因而当待测样本中无靶标RNA时，CRISPR/Cas13a反应体系中二茂铁的电信号极其微弱，背景信号较低。而二茂铁本身的体积较小，扩散速率较快，空间位阻较小。因此当待测样本中有靶标RNA时，CRISPR/Cas13a反应体系中二茂铁的电信号较强。因此，所述方法检测性能强。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，构建的CRISPR/Cas13a反应体系，包括：
1μM报告分子、10 nM Cas13a蛋白、40 nM crRNA、50 mM Tris-HCl、30 mM KCl、1mM MgCl2、80μg/ml BSA，余量为超纯水。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，构建的CRISPR/Cas13a反应体系，包括：
5μM报告分子、40 nM Cas13a蛋白、10 nM crRNA、40 mM Tris-HCl、40 mM KCl、1.5mM MgCl2、90μg/ml BSA，余量为超纯水。
实施例4
本实施例提供了一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括：
报告分子：由DNA链、羧基荧光素（FAM）、二茂铁（Fc）构成；DNA链的序列与Cas12a蛋白的剪切倾向性相一致，长度为10个碱基，其核苷酸序列为E-CRISPR (参考Dai Y, SomozaRA, Wang L, Welter JF, Li Y, Caplan AI, et al. Exploring the Trans-CleavageActivity of CRISPR-Cas12a (cpf1) for the Development of a UniversalElectrochemical Biosensor. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(48):17399-405.)中的表面探针-10nt（参见材料项下的表格中的surface probe-10nt），FAM修饰在5’末端，Fc修饰在3’末端。
报告分子的制备方法：
① 将3’端点Fc标记的固相载体CPG装入自动合成仪（ABI，394型）中，在固相载体上按照3’→5’方向合成寡核苷酸链，最后与FAM亚磷酰胺试剂（市售）偶联（50℃孵育8h），得到既定的序列；
② 使用叔丁胺：甲醇：水（1:1:2，v/v/v）进行释放、脱保护，65℃水浴3h。
③ 将样品超滤后上制备型HPLC制备出报告分子。
构建的CRISPR/Cas12a反应体系，包括：
7 μM报告分子、40 nM Cas12a蛋白、20 nM crRNA、30 mM Tris-HCl（pH 7.9）、70mM NaCl、10 mM MgCl2、100μg/ml BSA，余量为超纯水。
本实施例提供了一种利用上述基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件进行电化学核酸检测的方法，包括如下步骤：
将金电极与电化学工作站进行连接，并浸入CRISPR/Cas12a反应体系。将6μL待测样本加入到上述构建的CRISPR/Cas12a反应体系中，置于37℃下反应25 min。待测样本可以是免提取产物也可以是提取纯化后的核酸。在反应结束后，通过差分脉冲伏安法完成对CRISPR/Cas12a反应体系中二茂铁电信号的检测。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于，构建的CRISPR/Cas12a反应体系，包括：
50μM报告分子、40 nM Cas12a蛋白、10 nM crRNA、10 mM Tris-HCl、120 mM NaCl、10 mM MgCl2、100μg/ml BSA，余量为超纯水。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于，构建的CRISPR/Cas12a反应体系，包括：
10μM报告分子、10 nM Cas12a蛋白、40 nM crRNA、20 mM Tris-HCl、80 mM NaCl、20 mM MgCl2、130μg/ml BSA，余量为超纯水。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，报告分子上不含有修饰基团生物素（Biotin）。
报告分子制备方法步骤①中，使用普通的固相载体CPG，非5’端生物素标记的固相载体CPG。
实施例8
本实施例与实施例4的区别在于，报告分子上不含有修饰基团羧基荧光素（FAM）。
报告分子制备方法步骤①中，不加入羧基荧光素（FAM）这一合成原料。
实验例1
靶序列和crRNA的序列分别为SHERLOCK(参考Gootenberg JS, Abudayyeh OO,Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ, Joung J, et al. Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-42.)中图1所示的ssRNA1和crRNA1，然后按照实施例1、实施例7实施，具体如下：
①构建CRISPR/Cas13a反应体系，包括：
7 μM报告分子、40 nM Cas13a蛋白、20 nM crRNA、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50mM KCl、2.5 mM MgCl2、100μg/ml BSA，余量为超纯水。
② 将金电极与电化学工作站进行连接，并浸入CRISPR/Cas13a反应体系。
③ 将6μL提取纯化后的核酸（浓度约为10 copies/μL）加入到上述构建的CRISPR/Cas13a反应体系中，置于37℃下反应25 min。
④ 通过方波伏安法完成对CRISPR/Cas13a反应体系中二茂铁电信号的检测。
结果如图1所示，图中的生物素-RNA-Fc是实施例1中的报告分子，RNA-Fc是实施例7中的报告分子，由图中可以看到，实施例1和实施例7中的报告分子均获得了高阳性信号和较低的背景信号，进一步比较实施例1和实施例7发现，实施例1的背景信号更低，阳性信号更高，说明实施例1的生物素-RNA-Fc具有更低的背景信号和更优的信噪比。
实验例2
靶序列和crRNA的序列分别为E-CRISPR (参考Dai Y, Somoza RA, Wang L,Welter JF, Li Y, Caplan AI, et al. Exploring the Trans-Cleavage Activity ofCRISPR-Cas12a (cpf1) for the Development of a Universal ElectrochemicalBiosensor. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(48):17399-405.)中的LbCas12a-crRNA-HPV16 和HPV-16（参见材料项下的表格），按照实施例4、实施例8实施，具体如下：
① 构建CRISPR/Cas12a反应体系，包括：
7 μM报告分子、40 nM Cas12a蛋白、20 nM crRNA、30 mM Tris-HCl（pH 7.9）、70mM NaCl、10 mM MgCl2、100μg/ml BSA，余量为超纯水。
② 将金电极与电化学工作站进行连接，并浸入CRISPR/Cas12a反应体系。
③ 将6μL提取纯化后的核酸（浓度约为10 copies/μL）加入到上述构建的CRISPR/Cas12a反应体系中，置于37℃下反应25 min。
④ 通过差分脉冲伏安法完成对CRISPR/Cas12a反应体系中二茂铁电信号的检测。
结果如图2所示，图中的FAM-DNA-Fc是实施例4中的报告分子，DNA-Fc是实施例8中的报告分子，由图中可以看到，实施例4和实施例8中的报告分子均获得了高阳性信号和较低的背景信号，进一步比较实施例4和实施例8发现，实施例4的背景信号更低，阳性信号更高，说明实施例4的FAM-DNA-Fc具有更低的背景信号和更优的信噪比。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1. 一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子上包含：
至少一个电化学活性分子；和
至少一个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述报告分子上包含有至少一个修饰基团：
所述修饰基团修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或
所述修饰基团为具有一定空间位阻，在电活性物质氧化还原峰附近不产生干扰峰的大分子物质。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，
所述修饰基团为羧基荧光素、生物素和地高辛中的至少一种；和/或
所述电化学活性分子修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或
所述电化学活性分子包括二茂铁、亚甲基蓝和硫堇中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述非特异性核酸分子为DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链；和/或
所述非特异性核酸分子的长度为1~ 26个碱基。
5.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，还包括Cas蛋白、crRNA和/或反应缓冲液。
6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14中的至少一种；和/或
所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为4 : 1 ~ 1 : 4；和/或
所述报告分子浓度范围为1 ~ 50 μM；和/或
所述反应缓冲液中含有Tris-HCl为10~50 mM、KCl或NaCl为30~120 mM、MgCl2为1~ 20mM和BSA为80~130 μg/ml。
7.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为2:1；和/或
所述报告分子浓度范围为5~ 10 μM；和/或
所述反应缓冲液中含有Tris-HCl为20~40 mM、KCl或NaCl为40~80 mM、MgCl2为1.5~ 10mM和BSA为90~100 μg/ml。
8.一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，其特征在于，包括：
利用权利要求1-7任一项所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件构建CRISPR/Cas反应体系，然后加入待测样本，进行反应，采用非修饰电极进行实时电化学信号检测。
9.根据权利要求8所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，其特征在于，反应时间为5 ~ 60 min，反应温度为5 ~ 50℃；和/或
所述非修饰电极包括丝网印刷电极。
10.根据权利要求9所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，其特征在于，所述反应时间为15 ~ 30 min，反应温度为20~ 40℃；和/或
所述非修饰电极包括金电极、铂电极、石墨电极或碳电极。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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