CN110470712B - 一种基于通道内生成DNA纳米花的miRNA检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测miRNA的装置原理、即检测条件、最优条件及其应用,其中原理为:在铂片上面放阳极氧化铝薄膜PAA,PAA膜的上面放一个聚缘垫片防止溶液泄露,垫片上面形成一个圆形的电解池,在电解池中,将铂电极作为对电极,甘汞电极作为参比电极,铂片作为工作电极,形成三电极体系,在PAA孔道中修饰与miRNA互补的ssDNA,靶标的下面部分可以与之互补,再加入事先合成好的含有互补的发夹结构(带有primer)的DNA滚环链c‑DNA,然后加入DNA聚合酶便可实现滚环扩增,形成DNA纳米花,从而使通道的空间位阻减少,而在电解池中的[Fe(CN)6]3‑离子流入工作电极的速率变小,电流减小。根据电流的变化量来表征miRNA的浓度,用来检测肿瘤标注物miR‑21。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域,尤其涉及miR-21的检测原理、组装过程、实验条件及应用。
发明简介
miRNA是一组短的(大约22个核苷酸)内在的表达非编码RNA,在生物和细胞许多过程中扮演着非常重要的的角色。异常的miRNA表达直接与多种癌症、心血管疾病、糖尿病等疾病有关。此外,miRNA已经被用作潜在的临床诊断的生物标记物和疾病治疗的靶标。因此在生物学和医学中,开发高灵敏的miRNA检测策略是非常重要的。而电化学系统由于其内在的简单性,易于小型化,低成本和高灵敏度等优势被关注,因此开发出一种关于miRNA的检测体系仍是一项极其重要的研究课题。
最近,基于开发合成的纳米孔和纳米通道来模拟生物体内的离子通道和生物传感器已经受到人们越来越多的关注。在生物体内以蛋白质为基础的离子主被动运输是肌肉和神经的电信号源。这一自然的生物电化学行为激发了一系列的生物传感器,一批创新的纳米传感器被开发。这些通道的基本原理主要以离子和生物分子指标为基础的纳米通道内的运输。影响运输的基本因素包括两个部分:一个是空间位阻,空间位阻多是由于通道内存在的生物分子通过立体几何结构单链DNA、发夹DNA、G-四联体的结构互换等引起的。二是静电作用,生物分子本身的电荷和通道内壁的表面电荷共同影响,这些电荷所产生的静电场会吸引或排除带电荷的分子或离子,可以通过改变溶液的离子强度而调制。这些变化都导致在限域的分子迁移率的改变。到目前为止,已被广泛应用于蛋白质、多肽、DNA和离子等生物传感器中。
PAA膜是一种纳米阵列代表材料,其通道密度、半径和长度-半径比等都可以在制作过程中被控制,此外,还具有结构坚固、表面易功能化和商业可获得性等特性被广泛应用。如夏等人报道了一个基于电化学平台修饰G-四联体对有机小分子物质ATP和K+的简单检测方法及通过吗啉功能化修饰的PAA纳米阵列实现对单核苷酸多态性的检测。魏等人通过在PAA膜内修饰一种无标记的引物链,引物链可以延伸和拓展重复的G-四联体重复片段(TTAGGG),这种结构导致通道内的空间位阻增加,实现了对尿液中端粒酶活性的检测。
DNA纳米花是通过多功能的DNA纳米结构自主装形成的,即设计好的模板链经过滚环扩增反应产生的,可以通过模板序列的设计、参数的设置和时间的调节等使DNA的直径在很宽的范围之间进行调节,目前,DNA纳米花在生物医学上主要在生物成像、靶向药物输送和靶向肿瘤细胞识别等方面有应用。
基于此,我们开发出了一个新的miRNA检测装置。其中,在铂片上面放置阳极氧化铝薄膜PAA,PAA膜的上面放一个聚缘垫片防止溶液泄露,垫片上面形成一个圆形的电解池,其中电解池中铂电极作对电极,甘汞电极作参比电极,铂片作为工作电极形成三电极体系,在PAA孔道中修饰与miRNA互补的单链 ssDNA,靶标下部分可以与之互补,在加入事先合成好的DNA滚环链c-DNA且含有互补的发夹结构(带有primer),加入DNA聚合酶便可实现滚环扩增形成DNA 纳米花,从而使通道的空间位阻减少,而在电解池中的K3[Fe(CN)6]离子流入工作电极的速率变小,电流减小。本装置以肿瘤标注物miR-21为靶标进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一类肿瘤标志物miRNA的检测方法。
发明原理:
鉴于miRNA在临床诊断和治疗中的重要意义。近年来,miRNA检测已成为一个热门研究领域。在这个工作中,miR-21被选为模型来说明我们的设计原则。我们认为DNA纳米花可以在适当的设计后用于电化学检测。如图1是关于所提策略的说明。在铂片上面放阳极氧化铝薄膜PAA,PAA膜的上面放一个聚缘垫片防止溶液泄露,垫片上面形成一个圆形的电解池,在电解池中,铂电极作为对电极,甘汞电极作为参比电极,铂片作为工作电极形成三电极体系, miR-21的互补链ssDNA修饰在阳极氧化铝薄膜的内壁中,可以与miR-21的底部连接起来,然后miR-21的顶部可以通过与预先设计好的滚环扩增链连接诱导滚环扩增反应产生DNA纳米花(即特殊的c-DNA有两个互补的发夹结)。这种DNA纳米花生成导致了纳米通道的空间障碍的增加,导致了铁氰化钾[K3 Fe(CN)6]的电流减小,这样我们就能达到同步检测的目的。总之,通过对DNA 链的设计和电化学装置的使用,可以实现miRNA的同步电化学检测装置。
需要的试剂:
由Sangon生物技术有限公司(中国上海)合成了DNA寡核苷酸。它们被列在表1中,从合肥普元纳米技术有限公司购买。(安徽,中国)。T4 DNA连接酶和phi29 DNA聚合酶从碧云天生物技术有限公司(上海,中国)购买。(3- 氨基丙基)、三乙氧基硅烷、铁氰化钾、氯化钾、苯甲醛六氨合钌和其他试剂从Sigma-Aldrich(上海,中国)获得。所有的溶液都是用去离子水制备的,在
使用前达到18.2MΩ的电阻。在一个CHI660D的电化学工作站上进行了电化学测量。
Table 1
Oligonucleotide sequences used in the experiments.
制备方法包括如下过程:
一、修饰PAA和ssDNA:
为了去除纳米通道中的杂质,阳极氧化铝薄膜依次经乙醇和超纯水超声。在室温下,PAA的薄膜首先被氮气干燥,然后浸入1mL的乙醇溶液中,其中含有5%的APTES。在12小时内被轻轻摇晃后,在PAA纳米通道的内壁上产生的氨基基团,在此之后,PAA的膜再次用乙醇清洗,以去除残留的硅化试剂,然后用氮气烘干。然后,将10ul的ssDNA溶液滴到PAA膜的表面反应24h。需要注意的一点是,在密封的玻璃瓶中,需要少许水在密封的玻璃瓶子里,防止10 μL的ssDNA溶液从瓶中蒸发出来。再沉浸PAA膜在1mL含有0.1%苯甲醛的超纯水中轻轻摇晃12h以结合其余氨基基团,然后PAA膜用超纯水清洗去除游离 ssDNA和残留的苯甲醛。然后,在4℃中存储在Tris缓冲溶液中。
二、DNA纳米花滚环过程:
配体DNA模板的准备工作,将以下物质添加到1.5毫升的离心管中。组件为:69.5ul去离子水,10ul DNA连接缓存液(10X),6ul template(10 uM),12ul primer(10uM)最终浓度为100ml。将离心管涡流混合,将混合物加热到95℃,持续5分钟,将混合物慢慢冷却到室温下,关键步骤是加热DNA到95℃,然后逐渐冷却到室温,这是完成cDNAs的完全杂交的重要步骤。然后将2.5ul的T4 DNA连接酶(400,000U/ml)添加到退火的混合物中,并用吸液管尖或轻度涡流混合。最后将混合物在室温下孵化30分钟,最终产品可在 4℃储存至少1个月。一侧的PAA膜加入一定量的环化后的混合的DNA模板,孵育30min,用水冲洗没有连接的DNA模板链,加入含有核苷酸和phi29 DNA聚合酶(10000U/mL)混合物的滚环扩增反应缓冲液在30℃孵化6h,然后热处理灭活phi29,然后加入DNA聚合酶在75℃反应10分钟结束。
三、电化学检测:
使用的电化学装置是一种自制的纳米器件,工作电极是长、宽分别为1厘米的铂片,工作电极在一个铜导电基座上。在铂片的顶部是一个圆形的绝缘O 型硅胶垫(PMMA),以防止电解质泄漏。在硅树脂垫的顶部是阳极氧化铝薄膜, PAA膜如下图2所示,在薄膜上,它是一个开放的电解槽,上面插入两个电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,形成一个三电极电化学系统。在电化学工作站进行所有电化学测量。在加入5mL K3[Fe(CN)6]后,通过电流时间曲线显示阳极氧化铝薄膜上面的纳米通道中是否出现了空间位阻的变化,即有无miRNA触发DNA纳米花生成过程。
四、DNA纳米花的合成和特征
根据文献的说明,合成了DNA纳米花,并在实验部分中描述了合成方法,如下图3所示。琼脂凝胶电泳显示DNA纳米花已经成功合成。通过对DNA纳米花的形态和大小进行了表征,揭示了平均粒径为200±20nm。
五、纳米通道中DNA纳米花的构象变化
运用一种基于纳米材料的电化学方法,研究了DNA纳米花的构造转化与靶分子浓度之间的关系,由于DNA纳米花约束条件的影响,在工作电极上的 K3[Fe(CN)6]的数量减少了。这里,″D″被引入来表示电量减少电流比率,它被定义为D=(I-I0)/I,I和I0分别表示PAA/ssDNA的稳态电流和PAA/mi-RNA/DNA 纳米花。如下图4所示。纳米通道孔的直径约为200-300纳米,在这个尺度上, K3[Fe(CN)6]的滴流更为突出。没有修饰任何东西的纳米通道有很小的电流。当 PAA用ssDNA进行修饰时,在miR-21捕获和DNA纳米花生成之后,D就会进一步增加。
六、实验条件的优化
为了获得更好的传感性能,对于添加的ssDNA溶液和DNA纳米花反应时间分别进行了探索,给出了优化的实验条件如图5。用不同浓度的ssDNA孵育PAA。随着ssDNA浓度的增加,下降电流值明显增加,20ul达到平台期,所以20ul 就足以产生非常好的信号。类似地,靶标诱导滚环扩增产生不同粒径的DNA纳米花,6h已被设定为最佳孵育时间。
七、生物传感器的性能
在此基础上,应用电流时间曲线对miR-21进行定量分析。当由靶标引起的 DNA纳米花产生时,由滴流发现的K3[Fe(CN)6]信号随着miR-21浓度的增加而增加。如图6在10fM到1000fM之间获得一个线性范围。回归方程是y=- 1.24+15.19lg[miR-21](fM),R2=0.99。检测的极限(LOD)被计算为4.53fM, s/n=3。这一结果表明,生物传感器对miR-21的测定具有良好的灵敏度。
八、选择性和重现性
采用miR-21(1000fM)、miR-192(1μM和-7(1μM)作为对照组,研究了该方法的选择性。如图7,miR-21的电流下降率D为45%,而miR-192或let 7的电流下降率D都不到8%。因此,该方法对miR-21检测具有较高的选择性。当miR-21浓度从10fM增加到1000fM时,相对标准的推导范围在1.16-2.91% (n=3)这表明该方法具有良好的重现性,该方法可能是临床应用的一种潜在的和强大的工具。
九、结论
总之,一个新颖的在PAA膜内基于电化学技术通过有效检测mi-RNA诱导生成DNA纳米花来检测mi-RNA的方法被首次提出,不同于以往基于DNA发夹、G 四联体的通道电化学DNA纳米结构传感器,或DNA滚环扩增反应形式单一直链位阻效应较强,该方法提供了一个更大的空间阻力平台,提高了分析性能,大大克服了上述缺点。本方法是DNA纳米花作为功能探针应用于对生物分子的电化学检测的第一个例子,可以为其他创新分析系统的设计奠定基础。
以上详细描述了本发明的装置原理,实施的方法及检测条件等,但是本发明不限于上述检测的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明进行检测底物的变换,这些检测底物的变换均属于本发明的保护范围内,另外需要说明的是,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
说明书附图
图1:基于通道内生成DNA纳米花用于miRNA的装置原理。
图2:阳极氧化铝薄膜扫描电镜图。
图3:DNA纳米花扫描电镜图。
图4:表征DNA纳米花在纳米通道内的合成表征库伦时间图。
图5:A为DNA浓度优化图,B为时间优化图。
图6:A为不同浓度(5fM、10fM、20fM、50fM、100fM、500fM、1000fM)的 miRNA浓度对应的电流值,B为电流下降百分比线性拟合曲线。
图7:装置对不同种类miRNA特异性选择比较。
Claims (1)
1.一种基于通道内生成DNA纳米花的miRNA检测装置,其特征在于:在铂片上面放置阳极氧化铝薄膜PAA,PAA膜的上面放一个聚缘垫片防止溶液泄露,垫片上面形成一个圆形的电解池,在电解池中,将铂电极作为对电极,甘汞电极作为参比电极,铂片作为工作电极,形成三电极体系,在PAA孔道中修饰与miRNA互补的ssDNA,在靶标存在的情况下,靶标的下面部分可以与之互补,再加入事先合成好的带有primer序列的互补发夹结构的DNA滚环链c-DNA,然后加入DNA聚合酶便可实现滚环circle-DNA扩增,形成DNA纳米花,从而使通道的空间位阻减少,而在电解池中的[Fe(CN)6]3-离子流入工作电极的速率变小,电流减小,装置可以用来检测肿瘤标志物miR-21;
其中,相关DNA链的序列如下:
miRNA:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
ssDNA:5’-CHO-(CH2)6-T10-TCAACATCAGT
primer:5’-CTGATAAGCTATCCCTAGCTATGAGTTT
c-DNA:5’-ATACTCAAAGAATGCGACTCATGAAGCTAATTCATTAGCTTCATGAGTCGCATTCAGGGATCGA
circle-DNA:5’-CAAAGAATGCGACTCATGAAGCTAATTCATTAGCTTCATGAGTCGCATTCAGGGATCGA。
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