CN109406596B - 一种检测microRNA-21的电化学传感器、其制备方法及应用 - Google Patents

一种检测microRNA-21的电化学传感器、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测microRNA‑21的电化学传感器、其制备方法及应用。本发明首先将5’末端标记有生物素的DNA串联体锚定在电极表面，作为主体结构的DNA串联体然后通过链霉亲和素‑生物素的特异识别组装富G‑四链体线为分支结构；然后加入G四链体单体与G‑四链体线π‑π堆叠，自组装形成多分支DNA纳米结构，得到的DNA纳米组装体可与氯化血红素紧密结合，从而产生氧化还原信号用于miRNA‑21的电化学检测。本发明具有很好的miRNA‑21检测灵敏度，而且具有优良的特异性，可区分目标核酸分析物的单碱基突变与完全匹配的目标RNA，并对实际生物样品进行分析，是通用型DNA纳米生物传感器平台。

Description

一种检测microRNA-21的电化学传感器、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生命健康以及医学分析领域，具体涉及癌细胞中microRNA-21的检测方法，尤其涉及一种基于DNA串联体和富G-四链体线的多分支DNA纳米组装体超灵敏检测microRNA-21的电化学传感器及检测方法。
背景技术
microRNA是一类小的内源性非编码RNA，是基因表达，细胞周期和生物发育等各种生物过程的关键参与者。在过去二十年里，microRNA在生物学领域的研究已经广泛开展。基础研究表明microRNA的改变可能导致许多疾病的发生，特别是对于癌症，microRNA作为肿瘤抑制因子或致癌基因，可成为新型生物标志物，在肿瘤早期诊断和临床应用中发挥具有十分重要的研究价值。因此，可靠、准确的microRNA分析检测方法对于人类了解microRNA功能以及降低人类癌症的发病率和死亡率具有重要作用。对于microRNA检测，现已具有的常规方法包括定量逆转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR)，Northern印迹技术和微阵列。然而，这些检测策略仍存在一些不可避免的缺点。如qRT-PCR技术耗时、昂贵；Northern印迹技术具有交叉污染和操作复杂性的高风险；微阵列方法存在灵敏度低且特异性差等问题。此外，microRNA由于序列短、表达量低、家族成员的高序列同源性及对降解的易感性等固有特征，极大地限制了microRNA的直接分析检测。因此，microRNA的定量和定性检测依然具有很大的挑战性。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于DNA串联体和富G-四链体线的多分支DNA纳米组装体超灵敏检测microRNA-21的电化学传感器及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种基于DNA串联体和富G-四链体线的多分支DNA纳米组装体进行microRNA-21超灵敏电化学检测的新方法。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种检测microRNA-21的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述制备方法包括：
使活化处理的捕获探针与作为工作电极的金电极接触，并孵育，之后将巯基己醇施加于所述金电极上孵育封闭空白位点；
采用杂交链式反应的方法构建DNA串联体，以及采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶延伸DNA的方法制备富G-四链体线；
将DNA串联体施加于所述金电极表面孵育，并与链霉亲和素溶液相互作用；
将生物素标记的富G-四链体线施加在所述金电极表面，所述生物素能够与所述链霉亲和素特异性识别，在DNA串联体上组装富G-四链体线作为分支结构；以及，
加入G-四链体单体与所述富G-四链体线通过π-π堆叠结合，自组装形成多分支DNA纳米组装体，之后用氯化血红素处理，在所述金电极上形成G-四链体/氯化血红素复合物。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的检测microRNA-21的电化学传感器。
本发明实施例还提供了前述的检测microRNA-21的电化学传感器于microRNA-21检测领域中的用途。
本发明实施例还提供了一种检测microRNA-21的检测系统，其包括前述的检测microRNA-21的电化学传感器。
本发明实施例还提供了一种检测microRNA-21的电化学方法，其包括：
将一系列不同浓度的标准microRNA-21溶液与前述的检测microRNA-21的电化学传感器接触，通过差分脉冲伏安法进行检测，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以差分脉冲伏安法的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线；
使含有microRNA-21的测试样品与所述的检测microRNA-21的电化学传感器接触，通过差分脉冲伏安法进行检测，所得差分脉冲伏安法的信号值与所述标准曲线对照，测得测试样品中microRNA-21的浓度。
与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：
1)本发明提供的基于DNA串联体和富G-四链体线组成的多分支DNA纳米组装体超灵敏检测microRNA-21的电化学方法具有很好的miRNA-21检测灵敏度，其检测限为0.2fM，动态响应范围为10fM至100nM；
2)本发明提供的电化学生物传感器具有优良的特异性，可将目标核酸分析物的单碱基突变与完全匹配的目标RNAmicroRNA-21区分开来；
3)本发明提供的检测microRNA-21的电化学方法可对实际真实的生物样品进行分析，是通用型的DNA纳米生物传感器的理想平台。
附图说明
图1为本发明实施例1中microRNA-21标准品溶液检测得到的标准曲线图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的microRNA检测的操作复杂性，检测限灵敏度不够高等问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。
本发明具体的技术解决方案如下：在microRNA-21存在的情况下，首先将5’末端标记有生物素的DNA串联体锚定在电极表面，作为主体结构的DNA串联体然后通过链霉亲和素-生物素的特异识别组装富G-四链体线为分支结构。然后进一步加入G四链体单体与G-四链体线π-π堆叠，自组装形成多分支DNA纳米结构。得到的DNA纳米组装体可与Hemin紧密结合，从而产生氧化还原信号用于miRNA-21的电化学检测。通过DPV电流信号值与microRNA-21浓度之间的线性变化关系，建立检测microRNA-21的超灵敏电化学方法。
本发明实施例的一个方面提供了一种检测microRNA-21的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述制备方法包括：
使活化处理的捕获探针与作为工作电极的金电极接触，并孵育，之后将巯基己醇施加于所述金电极上孵育封闭空白位点；
采用杂交链式反应的方法构建DNA串联体，以及采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶延伸DNA的方法制备富G-四链体线；
将DNA串联体施加于所述金电极表面孵育，并与链霉亲和素溶液相互作用；
将生物素标记的富G-四链体线施加在所述金电极表面，所述生物素能够与所述链霉亲和素特异性识别，在DNA串联体上组装富G-四链体线作为分支结构；以及，
加入G-四链体单体与所述富G-四链体线通过π-π堆叠结合，自组装形成多分支DNA纳米组装体，之后用氯化血红素处理，在所述金电极上形成G-四链体/氯化血红素复合物。
进一步地，所述制备方法包括：在室温下，将TCEP与捕获探针孵育，获得活化处理的捕获探针。
进一步地，所述捕获探针CP的序列如SEQ ID NO:1所示，Sequence(5’-3’)为CTGATA AGC TAT T-SH。
进一步地，所述制备方法包括：将活化处理的捕获探针滴加于金电极上，并于4～8℃孵育12～16h，之后将巯基己醇滴加于所述金电极上，并于25～37℃孵育0.5～1h，以封闭空白位点。
进一步地，所述制备方法包括：将第一探针集和第二探针集在90～95℃变性5～10min，之后冷却至25～37℃杂交自组装形成DNA串联体，所述第一探针集的序列如SEQ IDNO:2所示，为TGACTACAACTTCAACATCAGT-Biotin，所述第二探针集的序列如SEQ ID NO:3所示，为AGTTGTAGTCAACTGATGTTGA-Biotin。
进一步地，所述制备方法包括：将EP探针、dNTP、TdT与缓冲液混合均匀，并在25～37℃进行延伸反应1～2h，之后在90～95℃加热3～5min终止反应，并在HEPES缓冲液中于25～37℃孵育20～40min，形成富G-四链体线，所述EP探针的序列如SEQ ID NO:4所示，为Biotin-TTTTTTCAGCGGAGGCG。
进一步地，所述制备方法包括：将DNA串联体施加于所述金电极表面于25～37℃孵育1～1.5h，并与链霉亲和素溶液相互作用15～30min；
将生物素标记的富G-四链体线施加在所述金电极表面，并使其与所述链霉亲和素反应15～30min，以及，加入G-四链体单体与所述富G-四链体线通过π-π堆叠结合1～1.5h，自组装形成多分支DNA纳米组装体，之后用氯化血红素处理20～30min，在所述金电极上形成G-四链体/氯化血红素复合物。
进一步地，所述G-四链体单体的序列如SEQ ID NO:5所示，为AGGGTGGGGAGGGTGGGG。
进一步地，所述的制备方法还包括：对所述金电极进行打磨抛光处理、超声处理和电化学扫描清洗处理。
进一步地，所述参比电极包括银/氯化银电极，所述对电极包括铂丝电极。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的检测microRNA-21的电化学传感器。
优选的，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极包括金电极，所述金电极表面形成有多分支DNA纳米组装体，所述多分支DNA纳米组装体包括作为主体结构的DNA串联体，以及，作为分支结构的富G-四链体线。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的检测microRNA-21的电化学传感器于microRNA-21检测领域中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测microRNA-21的检测系统，其包括前述的检测microRNA-21的电化学传感器。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种检测microRNA-21的电化学方法，其包括：
将一系列不同浓度的标准microRNA-21溶液与前述的检测microRNA-21的电化学传感器接触，通过差分脉冲伏安法进行检测，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以差分脉冲伏安法的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线；
使含有microRNA-21的测试样品与所述的检测microRNA-21的电化学传感器接触，通过差分脉冲伏安法进行检测，所得差分脉冲伏安法的信号值与所述标准曲线对照，测得测试样品中microRNA-21的浓度。
进一步地，所述电化学方法的操作步骤如下：(1)电化学检测用金电极的前期准备；(2)DNA多联体的自组装和富G-四链体线的制备；(3)对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线；(4)对含microRNA-21的实际样品进行定量检测。
进一步地，本发明利用DNA串联体和富G-四链体线的多分支DNA纳米组装体超灵敏检测microRNA-21的电化学方法，具体操作步骤如下：
(1)电化学检测用金电极的前期准备：①金电极先用0.05μm的氧化铝浆料打磨抛光处理5min，然后用超纯水彻底冲洗，除去非特异性吸附在金电极表面的氧化铝粉末；②将金电极浸泡在准备好的piranha溶液(H2SO4/H2O2，体积比3：1)中30min，然后用超纯水彻底冲洗并用乙醇和超纯水超声处理5min以除去任何剩余的杂质；③在0.5M H2SO4溶液中设定扫描电位为-0.2和1.5V，并以100mV/s的扫描速率对电极进行电化学扫描清洗，直到获得稳定的伏安峰；④用超纯水冲洗电极并在氮气流中吹干；⑤将预先活化处理的探针(在室温下，2.5μL 1mM TCEP与5μL 1μM捕获探针CP孵育30min)滴加在处理后的Au工作电极上，并在4～8℃孵育12～16h；⑥将5μL的1.0mM巯基己醇(MCH)滴加在电极上25～37℃孵育0.5～1h封闭空白位点。⑦用超纯水冲洗电极，用氮气吹干，放置在4℃冰箱后续使用。
(2)DNA串联体的自组装和富G-四链体线的制备：采用杂交链式反应的方法构建DNA多联体([AP1+AP2]n)，具体方法为将5μL 2μΜ AP1和5μL 2μΜ AP2在90～95℃变性5～10min，然后缓慢冷却至25～37℃杂交自组装形成DNA串联体([AP1+AP2]n),获得的DNA串联体直接用于电极表面组装。采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)延伸DNA的方法制备富G-四链体线，具体方法为将5μL 2μM EP探针，2μL 10mM dNTP(摩尔比dGTP：dATP＝7：3)，1μLTdT(10U))与2μL缓冲液加入离心管中并在25～37℃下保持1～2h进行延伸反应，之后在90～95℃加热3～5min终止反应，并在HEPES buffer中25～37℃孵育20～40min形成富G-四链体线。
(3)对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：对于电化学检测，首先在准备好的电极上滴加5μL不同浓度的miRNA-21。随后，将已形成的DNA串联体(5μL)滴到电极表面25～37℃孵育1～1.5h，并进一步与链霉亲和素(SAV)溶液(5μL，10ng/μL)相互作用15～30min。紧接着，将生物素标记的富G-四链体线(5μL，1μM)滴在电极表面上并使其与SAV反应15～30min。最后，加入5μL浓度为1μM的G-四连体单体GU使之与富G-四链体线结合1～1.5h，形成更多的富G-四链体线。所得电极用5μL浓度为0.2mM氯化血红素(Hemin)处理20～30min以形成G-四链体/Hemin复合物，并用于电化学检测。电极组成为银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，DNA组装体修饰的金电极为工作电极；电解液为20mMHEPES溶液(50mM KCl，200mM NaCl，pH8.0)；测试方法为差分脉冲伏安法(DPV)，脉冲幅度和周期分别设置为50mV和50ms。在此基础之上，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以DPV的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线；
(4)对含microRNA-21的实际样品进行定量检测：将未知浓度的microRNA-21作为检测目标，按照(3)中相同处理方法进行DPV检测，所得DPV数值带入microRNA-21检测的标准曲线，计算出microRNA-21的浓度。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
(1)金电极的前期准备：①金电极先用0.05μm的氧化铝浆料打磨抛光处理5min，然后用超纯水彻底冲洗，除去非特异性吸附在金电极表面的氧化铝粉末；②将金电极浸泡在准备好的piranha溶液(H2SO4/H2O2，体积比3：1)中30min，然后用超纯水彻底冲洗并用乙醇和超纯水超声处理5min以除去任何剩余的杂质；③在0.5M H2SO4溶液中设定扫描电位为-0.2和1.5V，并以100mV/s的扫描速率对电极进行电化学扫描清洗，直到获得稳定的伏安峰；④用超纯水冲洗电极并在氮气流中吹干；⑤将预先活化处理的探针(在室温下，2.5μL 1mMTCEP与5μL 1μM捕获探针CP孵育30min)滴加在处理后的Au工作电极上，并在4℃下孵育12h；⑥将5μL的1.0mM巯基己醇(MCH)滴加在电极上37℃孵育0.5h封闭空白位点。⑦用超纯水冲洗电极，用氮气吹干，放置在4℃冰箱后续使用。
(2)DNA多联体的自组装和富G-四链体线的制备：采用杂交链式反应的方法构建DNA多联体([AP1+AP2]n),具体方法为将5μL 2μΜ AP1和5μL 2μΜ AP2在95℃变性5min,然后缓慢冷却至37℃杂交自组装形成DNA串联体([AP1+AP2]n),获得的DNA串联体直接用于电极表面组装。采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)延伸DNA的方法制备富G-四链体线，具体方法为将5μL 2μM EP探针，2μL 10mM dNTP(摩尔比dGTP：dATP＝7：3)，1μL TdT(10U))与2μL缓冲液加入离心管中并在37℃下保持1h进行延伸反应，之后在95℃加热3min终止反应，并在HEPES buffer中37℃孵育20min形成富G-四链体线。
(3)对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：对于电化学检测，首先在准备好的电极上滴加5μL不同浓度的miRNA-21。随后，将已形成的DNA串联体(5μL)滴到电极表面37℃孵育1h，并进一步与链霉亲和素(SAV)溶液(5μL，10ng/μL)相互作用15min。紧接着，将生物素标记的富G-四链体线(5μL，1μM)滴在电极表面上并使其与SAV反应15min。最后，加入5μL浓度为1μM的G-四连体单体GU使之与富G-四链体线结合1h，形成更多的富G-四链体线。所得电极用5μL浓度为0.2mM氯化血红素(Hemin)处理20min以形成G-四链体/Hemin复合物，并用于电化学检测。电极组成为银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，DNA组装体修饰的金电极为工作电极；电解液为20mM HEPES溶液(50mM KCl，200mMNaCl，pH8.0)；测试方法为差分脉冲伏安法(DPV)，脉冲幅度和周期分别设置为为50mV和50ms。在此基础之上，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以DPV的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线，如图1所示。
(4)对microRNA-21掺入的人血清进行定量检测：将已知浓度的microRNA-21(1pM，10pM，100pM，1000pM)添加到10％正常人血清作为检测目标，按照(3)中相同处理方法进行DPV检测，所得DPV数值带入microRNA-21检测的标准曲线，计算出microRNA-21的浓度(0.97pM，10.06pM，99.43pM，1005.94pM)。
本实施例中电化学检测过程中所用的探针序列如下表1所示。
表1：电化学检测过程中所用的探针序列
Figure BDA0001903782280000071
实施例2
(1)金电极的前期准备：①金电极先用0.05μm的氧化铝浆料打磨抛光处理5min，然后用超纯水彻底冲洗，除去非特异性吸附在金电极表面的氧化铝粉末；②将金电极浸泡在准备好的piranha溶液(H2SO4/H2O2，体积比3：1)中30min，然后用超纯水彻底冲洗并用乙醇和超纯水超声处理5min以除去任何剩余的杂质；③在0.5MH2SO4溶液中设定扫描电位为-0.2和1.5V，并以100mV/s的扫描速率对电极进行电化学扫描清洗，直到获得稳定的伏安峰；④用超纯水冲洗电极并在氮气流中吹干；⑤将预先活化处理的探针(在室温下，2.5μL 1mMTCEP与5μL 1μM捕获探针CP孵育30min)滴加在处理后的Au工作电极上，并在6℃下孵育16h；⑥将5μL的1.0mM巯基己醇(MCH)滴加在电极上25℃孵育1h封闭空白位点。⑦用超纯水冲洗电极，用氮气吹干，放置在4℃冰箱后续使用。
(2)DNA多联体的自组装和富G-四链体线的制备：采用杂交链式反应的方法构建DNA多联体([AP1+AP2]n),具体方法为将5μL 2μΜ AP1和5μL 2μΜ AP2在90℃变性10min,然后缓慢冷却至25℃杂交自组装形成DNA串联体([AP1+AP2]n),获得的DNA串联体直接用于电极表面组装。采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)延伸DNA的方法制备富G-四链体线，具体方法为将5μL 2μM EP探针，2μL 10mM dNTP(摩尔比dGTP：dATP＝7：3)，1μL TdT(10U))与2μL缓冲液加入离心管中并在25℃下保持2h进行延伸反应，之后在90℃加热5min终止反应，并在HEPES buffer中25℃孵育40min形成富G-四链体线。
(3)对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：对于电化学检测，首先在准备好的电极上滴加5μL不同浓度的miRNA-21。随后，将已形成的DNA串联体(5μL)滴到电极表面25℃孵育1.5h，并进一步与链霉亲和素(SAV)溶液(5μL，10ng/μL)相互作用30min。紧接着，将生物素标记的富G-四链体线(5μL，1μM)滴在电极表面上并使其与SAV反应30min。最后，加入5μL浓度为1μM的G-四连体单体GU使之与富G-四链体线结合1.5h，形成更多的富G-四链体线。所得电极用5μL浓度为0.2mM氯化血红素(Hemin)处理30min以形成G-四链体/Hemin复合物，并用于电化学检测。电极组成为银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，DNA组装体修饰的金电极为工作电极；电解液为20mM HEPES溶液(50mMKCl，200mM NaCl，pH8.0)；测试方法为差分脉冲伏安法(DPV)，脉冲幅度和周期分别设置为为50mV和50ms。在此基础之上，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以DPV的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
(4)对含microRNA-21的癌细胞进行定量检测：从不同数量的人乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)中按照提取步骤提取microRNA-21作为检测目标，按照(3)中相同处理方法进行DPV检测，所得DPV数值带入microRNA-21检测的标准曲线，计算出不同数量癌细胞中microRNA-21的浓度(106MCF-7：729pM，104MCF-7：6.65pM，102MCF-7：0.15pM；106HeLa：204.1pM，104HeLa：1.86pM，102HeLa：0.047pM)。
实施例3
(1)金电极的前期准备：①金电极先用0.05μm的氧化铝浆料打磨抛光处理5min，然后用超纯水彻底冲洗，除去非特异性吸附在金电极表面的氧化铝粉末；②将金电极浸泡在准备好的piranha溶液(H2SO4/H2O2，体积比3：1)中20min，然后用超纯水彻底冲洗并用乙醇和超纯水超声处理10min以除去任何剩余的杂质；③在0.5M H2SO4溶液中设定扫描电位为-0.2和1.5V，并以100mV/s的扫描速率对电极进行电化学扫描清洗，直到获得稳定的伏安峰；④用超纯水冲洗电极并在氮气流中吹干；⑤将预先活化处理的探针(在室温下，2.5μL 1mMTCEP与5μL 1μM捕获探针CP孵育30min)滴加在处理后的Au工作电极上，并在8℃下孵育14h；⑥将5μL的1.0mM巯基己醇(MCH)滴加在电极上30℃孵育0.8h封闭空白位点。⑦用超纯水冲洗电极，用氮气吹干，放置在4℃冰箱后续使用。
(2)DNA多联体的自组装和富G-四链体线的制备：采用杂交链式反应的方法构建DNA多联体([AP1+AP2]n),具体方法为将5μL 2μΜ AP1和5μL 2μΜ AP2在92℃变性8min,然后缓慢冷却至30℃杂交自组装形成DNA串联体([AP1+AP2]n),获得的DNA串联体直接用于电极表面组装。采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)延伸DNA的方法制备富G-四链体线，具体方法为将5μL 2μM EP探针，2μL 10mM dNTP(摩尔比dGTP：dATP＝7：3)，1μL TdT(10U))与2μL缓冲液加入离心管中并在30℃下保持1.5h进行延伸反应，之后在92℃加热4min终止反应，并在HEPES buffer中30℃孵育30min形成富G-四链体线。
(3)对microRNA-21标准溶液进行检测，建立标准曲线：对于电化学检测，首先在准备好的电极上滴加5μL不同浓度的miRNA-21。随后，将已形成的DNA串联体(5μL)滴到电极表面30℃孵育1.2h，并进一步与链霉亲和素(SAV)溶液(5μL，10ng/μL)相互作用20min。紧接着，将生物素标记的富G-四链体线(5μL，1μM)滴在电极表面上并使其与SAV反应20min。最后，加入5μL浓度为1μM的G-四连体单体GU使之与富G-四链体线结合1.2h，形成更多的富G-四链体线。所得电极用5μL浓度为0.2mM氯化血红素(Hemin)处理25min以形成G-四链体/Hemin复合物，并用于电化学检测。电极组成为银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，DNA组装体修饰的金电极为工作电极；电解液为20mM HEPES溶液(50mMKCl，200mM NaCl，pH8.0)；测试方法为差分脉冲伏安法(DPV)，脉冲幅度和周期分别设置为为50mV和50ms。在此基础之上，以不同浓度的microRNA-21为横坐标，以DPV的信号值为纵坐标，建立microRNA-21检测的标准曲线。
(4)对含microRNA-21的癌细胞进行定量检测：从不同数量的人乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)中按照提取步骤提取microRNA-21作为检测目标，按照(3)中相同处理方法进行DPV检测，所得DPV数值带入microRNA-21检测的标准曲线，计算出不同数量癌细胞中microRNA-21的浓度。
藉由上述技术方案，本发明的基于DNA串联体和富G-四链体线组成的多分支DNA纳米组装体超灵敏检测microRNA-21的电化学方法具有很好的miRNA-21检测灵敏度，其检测限为0.2fM，动态响应范围为10fM至100nM；电化学生物传感器具有优良的特异性，可将目标核酸分析物的单碱基突变与完全匹配的目标RNAmicroRNA-21区分开来；该电化学方法可对实际真实的生物样品进行分析，是通用型的DNA纳米生物传感器的理想平台。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Figure BDA0001903782280000111
Figure BDA0001903782280000121
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 一种检测microRNA-21的电化学传感器、其制备方法及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ctgataagct att 13
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tgactacaac ttcaacatca gt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
agttgtagtc aactgatgtt ga 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ttttttcagc ggaggcg 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
agggtgggga gggtgggg 18

Claims (14)

1.一种检测microRNA-21的电化学传感器的制备方法，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，其特征在于，所述的制备方法包括：
使活化处理的捕获探针与作为工作电极的金电极接触，并孵育，之后将巯基己醇施加于所述金电极上孵育封闭空白位点；
采用杂交链式反应的方法构建DNA串联体，以及采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶延伸DNA的方法制备富G -四链体线；
将DNA串联体施加于所述金电极表面孵育，并与链霉亲和素溶液相互作用；
将生物素标记的富G-四链体线施加在所述金电极表面，所述生物素能够与所述链霉亲和素特异性识别，在DNA串联体上组装富G -四链体线作为分支结构；以及，
加入G-四链体单体与所述富G-四链体线通过π-π堆叠结合，自组装形成多分支DNA纳米组装体，之后用氯化血红素处理，在所述金电极上形成G-四链体/氯化血红素复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：在室温下，将TCEP与捕获探针孵育，获得活化处理的捕获探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述捕获探针的序列如SEQ ID NO: 1所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将活化处理的捕获探针滴加于金电极上，并于4~8℃孵育12~16h，之后将巯基己醇滴加于所述金电极上，并于25~37℃孵育0.5~1h，以封闭空白位点。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将第一探针集和第二探针集在90~95℃变性5~10min，之后冷却至25~37℃杂交自组装形成DNA串联体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述第一探针集的序列如SEQ ID NO:2所示，所述第二探针集的序列如SEQ ID NO: 3所示。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将EP探针、dNTP、TdT与缓冲液混合均匀，并在25~37℃进行延伸反应1~2h，之后在90~95℃加热3~5min终止反应，并在HEPES缓冲液中于25~37℃孵育20~40min，形成富G-四链体线。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述EP探针的序列如SEQ ID NO: 4所示。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：将DNA串联体施加于所述金电极表面于25~37℃孵育1~1.5h，并与链霉亲和素溶液相互作用15~30min；
将生物素标记的富G-四链体线施加在所述金电极表面，并使其与所述链霉亲和素反应15~30min，以及，加入G-四链体单体与所述富G-四链体线通过π-π堆叠结合1~1.5h，自组装形成多分支DNA纳米组装体，之后用氯化血红素处理20~30min，在所述金电极上形成G-四链体/氯化血红素复合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述G-四链体单体的序列如SEQ IDNO: 5所示。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于还包括：对所述金电极进行打磨抛光处理、超声处理和电化学扫描清洗处理。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述参比电极包括银/氯化银电极，所述对电极包括铂丝电极。
13.由权利要求1-12中任一项所述方法制备的检测microRNA-21的电化学传感器，所述电化学传感器包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极包括金电极，所述金电极表面形成有多分支DNA纳米组装体，所述多分支DNA纳米组装体包括作为主体结构的DNA串联体，以及，作为分支结构的富G -四链体线。
14.一种检测microRNA-21的检测系统，其特征在于包括权利要求13所述的检测microRNA-21的电化学传感器。
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