CN101849185A - 基于空间位阻和酶相关信号放大的高特异性和高灵敏度检测 - Google Patents

基于空间位阻和酶相关信号放大的高特异性和高灵敏度检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能高灵敏度和高特异性地检测样品中的靶核酸的分子探针。还公布了利用该探针的检测方法。

Description

基于空间位阻和酶相关信号放大的高特异性和高灵敏度检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年5月31日提交的美国临时专利申请号60/941,057的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
在联邦资助研发下作出发明的权利的声明
本发明本发明在NIH/NIDCR基金号UO1DE 017790、UO1DE015018和RO1DE017593以及NASA/NSBRI基金号TD00406的政府资助下作出。政府对本发明享有一定权利。
发明背景
1.发明领域
本发明涉及核酸探针和试验方法。
2.相关领域描述
就地(point-of-care)检测的要求之一是检测混合物中的少量靶分子。由于任何混合物的复杂性，检测低数量靶需要高灵敏度以及高特异性。然而，现有技术检测方法需要在特异性和灵敏度之间作出妥协。开发了几种技术以获得信号扩增，从而有助于增加灵敏度。在大多数检测方法中，信号强度与检测区域内靶的数量(与整个样品体积相比通常极少)相关。因此，无论是扩增整个样品体积中的靶数量还是在小的检测区域内累积靶均有助于提高信号强度。
第一种方法增加靶、探针和/或信号的总量，因而能获得高强度检测结果。例如，PCR，引物原位标记(PCR，Primed in situ labeling)(PRINS)和基于核酸序列的扩增(NASBA)技术应用于增加靶总量。参见Monis和Giglio，InfectionGenetics and Evolution，2006.6(1)：第2-12页。连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)能扩增探针。支链DNA(bDNA)和酪胺信号扩增(TSA)能扩增信号。参见Andras等，Molecular Biotechnology，2001.19(1)：第29-44页。
与直接扩增靶/探针/信号相比，第二种方法致力于增加靶的局部浓度而不是产生该靶的更多拷贝。例如，纳米技术通过应用基于纳米颗粒的技术将样品内少数拷贝的靶聚集到检测区域中。同时增加靶的总量和局部浓度导致高灵敏度。然而，这样也会产生较高的背景水平和更多的假阳性结果，因为同时放大了特异性和非特异性信号。
在另一方面，现已设计了高特异性探针来降低背景噪声水平，例如分子信标(molecular beacon)和具有约束性结构的其它探针。参见Wei等，Journal of theAmerican Chemical Society，2005.127(15)：第5306-5307页；Broude，Trends inBiotechnology，2002.20(6)：第249-256页；Fan等，Trends in Biotechnology，2005.23(4)：第186-192页；Tyagi和Kramer，Nature Biotechnology，1996.14(3)：第303-308页。这些方法通常基于距离灵敏性信号转导过程(distance sensitivesignal traducing process)，例如FRET，增补染料(Howell等，Genome Research，2002.12(9)：第1401-1407页)和电化学方法。在这些方法中，特异性靶的结合会导致探针的构象变化。构象变化将显著转换成信号打开(ON)状态。然而，通过改善特异性，那些探针的检测极限降低，因为可检测信号需要大量靶，因此会在检测系统中引入更多假阳性结果。
因此，仍需要能提供高特异性和高灵敏度检测的试验方法和试剂。
发明概述
本发明总体上涉及探针和试验方法。
在第一方面，本发明提供检测靶核酸分子的探针。该探针包含两部分，与靶核酸分子序列特异性杂交的多核苷酸序列，和受体的配体。当没有靶核酸分子与该探针结合时，该探针具有第一三维结构，当靶核酸分子与该探针结合时，其具有第二三维结构。所述第一三维结构抑制或阻止受体结合配体，而第二三维结构允许受体特异性结合配体。在一些实施方式中，所述受体包含可检测标记物，即，赋予可检测信号的部分。在一些实施方式中，可检测信号被扩增，例如通过酶促反应。在一些实施方式中，所述第一三维结构在空间上阻碍受体结合配体，在一些实施方式中，所述探针固定于基材或固体支持物上。在一些实施方式中，所述第一三维结构将配体置于接近该基材的位置，从而抑制或阻止受体结合配体。在一些实施方式中，所述受体是特异性结合配体的抗体。在一些实施方式中，所述可检测标记物是荧光素、链霉亲和素或生物素等。在一些实施方式中，可通过由过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或脲酶等催化的酶促反应放大可检测标记物的检测信号。在一些实施方式中，所述探针是发夹探针或四重探针(quadruplex probe)。
在第二方面，本发明提供检验样品中靶核酸分子的方法。该方法包括在有受体存在下使上述探针与样品接触，然后检测是否存在配体与受体之间的复合物。本发明探针包含多核苷酸序列(能特异性结合靶核酸分子的序列)和配体(能结合受体)，并且当没有靶核酸分子与该探针结合时，该探针具有第一三维结构，当靶核酸分子与该探针结合时，其具有第二三维结构。所述第一三维结构抑制或阻止受体结合配体，而第二三维结构允许受体特异性结合配体。因此配体和受体之间存在复合物表明样品中存在靶核酸分子，而不存在复合物表明样品中不存在靶核酸分子。在一些实施方式中，受体是能赋予检测信号的可检测标记物。在一些实施方式中，可检测信号被扩增。在一些实施方式中，所述第一三维结构在空间上阻碍受体结合配体。在一些实施方式中，所述探针固定于基材上。在一些实施方式中，所述第一三维结构将配体置于接近该基材的位置，从而抑制或阻止受体结合配体。在一些实施方式中，所述受体是特异性结合配体的抗体。在一些实施方式中，所述可检测标记物是荧光素、链霉亲和素或生物素等。在一些实施方式中，可通过在酶促反应中利用过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或脲酶放大可检测标记物的检测信号。在一些实施方式中，所述探针是发夹探针或四重探针。在一些实施方式中，先除去未结合配体的任何受体，再检测该复合物。
本发明提供在“脏”样品(含高浓度的干扰信号检测的污染物和分子)，例如唾液中检测极低浓度生物标记的方法。该方法可应用于高质量样品制品无法获得或太昂贵的情况，例如就地检测，以及与污染物和干扰性混合物(干扰物)相比，生物标记浓度极低的情况。低浓度检测的可行性数据体现在口腔癌mRNA生物标记，IL8。
在一些实施方式中，所述探针是“即用的”，例如，所述探针预先锚定在表面上，在检测期间无需其它处理。在一些实施方式中，所述探针是生物相容的寡核苷酸或适体。
本发明探针可方便地应用于多种领域，无需昂贵的仪器和复杂的数据分析。读出信号可以是本领域已知的任何信号，例如电化学信号、荧光信号，等等。
与现有技术相比，本发明探针能减少或消除假阳性结果，因为现有技术方法对于互补和非互补靶没有选择性，从而会导致假阳性结果。所述探针的空间位阻效应提高了特异性。
与现有技术相比，本发明探针还能减少或消除假阴性结果，因为具有高特异性的现有技术方法降低了信号，从而会产生假阴性结果。应用特异性信号扩增来增强信号强度，从而能改善灵敏度。
本发明的探针和方法可用于临床检测血液、血清、尿液和唾液样品中的生物标记，例如原始唾液的唾液mRNA检测和体内监测疾病的早期阶段。
本发明的探针和方法可用于多重检测，例如包含多个本发明探针的微阵列，这些探针对不同靶核酸分子具有特异性。
本发明探针可以重复使用，因为探针的不同状态之间的转换是可逆的，从而使得传感器可重复使用。在一些实施方式中，可为空间位阻效应而优化受体和/或与其结合的标记物的形状和尺寸，例如与较小的受体和/或标记物相比，大受体和/或标记物对于空间位阻更敏感。
如本文所述，本发明涉及靶核酸分子的探针。该探针包含多核苷酸序列(特异性杂交靶核酸分子的序列，例如，IL-8mRNA或DNA序列)和受体的配体。该探针在没有靶核酸分子与其结合时，具有第一三维结构，有靶核酸分子与其结合时，具有第二三维结构。所述第一三维结构抑制或阻止受体结合配体，而第二三维结构允许受体特异性结合配体。
在一些实施方式中，所述探针包含与靶序列互补或基本上互补的多核苷酸序列。本文所用的“基本上互补”指在中等，优选严格杂交条件下与某序列特异性杂交的序列。一些示范性的多核苷酸序列见表2-4。
附图简述
参考附图可进一步理解本发明，其中：
图1是本发明试验方法的一个实施方式的示意图。
图2显示具有本发明发夹探针的探针结构的影响。
图3显示用线形探针和发夹探针检测mRNA的界限。
图4是利用发夹探针的电化学检测中特异性信号放大的示意图。当没有靶结合于发夹探针时，发夹关闭，HRP不能在表面上形成有效复合物，因此观察不到信号。与靶杂交后，发夹打开，HRP复合物形成。然后TMB不停再生还原的HRP，从而放大现有信号。
图5显示了应用发夹探针交叉检测两组唾液RNA：IL-8和S100A8。IL-8的RNA靶水平是5nM，S100A8的是7nM。空白信号是6×SSC和10mMMgCl2。显示了4次实验的平均值和标准偏差。
图6图示比较了含不同接头的IL-8发夹探针进行的检测。空白对照中发夹是关闭的，有RNA样品时是打开的。IL-8RNA的浓度是50nM。空白对照是6×SSC和10mM MgCl2。显示了4次实验的平均值和标准偏差。示意性显示了含不同长度接头的发夹探针的构型。
图7图示比较了含不同茎-环结构的IL-8发夹探针进行的检测。空白对照中发夹是关闭的，有RNA样品时是打开的。下划线所示序列与靶RNA互补。斜体表示的序列是茎部分。黑体表示的序列是环部分。HP1：10bp在茎中，41bp在双链体中。HP2：8bp在茎中，34bp在双链体中。HP3：6bp在茎中，27bp在双链体中。IL-8RNA的浓度是50nM。空白对照是6×SSC和10mMMgCl2。显示了4次实验的平均值和标准偏差。
图8显示了在线形和发夹探针之间作比较的唾液RNA检测。(a)：IL-8。线形探针是IL-8CP和IL-8DP，发夹探针是IL-8HP，如表2所列；(b)：S100A8。线形探针是S100A8CP和S100A8DP，发夹探针是S100A8HP，如表2所列。
图9显示电化学检测掺加IVT RNA的唾液。循环：(a)IL8；(b)S100A8。唾液样品是未经处理的同一人同一批次的全唾液。
图10描述了标记分子与寡核苷酸之间连接键的结构。
图11：应用HP交叉检测两组IVT RNA：IL-8和S100A8。(a)8份样品的电流计信号。(1)-(4)对HP应用S100A8，靶向RNA分别是(1)7nM S100A8，(2)500nM IL-8，(3)5nM IL-8，和(4)仅有缓冲液。(5)-(8)对HP利用IL-8，靶向RNA分别是(5)5nM IL-8，(6)700nM S100A8，(7)7nM S100A8和(8)仅有缓冲液。(b)(a)中相同8份样品的柱状图。HP，例如IL-8HP和S100A8HP的序列见表3。显示了各4次实验的平均值和标准偏差。
图12：借助线形探针(LP)和HP检测唾液IL-8RNA。LP是IL-8CP和IL-8DP，HP是IL-8HP，如表3所列。从检测信号中扣除空白对照信号。显示了4次实验的平均值和标准偏差。LP的4毫微微摩尔(fM)靶的数据点未显示，因为其数值低于空白对照的数值。
图13：对于同一组临床唾液样品，利用HP的电流计信号与qPCR测定的IL-8mRNA浓度之间的相关性。线性回归的R2是0.99。
发明详述
在以前的构象变化相关检测中(参见Howell，W.M.，M.Jobs，和A.J.Brookes，iFRET：an improved fluorescence system for DNA-melting analysis(DNA-解链分析的改进荧光系统).Genome Research，2002.12(9)：第1401-1407页；Xiao，Y.等，Single-step electronic detection of femtomolar DNA by target-induced stranddisplacement in an electrode-bound duplex(通过电极结合双链体中的靶诱导链置换来单步骤电检测毫微微摩尔DNA).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(美国国家科学院学报)，2006.103(45)：第16677-16680页；Xiao，Y.等，Label-free electronic detection of thrombin inblood serum by using an aptamer-based sensor(利用基于适体的传感器来无标记地电检测血清中的凝血酶).AC国际出版社(Angewandte Chemie-InternationalEdition)，2005.44(34)：第5456-5459页)，靶识别(特异性)和信号放大(灵敏度)是不相关的两个步骤。只有识别过程是特异性的，而放大是非特异性的，同时适用于信号和噪声。在本发明中，放大和识别均是特异性的。只有靶的特异性结合会导致信号放大。其它干扰物(代检验样品中的污染物和其它分子)的非特异性结合对检测信号贡献极低。因此，抑制了噪声水平，并只扩增靶信号。
本文所用的“靶”可与“靶核酸分子”互换使用。本文所用的“靶”核酸分子可以是想要知道其存在和/或含量的任何核酸分子。在一些实施方式中，靶核酸分子的序列已知。在一些实施方式中，例如突变检测，靶核酸分子的序列可以是怀玉具有改变，即与参比核酸序列不同的序列。在这些实施方式中，靶核酸分子的序列可已知或未知，“参比核酸序列”是可与靶核酸分子的序列作比较的已知核酸序列。靶核酸分子中的改变可以在单核苷酸碱基或1个以上的核苷酸碱基中。这种改变可以是已知的多态性改变，例如单核苷酸多态性。
本文所用的“核酸分子”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用来指可以为单链或双链的天然或合成来源的DNA和RNA分子，并代表有义或反义链。本发明的核酸分子可含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接键，以及可由DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何物质。这些类似物的例子包括硫代磷酸酯、环磷酰胺、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)，等等。
在优选的实施方式中，本发明的核酸分子是分离的。本文所用“分离的”指从其天然环境中分离的核酸分子。“分离的”核酸分子可以是与获得该核酸分子的物种的基因组DNA基本上分离的或从中纯化的。“分离的”多核苷酸所包括的核酸分子可与其正常或天然在5’端、3’端或二者相连的其它DNA区段相分开。
本发明的核酸分子可以是其天然形式或经合成修饰。本发明的核酸分子可以是单链(编码或反义)或双链的，可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并一一对应于DNA分子的mRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明的核酸分子可连接于其它核酸分子、支持材料、报道分子、猝灭分子或它们的组合。其它核酸分子包含启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性内切酶位点、多克隆位点、其它编码区段等。因此，考虑了可利用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选以制备便利性和在所需重组DNA或PCR方法中应用为限。在本发明的一些实施方式中，考虑了包含本文所述核酸分子的核酸序列。
本发明的核酸分子不难通过本领域已知的方法制备，例如采用本领域已知的方法和设备，如自动寡核苷酸合成仪、PCR技术、重组DNA技术等直接合成核酸序列。
本发明的核酸分子可包含标记物。本领域技术人员已知各种标记物和偶连技术，这些标记物和偶连技术可应用于利用本发明核酸分子的各种核酸和氨基酸试验。本文所用的“标记物”或“可检测标记物”是产生信号的组合物或分子，所述信号可由本领域已知方法检测，例如放射照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记物包括放射性同位素、荧光团、生色团、酶、染料、金属离子、配体，如生物素、亲和素、链霉亲和素和半抗原，量子点(quantum dot)等。
“标记的”核酸分子包含结合的标记物，从而可通过检测与其结合的标记物是否存在来检测该核酸分子是否存在。标记物可通过共价键，例如化学键或非共价键，例如离子键、范德华力、静电作用或氢键与核酸分子结合。可采用本领域已知的方法产生标记的杂交或PCR探针来检测多核苷酸相关的序列，包括寡聚标记(oligolabeling)、缺口平移、末端-标记或利用标记核苷酸的PCR扩增等，优选末端标记。看利用的合适标记物包括放射性核苷酸、酶、荧光、化学发光或生色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
本文所用的“核酸探针”或“探针”指能结合靶核酸分子的核酸分子，所述靶核酸分子的序列与该核酸探针的序列互补。探针可包含本领域已知的天然或修饰的碱基。参见，例如MPEP 2422，第8版。可通过除磷酸二酯键以外的连接键连接探针的核苷酸碱基，只要连接键不干扰核酸分子结合互补核酸分子的能力。探针可结合与该探针序列的互补性低于100％的靶序列，这种结合依赖于杂交条件的严格性。可检测探针的存在与否来确定样品中靶序列或亚序列的存在与否。探针可含有可检测标记物。
本文所用的“检验”可与“检测”、“测量”、“监测”和“分析”互换使用。
除非另有明确表述，本文所用的“附于”、“附上”、“结合”、“偶连”、“连接”、“偶合”、“固定”、“吸附”和“相连”可互换使用，包括直接以及间接连接、附上、相连或偶连，它们是可逆或不可逆的。
本文提供的“配体”指结合另一分子，即“受体”的分子。例如，结合抗体的抗原、与互补寡核苷酸杂交的寡核苷酸、结合受体的激素或神经递质、或结合酶的底物或变构效应物，包括天然和合成的生物分子，例如蛋白质、多肽、肽、核酸分子、碳水化合物、糖、脂质、脂蛋白、小分子、天然和合成有机和无机物质、合成聚合物，等等。本文提供的“受体”是特异性结合给定配体的分子。
本文所用的两分子之间的“特异性结合”或“特异性相互作用”表示某配体与其受体彼此结合或相互作用的特异性足以区分与某给定样品中其它组分或污染物的结合或相互作用。
本文所用的短语“选择性(或特异性)杂交”指在严格杂交到中等杂交条件下，某核酸分子与特定核苷酸序列的结合、形成双链体或杂交胜过其它核苷酸序列。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景杂交的约2倍、优选约5倍、更优选约10倍。严格杂交条件是比探针的热解链温度(Tm)约低5℃到比Tm约低10℃。中等杂交条件是比探针的热解链温度(Tm)低约10℃到比Tm约低20℃-约25℃。
高灵敏度：为提高灵敏度，应用基于夹心检测的信号放大。夹心放大的基本概念是为放大信号的目的而应用介导物形成三明治样复合物。首先，靶与探针结合后，先在报道分子标记的探针与介导物之间形成复合物，再进行检测。然后除去过量的介导物并进行检测。参见Liao，J.C.等，Use of electrochemicalDNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urinespecimens(利用电化学DNA生物传感器快速分子鉴定临床尿液样品中的尿路病原体).Journal of Clinical Microbiology，2006.44(2)：第561-570页；Gau，V.等，Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification(核酸扩增的电化学分子分析).Methods，2005.37(1)：第73-83页。在核酸的常规夹心检测中，寡核苷酸探针是线性的。因此，不依赖于任何介导物结合的非特异性和特异性靶会增加背景并导致假阳性结果。
高特异性：为提高特异性，在探针设计中引入空间位阻-转换结构(例如茎环和适体)。本发明探针具有至少一种双状态结构。没有靶结合时，探针处于结构I。在结构I状态中，报道分子(或称为“配体”)不能与介导物(或称为特异性结合给定配体的“受体”)形成有效的复合物，因为受体受到空间位阻、抑制或阻止从而不能接触配体。与靶结合后，探针转变成结构II。在结构II状态中，报道分子与导致信号放大的介导物形成有效复合物。空间位阻设计简单而有效，没有会增加劳动和成本的任何其它化学反应步骤。
物理作用力参数Fa描述了约束构象的探针分子内相互作用。Fa较高使得该探针在结构I状态中更稳定。另一物理作用力参数Fb描述了靶和探针之间的分子间相互作用。Fb较高使得探针能稳定在结构II状态。Fa和Fb之间的竞争性决定了探针处于何种状态。由于Fb来自靶与探针之间的相互作用，特异性靶结合产生的Fb高于非特异性靶结合产生的。因此，|Fa-Fb(特异性)|和|Fa-Fb(非特异性)|之间的差异决定了检测的特异性。在大多数情况中，靶，以及由此的靶和探针之间的相互作用，Fb，不能改变。然而，为实现高特异性，可通过改变探针设计而将Fa设计成所需数值。
低拷贝数应用：此外，基于构象的传统检测通常是信号-关闭(signal-off)方法(Fan，C.H.，K.W.Plaxco，和A.J.Heeger，Electrochemical interrogation ofconformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detectionof DNA(电化学分析构象改变作为序列特异性检测DNA的无试剂方法).美国国家科学院学报，2003.100(16)：第9134-9137页)，与之相比，本发明的检测可以是信号-打开(signal-on)方法。信号-打开方法在背景值低时检测到信号增加，而信号-关闭方法在背景值高时检测到信号降低。在高数值时检测的误差通常大于在较低值时，因此，信号-打开方法具有更稳定的背景噪声水平。此外，信号-关闭方法中，信号降低的动态范围受限于原始背景值。因此，信号-打开方法的检出限较高，测量误差较小并且更易于商业使用，因为其信号处理步骤少于信号-关闭方法。
探针设计：可单独或集成设计探针的生物识别部分和约束-结构(或空间-转换)部分。图1说明了探针设计的两种方法。在单独设计方法中(图1A)，DNA发夹结构用作探针。环是靶的生物识别部分。茎设计成空间-转换部分。当特定靶浓度低于检出限时，探针维持公布结构，产生阻止报道分子与介导物形成有效复合物的构象约束作用。因此，检测的信号水平低。与特定靶结合后，发夹打开，报道分子与介导物自由形成有效复合物从而放大信号，因此，检测的信号水平高。在整合设计中，探针的组成本身可形成约束结构，探针设计中无需额外部分。例如，可利用G-四重(探针)(图1B)。
图2显示不同水平的所设计空间位阻的作用。比较了各具有不同水平空间位阻的含接头(位于探针和底物之间)和不含接头的两种发夹探针，所述空间位阻是报道分子接近探针所结合的电极表面所致。在此设置中，与特定靶杂交形成造成报道分子进一步远离电极表面的DNA双链体，因此检测到信号输出降低。应注意，在这种信号-关闭方法中，这种信号造成高背景值降低不多，且难以检测。对于含接头的探针(较低的设计空间位阻)，即使当发夹关闭时，报道分子也远离该表面，从而在报道分子和介导物之间依然可形成有效的复合物。因此，在无靶和存在靶(IL-8)之间检测的输出值小，如“含接头”标记的左侧数据集所示。当通过除去发夹探针的接头而设计较大的空间位阻时，没有靶结合时报道分子非常接近表面，从而阻止有效介导物-报道分子复合物的形成，因此检测到的背景噪声极低。与靶杂交后，报道分子与表面之间的距离增加，从而能形成复合物并有效放大信号。信号改变极大并具有高信噪比。这是信号-打开方法，其结果示于“无-接头”标记的右侧数据集。
虽然本文示例的探针是在基材表面上，但可利用溶液中的探针进行检测。由于探针设计的关键革新是空间位阻，可以应用导致空间位阻的所有类型的约束方法。例如，探针可结合于纳米颗粒、磁珠或大分子，例如蛋白质。
信号读出：本发明的特征在于信号读出类型的多样性。读出信号不限于一种特定类型的信号，例如以上例子所述的电输出值，而是依赖于放大过程。如果放大与电子转移过程相关，则信号宜为电流/电压。如果放大与光学过程相关，则信号宜为荧光/UV/IR等。如果放大与精巧的分子结构修饰相关，则信号宜为精细的光谱。信号还可以是机械以及磁性数据。本领域技术人员不难根据给定的放大过程而选择合适的检测方法。
由于本发明的信号读出与报道分子和介导物之间形成的复合物有关，所检测的靶可以不含标记物。无标记物检测不仅降低了试剂使用的成本，还可能进行实时和高通量检测。其可应用于微阵列和自动原位检测。
实施例
提供以下实施例只是为了说明，绝非限制。本领域技术人员不难知道可改变或改进各种非关键性参数以获得基本上相同或相似的结果。
实施例1：采用发夹探针设计监测低浓度mRNA
唾液中的mRNA生物标记显示唾液可用作口腔疾病，还可能用作其它全身性疾病的诊断液体。然而，唾液中特异性mRNA生物标记的浓度低于毫微微摩尔/升。此外，同时存在大量非特异性mRNA、rRNA和蛋白质。关键是如何检测唾液中微量的mRNA或蛋白质而不用纯化和放大。
本文公开的包括口腔癌的IL-8、mRNA生物标记的电化学阵列。示例了本发明探针的应用。将探针设计成发夹结构。报道分子是检测探针(荧光素-绿色)。介导物是抗-荧光素-HRP偶联物。信号放大基于HRP氧化还原过程。信号读出是电流。Fa是发夹探针的吉布斯自由能。Fb是探针和靶之间形成的双链体的吉布斯自由能。
通过应用无接头的发夹探针，IL-8的检出限(LOD)是约10毫微微克/毫升(约1毫微微摩尔/升)(图3)。对于线形探针，LOD只有约100皮克/毫升(10皮摩尔/升)。发夹探针检测的动态范围是10毫微微克/毫升到100纳克/毫升。
唾液是体液的反映，现已证明其能反映身体的正常和患病状态。参见，例如I.D.Mandel，J.Am.Dent.Assoc.，124：85-87(1993)；I.D.Mandel，J.OralPathol.Med.，19：119-125(1990)；D.T.Wong，J.Am.Dent.Assoc.，137：313-321(2006)。近年来，Wong的课题组观察到口腔癌患者的唾液中几种唾液mRNA一致升高。参见D.T.Wong，J.Am.Dent.Assoc.，137：313-321(2006)。在这些mRNA中，4种的组合(OAZ-1、SAT、IL8和IL1-β)可用作生物标记以区分口腔癌患者的唾液与对照对象的。参见Y.Li等，Clin.Cancer Res.，10：8442-8450(2004)。鉴定mRNA生物标记使得唾液成为有价值的诊断液体。参见S.Hahn等，Bioelectrochemistry，67：151-154(2005)。然而，迄今为止，对于在未提取的唾液中直接检测RNA尚无一致而可靠的技术。与其它基于液体，例如血液和尿液的检测相比，基于唾液的诊断比目前的方法更易得、精确而廉价，同时对患者的危险更低。
唾液作为诊断液体的主要问题是唾液中生物标记的含量通常低于血清中的量。由于唾液生物标记的浓度低和唾液的复杂性，常规检测方法不能符合高信噪比的临床诊断要求。
开发了几种技术以获得有助于增加灵敏度的信号放大。在大多数检测方法中，信号强度与检测区域内的靶数量相关，而该数量与整个样品体积相比通常极低。因此，可增大整个样品体积内的靶数量或将靶累积在小的检测区域内来确保高信号强度。第一种方法增加靶、探针和/或信号的总量，因而产生高强度检测输出值。例如，PCR，引物原位标记(PRINS)和基于核酸序列的扩增(NASBA)技术应用于增加靶总量。参见P.T.Monis和S.Giglio，Infect.Genet.Evol.，6：2-12(2006)。连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)能扩增探针。参见P.T.Monis和S.Giglio，Infect.Genet.Evol.，6：2-12(2006)。支链DNA(bDNA)和酪胺信号扩增(TSA)能扩增信号。参见S.C.Andras等，Mol.Biotechnol.，19：29-44(2001)。与直接扩增靶/探针/信号相比，第二种方法致力于增加靶的局部浓度而不是产生该靶的更多拷贝。例如，纳米技术通过应用基于纳米颗粒的技术将样品内少数拷贝的靶聚集到检测区域中。参见A.N.Shipway和I.Willner，Chem.Commun.，第2035-2045页(2001)；A.Merkoci，Febs J.，274：310-316(2007)；J.Wang，Anal.Chim.Acta，500：247-257(2003)；S.G.Penn等，Curr.Opin.Chem.Biol.，7：609-615(2003)。同时增加靶的总量和局部浓度导致高灵敏度。然而，这样也会产生较高的背景水平和更多的假阳性结果，因为同时放大了特异性和非特异性信号。
在其它方面，现已开发可基于竞争的检测方法来降低背景噪声水平。检测探针总具有几种准稳定状态，各状态显示不同水平的信号强度。参见N.L.Goddard等，Phys.Rev.Lett.，85：2400-2403(2000)；C.H.Fan等，P Natl Acad SciUSA，100：9134-9137(2003)；S.Tyagi和F.R.Kramer，Nat.Biotechnol.，14：303-308(1996)；F.Wei等，Biosens.Bioelectron.，18：1149-1155(2003)；F.Wei等，J.Am.Chem.Soc.，127：5306-5307(2005)。互补靶和非互补靶之间的竞争将探针在这些状态之间转换，因此呈现不同水平的信号。可通过分子内或分子间竞争实现转换过程。对于分子内转换，通常应用具有两种或更多种准稳定状态构象的高特异性探针，例如分子信标和具有约束性结构的其它探针。参见C.H.Fan等，P Natl Acad Sci USA，100：9134-9137(2003)，S.Tyagi和F.R.Kramer，Nat.Biotechnol.，14：303-308(1996)，F.Wei等，J.Am.Chem.Soc.，127：5306-5307(2005)；Y.Xiao等，P Natl Acad Sci USA，103：16677-16680(2006)；A.A.Lubin等，Anal.Chem.，78：5671-5677(2006)；N.E.Broude，Trends Biotechnol.，20：249-256(2002)。特异性靶的结合会导致探针的构象变化。构象变化通常会影响距离敏感性的信号水平，例如FRET、增补染料和电化学方法。参见T.J.Huang等，Nucleic Acids Research，第30卷(2002)；V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)。非特异性靶不产生信号变化，并且背景水平低。然而，通过改善特异性，那些探针的检出限降低，因为可检测信号需要大量靶，因此，会在检测系统中引入更多假阳性结果。
在以前的构象变化相关检测中，靶识别(特异性)和信号放大(灵敏度)是不相关的两个步骤。参见C.H.Fan等，P Natl Acad Sci USA，100：9134-9137(2003)；S.Tyagi和F.R.Kramer，Nat.Biotechnol.，14：303-308(1996)；F.Wei等，J.Am.Chem.Soc.，127：5306-5307(2005)。如本文披露的，借助能进行选择性放大的新型发夹设计探针同时获得高灵敏度和高特异性。该发夹探针由对靶具有高特异性的生物识别组分与活化信号报道过程的约束结构组分构成。只有在生物识别组分确认了靶的特异性后，约束结构组分才除去内在的空间位阻，从而发生信号放大，进而导致高灵敏度。当没有特异性靶结合时，空间位阻抑制信号放大。因此，即使在含有大量干扰物的混合物中存在的拷贝数低，也只有特异性靶能产生可检测信号。这种选择性放大的方法极大抑制了非特异性结合和背景水平，从而克服了实施任何就地检测体系的两个关键障碍。
材料
所有试剂(表1)按购买状态使用或用缓冲溶液稀释，不作任何预处理。
表1.电化学RNA检测的材料
名称                                            公司
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)  毕埃可公司
                                                (Biacore)
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)                           毕埃可公司
胺-PEO2-生物素标记试剂(Ez-生物素)               皮尔斯公司
                                                (Pierce)
乙醇胺-HCl，1.0M，pH 8.5                        毕埃可公司
氯化镁(MgCl2)                                   西格玛公司
                                                (Sigma)
链霉亲和素                                      VWR
抗-荧光素-HRP                                   罗氏公司
                                                (Roche)
3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物低活性(TMB/H2O2) 尼金公司
                                                (Neogen)
1×磷酸缓冲盐水，不含钙或镁                     英杰公司(Invitrogen)
1×Tris-HCL缓冲液(Tris-HCl)                     英杰公司
20×柠檬酸钠缓冲液(SSC)                         英杰公司
PBS溶液配制的封闭BSA含有10％牛血清白蛋白，pH 7.4皮尔斯公司
PBS溶液配制的封闭酪蛋白含有PBS配制的1％(w/v)酪    皮尔斯公司
蛋白，pH 7.4
所用的电化学传感器是16-单位金阵列。参见V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)。电极阵列能同时多重检测不同的样品。每个单位有三-电极设置，包括工作电极(WE)、对电极(CE)和参比电极(RE)。微小电极阵列的优点是可同时获得16个电极的信号读出值，并且检测只需要4μL样品溶液。如本文所示例的，电化学信号是报告酶-辣根过氧化物酶(HRP)的氧化还原过程产生的电流。HRP和H2O2之间反应后，HRP转变成氧化状态。然后，TMB通过2-电子步骤不停再生还原的HRP，从而放大电流信号。
检测方法
金电化学传感器的表面修饰包括下述3个步骤(V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)；J.J.Gau等，Biosens.Bioelectron.，16：745-755(2001))：
探针固定化：对金电极预涂布用羧基封端的自装配单层。用4μL 50％EDC和50％NHS活化金表面10分钟。用DI水(18.3MΩ·cm)清洗传感器后，用超纯氮气干燥。然后将4μL 5mg/mL Ez-生物素加载于金表面，然后用DI水清洗，并用氮气干燥。然后，将PBS缓冲液配制含2.5％BSA的0.5mg/mL链霉亲和素在电极上温育10分钟，最终获得涂布有链霉亲和素的电极。然后通过表面上的链霉亲和素与探针上的生物素标记物之间的相互作用将Tris-HCl缓冲液配制的4μL生物素化和荧光素双重标记的发夹探针在电极上固定30分钟。用DI水彻底清洗来除去过量HP，用氮气干燥。
靶杂交：将该表面与在含有10mM MgCl2的6×SSC缓冲液中配制的靶样品温育60分钟。杂交后，用DI水清洗电极，氮气干燥。
信号读出：电流与靶的表面浓度成比例。参见V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)。首先，0.5％酪蛋白封闭溶液配制的0.5mU/mL抗-荧光素-HRP与HP上的荧光素标记物结合。用DI水清洗和氮气干燥后，加入TMB/H2O2底物。通过给各电极单位施加-200mV电压，平衡60秒后平行读出信号以进行电流分析检测。
电化学信号是报告酶-辣根过氧化物酶(HRP)的氧化还原过程产生的电流。HRP和H2O2之间反应后，HRP转变成氧化状态。然后，TMB通过2-电子步骤不停再生还原的HRP，从而放大电流信号。首先，0.5％酪蛋白封闭溶液配制的0.5mU/mL抗-荧光素-HRP与HP上的荧光素标记物结合。用DI水清洗后，加入TMB/H2O2底物。通过给各电极单位施加-200mV电压，平衡60秒后同时读出信号来进行电流分析检测。电流与靶的表面浓度成比例。参见V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)。
寡核苷酸探针和RNA样品制备
寡核苷酸从美国阿拉巴马州的操纵子公司(Operon)定制。每个发夹探针用生物素在一端标记，用生物素TEG在另一端标记。生物素标记物可作为锚定物结合链霉亲和素，而荧光素标记物是信号报道分子。操纵子公司提供的生物素-TEG具有额外的16-原子间隔臂来连接生物素和寡聚链。这种间隔设计使得生物素能更好地接近链霉亲和素。
选择两种mRNA靶作检测。干扰素8(IL-8)是口腔癌的唾液生物标记。健康人的IL8浓度是2毫微微摩尔，口腔癌样品中增加至约16毫微微摩尔。参见Y.Li等，Clin.Cancer Res.，10：8442-8450(2004)。为标准化唾液样品中的RNA水平，利用不显示口腔癌相关性的参比基因S100钙-结合蛋白A8(S100A8)。对于唾液检测，S100A8用作各电化学传感器上的参比对照。
按照本领域已知的方法制备体外转录物(IVT)RNA。参见H.Ohyama等，Biotechniques，29：530-+(2000)。简言之，用T7-寡聚-(dT)24作为引物进行逆转录来合成c-DNA的第一链。用美国德克萨斯州奥斯丁市安拜恩公司(AmbionInc.，Austin，TX，USA)的T7RNA聚合酶进行体外转录。逆转录1μL细胞RNA以制备cDNA，1μl cDNA用作PCR模板，T7序列用作引物。通过美国特拉华州的ND技术公司(NanoDrop Tech.，Delaware，USA)的光谱法测定cRNA的数量和质量。等分IVT RNA样品，-20℃并存待用。为评估唾液的灵敏度和特异性，将IVT RNA掺加入唾液。
结果和讨论
在核酸的常规夹心检测中，寡核苷酸探针是线形的。因此，不依赖于任何介导物结合的非特异性和特异性靶会增加背景并导致假阳性结果。为提高特异性，在发夹结构中引入空间位阻效应。参见图4。发夹探针的特征在于其打开或不打开的双-状态结构。没有靶结合时，发夹探针处于关闭状态，因此，报道分子因设计的空间位阻而不能与介导物形成有效复合物。结合特异性靶后，探针转换成打开状态，报道分子与介导物形成有效复合物，从而导致信号放大。空间位阻设计简单而有效，没有任何额外的化学反应步骤来增加实施实验的工作。由于该项操作中信号读出只与报道分子和介导物之间形成的复合物有关，检测的靶不含标记物。无标记物的检测不仅减少所用试剂的类型，还可能进行实时和高通量检测。其可应用于微阵列和自动原位检测。
本发明探针基于抑制HRP/TMB信号放大的表面空间位阻。因此，表面和报道分子之间的距离是识别过程的主要因素。在这种设置中，与特异性靶杂交形成使得报道分子进一步远离电极表面的DNA双链体，因此检测到信号输出降低。随着报道分子从表面进入溶液中，表面限制作用可降低，因此电流信号增加。
此外，基于构象的传统检测通常是信号-关闭方法，与之相比，本发明的检测可以是信号-打开方法。信号-打开方法在背景值低时检测到信号增加，而信号-关闭方法在背景值高时检测到信号降低。在较高数值时检测的误差通常大于在较低数值时，因此，信号-打开方法具有更稳定的背景噪声水平。此外，信号-关闭方法中，信号降低的动态范围受限于原始背景值。因此，信号-打开方法的检出限较高，测量误差较小并且更易于商业使用，因为其信号处理步骤少于信号-关闭方法。
发夹探针的空间位阻效应的概念
通过借助HRP和TMB/H2O2的夹心样信号放大与借助夹心探针设计的信号选择性的组合来实现特异性信号放大。本发明方法的基础思路是表面的空间位阻抑制HRP/TMB结合无靶的探针。因此，表面和报道分子之间的距离是识别过程的主要因素。随着报道分子从表面进入溶液中，表面限制作用降低，因此电流信号增加。没有空间位阻，与特异性靶杂交形成隔开报道分子与电极表面的DNA双链体，因此检测到信号输出降低。
比较了含和不含接头的4种发夹探针，由于报道分子与探针结合的电极表面接近，每种探针具有不同的空间位阻水平(表2)。通过5-生物素标记端的突出间隔臂和/或TEG调节接头的长度。突出间隔臂是9胸苷(9T)。MM2计算得到生物素TEG的径向尺寸是约3nm。参见N.L.Allinger，J.Am.Chem.Soc.，99：8127-8134(1977)。对于9T接头，未施加作用力时单链DNA在电极上通常处于卷曲状态。在特定作用力，例如负电势下，卷曲的链会伸直。由于在-200mV进行电化学检测，9T接头远远地伸长，而非具有弯曲或躺倒的结构。参见A.M.van Oijen等，Science，301：1235-1238(2003)；U.Rant等，Biophys.J.，90：3666-3671(2006)。虽然9T接头的实际长度不清楚，但如果双链体DNA的数据取9bp×0.28nm/bp的话，其在负电势下应该远长于3nm。从晶体数据获得的HRP尺寸是约4×6.7×11.8nm。参见G.I.Berglund等，Nature，417：463-468(2002)。
表2.具有不同接头长度的IL-8发夹探针的寡核苷酸序列＊
Figure GPA00001010997700181
*通过M倍(Mfold)的免费网络软件计算发夹探针设计。参见J.SantaLucia，P Natl Acad Sci USA，95：1460-1465(1998)和M.Zuker，Nucleic Acids Research，31：3406-3415(2003)。
图6显示了不同水平的所设计空间位阻的效应。对于具有最长接头的TEG+9T探针(空间位阻最低)，即使发夹关闭时，报道分子依然远离表面，从而报道分子和介导物之间可形成有效的复合物。因此，无靶和靶(IL-8)结合之间检测的输出值(差异)小，如“HP L3”标记的数据集所示。当通过除去发夹探针的接头二而将空间位阻设计成较高时，没有靶结合时报道分子非常接近表面，从而阻止有效介导物-报道分子复合物形成，因此检测到的背景噪声极低。与靶杂交后，报道分子与表面之间的距离增加，从而能形成复合物并有效地再生信号。信号改变极大并具有良好的信噪比。
测试了发夹探针对2种靶的特异性，参见图5。在互补和非互补RNA靶之间比较了各探针。非互补靶得到的信号只是空白信号的2倍标准偏差(SDV)。互补靶的信号是空白信号的20倍SDV。两种探针均在RNA水平显示良好的区分能力，IL-8是5nM，而S100A8是7nM。
SNR的控制与杂交效率
RNA传感器的主要问题是信噪比(SNR)。在本发明的发夹探针中，SNR取决于发夹探针的打开与关闭之比。通过没有靶结合时的充分关闭状态和与靶杂交后的完全打开状态可获得高SNR。对于分子内和分子间杂交，识别期间的这些关闭-或-打开状态需要高效率。
为增加杂交效率并优化本发明探针的SNR，通过改变茎长度和环长度来调节发夹结构。现已研究了茎-环长度不同的3种发夹探针(序列见图7的下部)。所有3种探针具有与靶RNA互补的3-端茎部分，以及环部分。从图7所示结果可知，具有最长茎和双链体的探针对于空白样品的信号最低，对于靶样品的信号最高。该结果表明没有靶结合时更好的关闭状态和与靶杂交时更好的打开状态导致高信噪比。具有短茎和双链体的探针不具有低背景和高信号。因此，利用发夹探针不难获得高SNR，因为高杂交效率不难促进灵敏度和特异性。相比之下，用传统线形探针难以找到优化的探针序列。长序列有助于杂交效率，但产生高背景，从而导致的灵敏度-特异性问题的抵触作用。
用发夹探针和线形探针检测唾液RNA：掺加和未掺加的样品
利用发夹探针可一致地检测唾液RNA生物标记。图8显示了电流信号的浓度关系。利用发夹探针IL-8和S100A8显示良好的SNR，但利用线形探针显示SNR差。有趣的是，信号强度既不与浓度呈线性，也不与浓度的对数呈线性。该现象通常来自复杂的表面化学。在本发明中，复杂的总反应中整合了数个反应，包括发夹探针的转换、杂交、蛋白质识别和酶促电化学反应。这不能以靶浓度的线性关系来简单描述。IL-8的检出限(LOD)约为1毫微微摩尔/升。对于线形探针，LOD只有约10皮摩尔/升。发夹探针对于S100A8的LOD约为1毫微微摩尔/升，线形探针的为10皮摩尔/升。
然后用发夹探针检测掺加唾液中的唾液RNA生物标记。数据示于图9。将不同浓度的RNA样品掺加入整个唾液。类似于纯化的IVT RNA样品，掺加的唾液也具有低LOD。这表明即使唾液中含有大量干扰物，发夹探针也可区分特异性靶RNA。LOD约为1毫微微摩尔，能够符合真正IL-8唾液诊断的要求。
与图8所示纯RNA样品结果相比，用唾液样品观察到明显的信号增加，特别是背景水平。掺加样品的阴性对照的电流远高于IVT RNA的。还观察到，与纯RNA的稳定信号水平相比，即使来自同一人的信号水平也随不同唾液样品而变。阴性对照的电流从几百nA到几千nA不等。信号增加的可能反应是唾液中除靶RNA以外的干扰性组分，例如高粘度的粘蛋白，其可导致以下HRP的非特异性结合或增强的特异性结合。参见N.J.Park等，Clin.Chem.，52：988-994(2006)。由于唾液中这些干扰物组分的浓度随样品而有所不同，电流强度因此而改变。因此，在一些实施方式中，RNA检测与溶解相组合以除去其它干扰物。
1.发夹探针的高信噪比的概念
在本发明中，高信噪比来自于夹心样检测与发夹探针的组合。夹心样检测的概念是应用介导物形成复合物，其目的是再生HRP以放大信号。首先，靶结合探针。然后，报道分子(荧光素)标记的探针与介导物(抗-荧光素-HRP)之间先形成复合物再进行检测。通过洗涤除去过量的介导物，加入TMB/H2O2底物以再生HRP从而放大信号。参见V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)；J.C.Liao等，J.Clin.Microbiol.，44：561-570(2006)。信号水平取决于复合物的数量和活性。由于金属电极与复合物之间的相互作用强，该表面看用作复合物形成的限制器以及报道分子活性的抑制物。能放大信号的这种复合物称为“有效复合物”。只有有效复合物能产生放大的信号。
在核酸的常规夹心检测中，利用两种线形寡核苷酸探针：一种是将靶固定在表面上的捕捉探针，另一种是含有报道分子以产生信号的检测探针。参见V.Gau等，Methods，37：73-83(2005)；E.Palecek等，Anal.Chim.Acta，469：73-83(2002)；H.Xie等，Anal.Chem.，76：1611-1617(2004)。因此，无论是否有介导物结合，非特异性和特异性靶均会增加背景并导致假阳性结果。为增加特异性，在发夹结构内引入空间位阻效应。发夹探针的特征在于其打开-或-未打开的两状态结构。当没有靶结合时，发夹探针处于关闭状态，因此，报道分子因为设计的空间位阻而不能与介导物形成有效复合物。结合特异性靶后，探针转化成打开状态，报道分子与介导物形成有效的复合物，从而导致信号放大。空间位阻设计简单而有效，从初始的两探针设计中除去了化学反应步骤，从而减少了进行实验的工作。由于该操作中信号读出只与报道分子和介导物之间形成复合物有关，检测的靶不含标记物。无标记物的检测不仅减少所用试剂的类型，还能进行实时和高通量检测。其可应用于微阵列和自动原位检测。
2.发夹探针设计的原则
发夹探针检测的基本概念是特异性放大信号的空间位阻设计。该设计有3个原则：1.稳定的发夹结构，可通过稳定的茎部分，即，发夹的长茎得以满足(N.L.Goddard等，Phys.Rev.Lett.，85：2400-2403(2000))；2.高杂交效率，可通过稳定的双链体部分，即，用于杂交的长序列得以满足(N.L.Goddard等，Phys.Rev.Lett.，85：2400-2403(2000))；3.报道分子的高空间位阻效应，可通过改变接头长度或引入更大的介导物来增加表面效应而得以满足。通过改变发夹探针结构来优化空间位阻效应，从而实现高SNR。
除发夹探针设计外，有两种其它方法增加表面空间位阻效应。一种是探针的表面密度。稠密包装的发夹探针的拥挤效应高于松散包装探针的。其增加了对HRP结合和HRP活性的限制性。然而，探针的表面浓度高时，靶的杂交也受到限制。寡核苷酸的松散分布得到高杂交效率。为得到最佳杂交，各探针和表面应具有最佳表面覆盖。如本文公开的，发夹探针的固定浓度为1×10-6到1×10-7M时获得良好结果。
其它因素是施加于电极的电势。由于寡核苷酸带大量负电荷，正电势可提高杂交并增加电极对链的吸引力。负电势使得双链体打开并将该链推离表面。在高正电势下，寡核苷酸会平躺在电极上，而在负电势下会伸入溶液中。参见U.Rant等，Biophys.J.，90：3666-3671(2006)。当探针在正电势下平躺在电极上时，对关闭和打开状态的探针的表面空间位阻几乎相同，因此，互补靶结合没有差别。参见R.G.Sosnowski，P Natl AcadSci USA，94：1119-1123(1997)。因此，就这点而言，应采用负电势。然而，少许正电势会将未结合的发夹探针维持在关闭状态并稳定含靶的双链体。这有助于获得高信噪比(数据未显示)。同时，负电势会破坏碱基对相互作用。如果施加太高的负电势，没有靶结合时发夹探针也会打开。参见F.Wei等，Langmuir，22：6280-6285(2006)。电流计检测的最佳电势非常重要并且对于发夹探针的序列组成具有高度敏感。参见F.Wei等，Langmuir，22：6280-6285(2006)。如本文所公开的，负电势(-200mV)下的检测得到良好的SNR。本领域技术人员不难为给定应用优化电势。
3.信噪比的考虑
此外，基于构象的传统检测通常是信号-关闭方法，与之相比，本发明的检测可以是信号-打开方法。参见C.H.Fan等，P Natl Acad Sci USA，100：9134-9137(2003)。信号-打开方法在背景值低时检测到信号增加，而信号-关闭方法在背景值高时检测到信号降低。在高数值时检测的误差通常大于在较低值时，因此，信号-打开方法具有更稳定的背景噪声水平。此外，信号-关闭方法中，信号降低的动肽范围受限于原始背景值。因此，信号-打开方法的检出限较高，测量误差较小并且更易于商业使用，因为其信号处理步骤少于信号-关闭方法。
实施例2：利用发夹探针(HP)的唾液mRNA电化学检测
根据空间位阻(SH)抑制非特异性信号并产生信号打开放大过程以供靶检测的原则设计探针。茎-环构象使探针末端的报道分子接近表面附近，并使其不能为介导物结合所用。靶结合打开探针的发夹结构，然后介导物可结合可接近的报道分子。利用辣根过氧化物酶(HRP)产生电化学信号。这种信号打开方法的特征在于基础信号低、阳性读出强以及动态范围大。通过发夹设计和电场控制SH。通过将电场控制施加于发夹探针，RNA的检出限约为0.4毫微微摩尔，比常规线形探针灵敏10,000-倍。用HP检测内源性IL-8mRNA，采用qPCR技术获得良好习惯性。所得的方法设置简单，通过减少步骤数而适于就地检测复杂体液，例如唾液中的特异性核酸序列。
引言
体液的分子分析为早期癌症检测和随后疗效的提高提供了可能性(Mandel，I.D.(1990)Journal of Oral Pathology & Medicine，19，119-125；Mandel，I.D.(1993)Journal of the American Dental Association，124，85-87；Wong，D.T.(2006)Journal of the American Dental Association，137，313-321)。肿瘤释放的分子标记有其途径进入血液和/或其它体液，特异性检测生物标记能以非侵入性和特异性的模式鉴定疾病(Gormally等.(2006)Cancer Research，66，6871-6876；Herr等.(2007)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica(美国国家科学院学报)，104，5268-5273)。不难以非侵入性方式得到唾液，与血液相比，收集唾液的患者不适性较低。此外，干扰性物质(细胞、DNA、RNA和蛋白质)和抑制性物质的水平较低，并且唾液中的复杂性低于血液中的。最近，在口腔癌mRNA标记的全面研究中显示了该优点(Li等.(2004)ClinicalCancer Research，10，8442-8450)。通过微阵列鉴定mRNA，按照已有的指导通过PCR(qPCR)验证(Pepe等.(2001)Journal of the National Cancer Institute，93，1054-1061)。检测唾液mRNA生物标记为唾液作为有价值的诊断液体增加了新的因素。在本项研究中，我们的目的在于开发原位检验唾液mRNA的独特方法。
电化学方法是RNA检测的就地诊断方法的优秀候选对象(Hahn等，(2005)Bioelectrochemistry，67，151-154)，不仅因为其灵敏度高，还因为仪器简单(Liao和Cui(2007)Biosensors & Bioelectronics，23，218-224；Wei等，(2005)Journal ofthe American Chemical Society，127，5306-5307；Wei等，(2006)Langmuir，22，6280-6285；Wei等，(2003)Biosensors & Bioelectronics，18，1157-1163；Wei等，(2003)Biosensors & Bioelectronics，18，1149-1155)。然而，由于唾液生物标记的浓度低(约毫微微摩尔)并且唾液的背景复杂，常规电化学电流计检测方法不能符合在唾液中直接检测RNA的高信噪比(SBR)临床诊断要求。
最近，Plaxco课题组报道了应用氧化还原-标记的发夹探针来检测包括血清和尿液在内的各种体液中的寡核苷酸的新型方法(Lubin等，(2006)AnalyticalChemistry，78，5671-5677；Xiao等，(2006)Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(美国国家科学院学报)，103，16677-16680)。该方法成功证明发夹探针(HP)可用作电化学反应期间关闭和打开状态之间的开关。这些结果显著改善了灵敏度和特异性。就唾液诊断而言，唾液中RNA生物标记的拷贝数低要求高灵敏度的传感器来检测背景噪声之上的信号。在本文，我们提出了基于HP探针将酶促放大过程与靶诱导构象变化偶连的方法。该HP包含环组分和茎组分，所述环组分具有与靶互补的序列，而所述茎组分用报道分子在一端作了标记。没有靶结合时，传感器表面附近产生空间位阻(SH)，从而通过阻止介导物接近探针报道分子标记而抑制了信号放大。生物识别组分验证了靶特异性后，该内在SH除去，使得报道分子标记接近介导物-过氧化物酶偶联物并产生电流信号。因此，只有特异性靶才能产生放大的电流，即使其拷贝数低并且存在于复杂的混合物中。可通过优化探针设计和表面电场来控制这种基于HP的电化学传感器的SH效应。我们的选择性放大方法抑制非特异性信号与背景水平，克服了开发就地核酸检测体系的关键障碍以供唾液RNA标记和其它普通应用。
材料与方法
寡核苷酸探针和RNA
定制合成HPLC-纯化的寡核苷酸(美国阿拉巴马州的操纵子公司(OperonInc.))。探针序列可形成发
夹结构。环和发夹茎的一半(3’端)含有靶识别序列，用生物素或生物素-TEG在5’端，用荧光素在3’端标记HP(详细结构见图10)。生物素标记物作为芯片表面的锚定物结合链霉亲和素，荧光素标记物能结合信号介导物。本发明人研究了连接探针和芯片表面的5’接头的以下构象：生物素接头、生物素-TEG、生物素-9胸苷(T9)和生物素-TEG-T9。生物素-TEG具有基于三乙二醇的混合极性的额外间隔臂，其含有连接生物素和寡聚链的氧原子。不同间隔臂设计可使得生物素更好地接近链霉亲和素，并可用作SH效应的长度可调接头。
有人提出干扰素8(IL-8)mRNA(NM_000584)(St John等，(2004)Archivesof Otolaryngology-Head & Neck Surgery，130，929-935)可用作口腔癌的唾液生物标记，并选其用于检测。出于确定该方法有效性的目的，体外转录(IVT)的IL-8RNA用作标准定量检测的靶。IVT RNA产生的细节描述于补充材料II部分。检测临床样品中的内源性mRNA。为检测唾液样品的内源性IL-8，通过在室温下1∶1地混合唾液与美国加利福尼亚州恰根公司(QIAGEN，California，USA)的AVL病毒裂解缓冲液15分钟来进行裂解过程。唾液收集和qPCR检测的细节描述于补充材料III-IX。
产生体外转录的RNA用作RNA标记
选择两种mRNA靶以供检测。有人提出干扰素8(IL-8)(mRNA，NM_000584)(St John等，(2004)Archives of Otolaryngology-Head & NeckSurgery，130，929-935)可用作口腔癌的候选生物标记。在唾液中高度表达的S100钙-结合蛋白A8(S100A8)(mRNA，NM_002964)在各电化学传感器上用作参比物，其不显示口腔癌相关性。
出于方法确定的目的，IL-8和S100A8的体外转录(IVT)RNA在本项研究中用作检测靶。采用两步骤产生IVT RNA：第一步是采用常规RT-PCR产生体外转录的模板，其中引物在正向引物的5’端具有20碱基核心T7启动子序列。对于IL-8，正向引物是5′-CTAATACGACTCACTATAGGGaaggaaaactgggtgcagag-3′，反向引物是5′-attgcatctggcaaccctac-3′。对于S100A8，正向引物是5′CTAATACGACTCACTATAGGGatcatgttgaccgagctgga-3′，反向引物是5′-gtctgcaccctttttcctga-3′。产物分别是177bp和159bp的双链DNA。用总的口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞系RNA作为模板进行常规RT-PCR，在含有50UMuLV逆转录酶(应用生物系统公司(Applied Biosystems))、20U RNA酶抑制剂(应用生物系统公司)、10mM dNTP和5纳摩尔随机六聚体的20μl逆转录反应混合物中合成cDNA。该混合物首先在25℃温育10分钟，然后在42℃逆转录45分钟，再于95℃进行最终灭活5分钟并于4℃冷却5分钟。1微升cDNA用于含400nM引物的20μl PCR反应中。PCR反应按照以下方案进行：95℃，3分钟，然后进行40轮的95℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，和72℃、最终延伸7分钟。在溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上检测RT-PCR产物。第二步是产生IVT RNA。按照生产商的使用说明书，利用英杰公司的T7MEGA简易转录试剂盒(T7 MEGAshort transcribe kit)进行体外转录。简言之，37℃，体外转录第一步的8μl PCR产物3小时，然后用2μl rDNA酶1(英杰公司)额外处理20分钟。用加利福尼亚州芒廷维尤市大角星公司的清理设备(Arcturus，Mountain View，CA)纯化得到的单链RNA转录物。用Nanodrop分光光度法定量测定重组RNA的质量和A260/A280之比。将得到的RNA溶解于含面包酵母tRNA(30μg/ml，罗氏公司)作为运载体的无RNA酶蒸馏水(英杰公司)中。
唾液收集
按照我们公布的方案(Li，Yang 2004)收集未刺激的全唾液。简言之，收集所有唾液样品，同时维持在冰上。收集后，室温下将加利福尼亚州巴伦西亚市恰根公司(QIAGEN，Valencia，CA)的RNAlater以1∶1(体积)比加入唾液样品并通过涡流混合。将RNAlater以1∶1与全唾液混合并将样品保存在-80℃能迅速而充分地抑制唾液RNA降解。-80℃保存样品试样以待随后使用。
提取唾液总RNA
按照以下方法提取总RNA：在冰上融化保存在RNAlater中的冷冻唾液，除了以下例外之处，按照生产商的使用说明用恰根公司的病毒迷你试剂盒提取总RNA：为与以前报道的方法(Li，Yang，2004)相当，利用两倍起始体积的唾液RNAlater混合物(2×560ul)以弥补RNAlater所致的唾液稀释作用。用40μl洗脱缓冲液洗脱得到的总RNA，37℃，用美国德克萨斯州奥斯丁市安拜恩公司的rDNA酶1在含有40μl RNA、4.5μl 10×DNA酶I缓冲液、0.5μl rDNA酶I的溶液中处理30分钟以除去任何基因组DNA污染。用DNA酶灭活物清理后，回收最多35μl总RNA，-80℃冷冻待用。
引物设计
利用引物3程序设计解链温度约为60℃的IL8的跨内含子引物对。OF和OR是RT-PCR的引物，IF和IR为qPCR设计。
IL8_IF   IL8  IF    CCAAGGAAAACTGGGTGCAG
IL8_IR   IL8  OR    CTTGGATACCACAGAGAATGAATTTTT
IL8_OF   IL8  OF    TTTCTGATGGAAGAGAGCTCTGTCT
IL8_OR   IL8  IR    ATCTTCACTGATTCTTGGATACCACA
RT-PCR预放大
在20-40μl反应体系中，用加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司的SuperScript III铂一步qRT-PCR系统(SuperScript III Platinum One-StepqRT-PCR System，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行一步RT和PCR预放大，所有靶的引物浓度为300nM。利用BioMek 3000液体操控平台，在PCR平板冷却仪的96孔板内建立该反应体系，然后按照以下程序进行：60℃、1分钟，50℃、15分钟，95℃、2分钟，和15轮的95℃、15秒，50℃、30秒和60℃、10秒以及72℃、10秒，72℃最终延伸5分钟并冷却至4℃。
预放大反应的清理
RT-PCR后，37℃，立即用2μl俄亥俄州克里夫兰市USB公司的Exo-SAP-
Figure GPA00001010997700261
处理5μl反应液15分钟以除去过量引物和dNTP，然后加热至80℃，15分钟以灭活酶混合物。除非另有报道，用无核酸酶的水将反应液稀释40倍。稀释因子值Exo-SAP-IT处理前预放大物的体积。
定量实时PCR
利用BioMek 3000液体操控平台，在96孔板内自动建立所有反应体系。用300nM的一对半巢式试验扩增4μl预放大稀释液试样。在冰上配制含有加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司的SYBR绿色强力反应混合物(SYBRGreen Power reaction mix，Applied Biosystems(AB)，Foster City，CA)的10μl反应体系，在SDS 7500快速仪器(AB)中运行。95℃活化聚合酶10分钟后，进行40轮的95℃、15秒和60℃、60秒，然后进行解链曲线分析。
qPCR分析
利用7500快速系统1.3.1版本软件(AB)的自动基线设置进行qPCR分析。
表面处理
如下所示进行金电化学传感器的表面处理(Gau等，(2001)Biosensors &Bioelectronics，16，745-755；Gau等，(2005)Methods，37，73-83)：
探针固定化：金电极用羧基封端的巯基十一烷酸(MUDA)自装配单层(18)预涂布。用50％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，毕埃可公司，新泽西州，美国)和50％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(毕埃可公司)的4μL混合物活化金表面10分钟。用DI水(18.3MΩ·cm)清洗传感器，用氮气干燥。将总共4μL的5mg/mL胺-PEO2-生物素标记试剂(Ez-生物素)(美国伊利诺斯州皮尔斯公司)加载于金表面，然后清洗和干燥。加载乙醇胺-HCl(1.0M，pH 8.5，毕埃可公司)以使未反应的EDC/NHS活化表面灭活。然后，将PBS(pH 7.2，英杰公司，加利福尼亚州，美国)配制的0.5mg/mL链霉亲和素(VWR公司，加利福尼亚州，美国)在电极上温育10分钟以产生涂布有链霉亲和素的电极。然后通过表面上的链霉亲和素与探针上的生物素标记物之间的相互作用将Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，英杰公司，加利福尼亚州，美国)配制的4μL 5′-生物素化和3′-荧光素双重标记的HP在电极上固定30分钟。据报道，采用该固定化方法获得的寡聚探针的表面密度约为3.4×1012分子/cm2(Su等，(2005)Langmuir，21，348-353)。用DI水彻底清洗除去过量HP，用氮气干燥。
靶杂交：将该表面与在含有10mM MgCl2(西格玛公司，密苏里州，美国)的6×盐水-柠檬酸钠缓冲液(6xSSC，0.09M柠檬酸钠，含0.9M NaCl，pH 7.0，英杰公司，加利福尼亚州，美国)中配制的含靶样品温育5分钟。杂交期间，施加30轮循环方波电场：+200mV、1秒和-300mV、90秒。杂交后，用DI水清洗电极，氮气干燥。
电化学检测
按照生产商的使用说明书，利用电化学工作站进行电化学读出。简言之，将用含0.5％酪蛋白封闭缓冲液(PBS配制的封闭剂酪蛋白，皮尔斯公司，pH7.4)的PBS稀释的抗-荧光素-HRP(罗氏公司，印第安纳州，美国)加入HP或检测探针上的荧光素标记物。然后，加载3，3′，5，5′四甲基联苯胺低活性(TMB/H2O2，尼金公司，肯塔基州，美国)底物，通过给各金电极单位施加-200mV电压，平衡60秒后平行读出信号以进行电流分析检测(Gau等，(2001)Biosensors & Bioelectronics，16，745-755；Gau等，(2005)Methods，37，73-83)。
电化学传感器是16-单位金阵列。每个单位有三个电极，包括工作电极(WE)、对电极(CE)和参比电极(RE)(Gau等，(2005)Methods，37，73-83)。通过检测0.1mM[Fe(CN)6]3-/4-的循环伏安曲线(cyclic voltammetric curve)确定参比电极对SCE为+218mV。该报道所述的所有电势是以金参比电极为参照的(+218mV对SCE)。该小电极阵列的优点是可同时获得16个电极的信号读出值，并且检测只需要4μL样品溶液。在我们的实验中，电化学信号是HRP报道酶氧化还原所产生的电流。TMB通过2-电子步骤不停再生还原的HRP，从而放大电流信号。电流与杂交靶的表面浓度成比例(Gau等，(2005)Methods，37，73-83)。所有实验在室温下进行。
结果与讨论
1.发夹-诱导的特异性放大
通过借助HRP和TMB/H2O2的夹心样信号放大与借助HP设计的选择性杂交的组合来实现利用电流方法检测特异性靶。该方法基于SH效应：接近HP的表面抑制HRP偶联物结合不含靶的探针。因此，表面和探针上报道标记物之间的距离是检测方法的关键因素。靶结合后，HP打开，报道分子远离表面，导致表面的限制作用降低。偶连的HRP结合于荧光素并产生电流，从而构成信号打开过程。
比较了显示SH水平不同的含和不含接头的4种IL-8特异性HP，所述SH水平不同是因为报道分子与电极表面之间的距离不同所致(表3)。通过5’-生物素标记端的突出间隔臂(T9)或TEG的长度调节接头的长度和灵活性。分子力学计算(MM2)得到生物素-TEG的径向尺寸是约3nm(Allinger，N.L.(1977)Journal of the American Chemical Society，99，8127-8134)。未施加作用力时单链DNA在电极上处于卷曲状态。当在负电势下进行电化学检测时，卷曲(的DNA)可能会伸直，从而能结合偶联物(Rant等，(2006)Biophysical Journal，90，3666-3671；van Oijen等，(2003)Science，301，1235-1238)。虽然T9接头的实际长度不清楚，但如果双链体DNA是9bp×0.28nm/bp，其在负电势下应该长于3nm。按照蛋白质晶体数据，HRP尺寸是约4×6.7×11.8nm(Berglund等，(2002)Nature，417，463-468)。
图6显示了不同HP设计的SH效应。对于具有最长接头的探针(TEG-T9)，即使发夹关闭时，荧光素依然远离表面。介导物复合物形成，SH效应非常低。与靶杂交只增加了HRP复合物与电极的距离。因此，结合后信号降低，识别导致非常弱的信号关闭过程(图6)。4种探针的靶结合信号水平相似，空白信号随接头长度减少而降低。对于不含接头的HP，报道分子以关闭状态非常接近表面。因此，SH效应非常强，观察到最低的背景(SBR＝8.1)。
2.特异性
检验了不含接头的HP与2种靶交叉反应的特异性，结果示于图11。我们利用在唾液中高度表达而且没有口腔癌相关性的S100钙结合蛋白A的mRNA(S100A8mRNA，NM_002964)作为参比对照。对于各探针，在互补和非互补IVT RNA靶之间进行比较，IL-8的浓度是5nM和500nM，S100A8的浓度为7nM和700nM。对于IL-8-和S100A8-特异性探针，即使非互补靶过表达100倍，信号增加也不多。互补靶信号是空白对照的20倍标准偏差(SDV)以上。两种探针均显示良好的RNA区分能力，IL-8是5nM，而S100A8是7nM。
3.控制SBR以及杂交效率
RNA传感器的主要问题是SBR。在目前的HP设计中，SBR取决于打开或关闭HP的数量之比。没有特异性靶结合时背景水平与关闭状态有关，靶杂交后从打开状态产生信号。识别期间这些关闭或打开的状态要求高效率的分子内和分子间杂交。
为增加杂交效率并优化该传感器的SBR，我们通过改变茎和环长度修饰了发夹结构。研究了茎环长度不同的三种HP(序列见表4)。在所有三种探针中，3’-端茎组分连同环与靶RNA互补。具有短茎(6bp)和双链体(21+6bp)的探针的背景高而信号低(图7中的HPS3)。具有最长茎(10bp)和双链体(10+31bp)的探针的空白信号最低而靶信号最高(HPS1)，表明没有靶结合时更好的关闭状态，与靶杂交时更好的打开状态。互补HP序列包含完整的环和茎的一半，从而在靶杂交后提供较低自由能。因此，一旦靶与环结合，即使非常长的茎也能因其序列与靶互补而打开。由于高杂交效率同时有益于灵敏度和特异性，从而能实现良好的SBR。相比之下，用传统线形探针(LP)难以确定优化的探针序列(Liao等，(2006)Journal of Clinical Microbiology，44，561-570)。长序列有助于杂交效率，但产生高背景。
4.检测唾液中掺加的RNA
通过合适的HP设计和SH效应的协助，可在靶浓度的各种动态范围上检测唾液RNA生物标记序列。图12显示缓冲液中浓度与电流信号之间的关系。为进行比较，还采用以前公布的方法(Liao等，(2006)Journal of ClinicalMicrobiology，44，561-570)检测了含各靶的两种LP的原始系统。简言之，将两种探针设计成与靶序列的毗邻延伸段互补。将“捕捉探针”固定在电极上，并含有5’端生物素标记。“检测探针”具有3’荧光素标记以结合抗-荧光素-HRP。我们的结果显示用HP检测IL-8得到良好的SBR，但用LP观察到性能不佳。
检出限(LOD)定义为信号为背景水平之上至少2SDV的浓度。根据该标准，HP的LOD约为0.4毫微微摩尔。对于LP，IL-8的LOD约为400皮摩尔，比HP约高10,000倍(图12)。
5.检测唾液中的内源性mRNA
然后我们检测了唾液样品中的内源性IL-8mRNA。观察到不同唾液样品之间有信号水平改变。采用本发明的优化HP设计检测7种临床唾液样品中的IL-8mRNA。由于唾液中的内源性mRNA混合了会遮蔽检测的其它大分子，先进行裂解过程在进行电化学试验以释放遮蔽的RNA。在唾液样品的电化学信号与qPCR结果之间观察到良好相关性，如图13所示。如qPCR检测所测定的，在含有较高水平的IL-8mRNA的唾液样品中观察到较高电化学信号。除了PCR检测，这些结果支持了唾液中存在mRNA。这些结果还说明无需PCR扩增可通过电化学方法检测唾液中的内源性mRNA，这满足就地唾液诊断的灵敏度要求。
采用各种电化学相关方法检测DNA寡核苷酸达到fM范围的LOD。这些方法包括纳米颗粒连接的二级探针(Park等，(2002)Science，295，1503-1506)、采用多步还原方法沉积的银纳米颗粒的阳极剥离伏安法(Hwang和Kwak(2005)Anal Chem，77，579-584)和基于靶诱导链置换机制的电子DNA传感器(Xiao等，(2006)Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America(美国国家科学院学报)，103，16677-16680)。与寡聚物相比，mRNA具有更长的序列和更复杂的二级结构。为捕捉特异性mRNA靶，必须小心选择mRNA的特征性片段。二级mRNA结构可减弱捕捉探针与靶之间的杂交作用。在本项研究中，本发明人选择通过M倍(Mfold)网络服务器计算得到的二级结构最低的mRNA片段(Zuker，M.(2003)Nucleic Acids Research，31，3406-3415)。探针设计还要求充分考虑环序列、茎长度和探针二级结构。考虑到RNA的内在2-D或3-D结构，以下原理适用于线形和发夹探针设计：
(1)应考虑探针对靶mRNA:mRNA二级结构的亲和力和与靶RNA互补的探针序列的二级结构，包括四重和发夹(探针)。根据四重和M-倍(M-fold)计算值选择没有稳定二级结构的序列。还要根据热力学计算值考虑自-二聚体的形成和杂交稳定性。
(2)对于最佳发夹探针性能，将茎的一半(3’端)连同环设计成与靶RNA互补。由于本项研究中所有HP的茎的5’端通过生物素-链霉亲和素固定在表面上，杂交过程中只有3’茎是自由的。对于双链体形成，共享茎的3’端与环导致杂交效率较高而SH效应变化更大。
总之，本发明人开发了以高灵敏度、高特异性和大动态范围(缓冲液体系和掺加唾液中fM-nM)地利用HP的电化学检测mRNA的有效方法。本发明人还证明该技术对于直接检测内源性mRNA而无需PCR扩增能良好起作用。
表3.IL-8和S100A8的寡核苷酸序列
Figure GPA00001010997700321
*通过M倍(Mfold)免费网络服务器计算发夹探针设计(27，28)。
Figure GPA00001010997700322
靶识别序列见斜体字。发夹的茎部分由下划线标出。
Figure GPA00001010997700323
IL-8CP是双探针检测中含生物素标记的捕捉探针。IL-8DP是双探针检测中含荧光素标记的检测探针。
表4.具有不同茎-环结构的IL-8HP的寡核苷酸序列
Figure GPA00001010997700324
*所有探针用5′-生物素和3′-荧光素作双重标记。
通过M倍(Mfold)免费网络服务器计算发夹探针设计(27，28)。
Figure GPA00001010997700326
靶识别序列见斜体字。发夹的茎部分由下划线标出。
本申请引用的所有专利、专利申请和其它出版物，包括公布的氨基酸或多核苷酸序列出于所有目的通过引用全文纳入本文。

Claims (25)

1.一种用于靶核酸分子的探针，该探针包含与靶核酸分子的序列特异性杂交的多核苷酸序列和受体的配体，当没有靶核酸分子与其结合时，所述探针具有第一三维结构，当有靶核酸分子与其结合时，所述探针具有第二三维结构，其中所述第一三维结构抑制或阻止该受体结合该配体，而所述第二三维结构允许该受体特异性结合该配体。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述受体包含可检测标记物。
3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，来自可检测标记物的检测信号被放大。
4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述第一三维结构对所述受体结合所述配体具有空间位阻作用。
5.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针固定在基材上。
6.如权利要求5所述的探针，其特征在于，所述第一三维结构将所述配体置于接近所述基材的位置，从而抑制或阻止所述受体结合所述配体。
7.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述受体是特异性结合所述配体的抗体。
8.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述可检测标记物是荧光素、链霉亲和素或生物素。
9.如权利要求3所述的探针，其特征在于，通过过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或脲酶放大检测信号。
10.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针是发夹探针或四重探针。
11.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述靶核酸分子是IL-8核酸。
12.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述多核苷酸序列选自表2-4。
13.一种检验样品中靶核酸分子的方法，所述方法包括：
将权利要求1所述探针与所述样品和受体接触，和
检测所述配体和所述受体之间的复合物存在与否，
其中存在所述复合物表明所述样品中存在所述靶核酸分子，不存在复合物表明所述样品中不存在所述靶核酸分子。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述受体包含可检测标记物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括放大来自可检测标记物的检测信号。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一三维结构对所述受体结合所述配体具有空间位阻作用。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述探针固定在基材上。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一三维结构将所述配体置于接近所述基材的位置，从而抑制或阻止所述受体结合所述配体。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述受体是特异性结合所述配体的抗体。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述可检测标记物是荧光素、链霉亲和素或生物素。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，通过过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或脲酶放大来自可检测标记物的检测信号。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述探针是发夹探针或四重探针。
23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，还包括先除去未与所述配体结合的任何受体，再检测所述复合物。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶核酸分子是IL-8核酸。
25.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸序列选自表2-4。
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