CN106824107A - 一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒，所述颗粒的粒径小于500nm。本发明的自组装复合材料为具有高比表面积的纳米花结构，该DNA纳米花自组装复合材料的产率接近100％，颗粒在500nm以下，利于后期的利用；不仅如此，本发明的自组装复合材料中的DNA或RNA是动植物细胞的内源性大分子具有低的毒性和良好的生物相容性，DNA除了作为遗传信息的携带者之外，还可以起到靶向识别、酶催化等作用，引入功能核酸可实现DNA纳米花复合材料的多功能一体化，其全部采用天然的生物分子，生物相容性好，细胞毒性小，且生产成本低，利于大规模生产开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种自组装复合材料及其制备方法和应用，具体涉及一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是目前威胁人类生命健康的头号疾病。从根本上讲，癌症是一种复杂的基因疾病，DNA是最重要的生物大分子，是自然选择的存储生物基因信息的大分子。由于特异性极高的Watson-Crick碱基相互作用，上个世纪90年代，纽约大学的Seeman教授发现可利用DNA可控自组装构筑二维及三维纳米结构，从而开启了DNA纳米技术的发展。
DNA大分子作为纳米药物载体具有其它技术所无法比拟的优势：(1)完全地生物可降解性，生物相容性好。(2)纳米尺寸可调。(3)DNA是最为智能的材料：能够响应外界刺激发生二级结构的变化；能够实现程序化设计；一些特殊的单链DNA具有类似于抗体(antibody)和酶(enzyme)的功能性，例如对细胞表面癌症标记物有特异性识别的适体序列(aptamer)。(4)对DNA进行化学修饰的方法比较成熟。(5)DNA大分子的可操控性能比较强，可以通过特异识别序列的引入，利用酶活性实现对DNA大分子的复制(polymerase)、剪切(restrictionendonuclease)和粘结(ligase)。
在一定条件下，恒温滚环扩增反应(rolling circle amplification,RCA)进行足够长的时间，生成的高分子量的DNA/RNA产物会自组装成纳米结构。RCA反应以环状DNA/RNA为模板，在聚合酶的作用下通过链置换反复、持续地复制模板序列，是制备具有特定序列的高分子量DNA/RNA简单有效、成本低廉的方法。表征分析显示这种纳米粒子的最重要成分是产物DNA/RNA，而脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合过程中产生的焦磷酸镁(Mg2PPi)是DNA/RNA的主要缩合剂(condensation agents)，通过静电相互作用使DNA/RNA紧密聚集成纳米颗粒。通常电荷数≥3的多价阳离子(polycation)，例如Co(NH3)6 3+、聚胺、聚电解质、多肽等，是常用的缩合剂。
然而，以恒温滚环扩增反应制备DNA大分子为载体是制备纳米药物很好的思路，关于这方面的研究才刚刚起步，还有多问题需要解决和改进；例如：(1)人们得到的DNA纳米粒子是恒温滚环扩增反应的直接产物，虽然对其生成的机理已经有一定的讨论，但是如何可控地制备这种纳米粒子，对其尺寸和形貌进行有效调控仍然是攻关的难点；(2)这类DNA纳米粒子仍然不能直接穿越细胞膜，需要在其表面修饰一层正电性高分子，这样的设计大大降低了用DNA大分子作为药物载体的意义；(3)选用和DNA类似的生物材料修饰并稳定DNA纳米粒子是目前需要解决的另一问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种自组装复合材料，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒，所述颗粒的粒径小于500nm。
本发明中，通过引入阳离子通过静电作用使长链螺旋状核酸由于电荷中和发生不同程度的收缩，当引入P2O7 4-后在收缩的阳离子/核酸系统中会原位的生成Mg2PPi晶体，最终形成Mg2PPi/DNA-NFs，焦磷酸镁(Mg2PPi)是核酸的主要缩合剂，通过静电相互作用使核酸紧密聚集成纳米花颗粒，所述纳米花颗粒即纳米颗粒呈现花状结构，具有针状或片状的花瓣，所述颗粒的直径例如可以是100nm、120nm、150nm、160nm、180nm、200nm、210nm、230nm、250nm、280nm、300nm、320nm、350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、430nm、450nm、480nm或500nm，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述颗粒的粒径为100-500nm，优选为300-500nm。
本发明中，Rg为动力学半径，Rh为流体力学半径，Rg/Rh为0.775说明自组装材料为致密的球状结构，随着本发明阳离子含量的增加，Rg值从92.9nm减小到了75.3nm，说明阳离子Mg2+使核酸链有一个收缩的过程，当用P2O7 4-把缩合的核酸形状固定以后，就形成了SEM可观测的自组装纳米花复合材料结构。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：向核酸水溶液中加入阳离子反应后，再加入焦磷酸盐，制备得到所述自组装复合材料。
根据本发明，所述核酸为单链DNA和/或RNA，本领域中能够制备得到单链DNA的方式都是可行的，本领域技术人员可以根据实际需要采用本领域公知的技术进行制备，在此不做特殊限定。
本发明中，在制备所述自组装复合材料之前，将核酸进行扩增，具体采用滚环扩增技术，具体的，以线性单链模板DNA/RNA与引物(一条寡聚核酸同模板序列首尾互补)相互识别，首尾两端闭合成环，在连接酶的作用下连接成环状单链DNA/RNA；进一步，在聚合酶以及dNTPs存在的条件下，从引物开始复制环状模板，通过链置换作用进行无限单链扩增，产生具有重复模板序列的长单链核酸分子。
根据本发明，所述制备方法中的核酸分子为长单链核酸分子，分子链过短无法形成本发明的纳米花的自组装复合材料，所述核酸的碱基数量为1000-12000bp，例如可以是1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、4500bp、5000bp、5500bp、6000bp、6500bp、7000bp、7500bp、8000bp、8500bp、9000bp、9500bp、10000bp、11000bp或12000bp，优选为2000-10000bp，进一步优选为10000bp，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，所述阳离子起到中和核酸电荷的作用，所述阳离子为Mg2+、Ca2+、Zn2+或Fe2+中的任意一种或至少两种的混合，优选为Mg2+，选优述Mg2+是由于本发明所述自组装复合材料后期要用于载药进入人体，而人体中本身就含有Mg2+，Mg2+对人体友好，无毒无刺激无副作用，不会造成排斥，而且在RCA反应的过程中，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在聚合过程中产生的焦磷酸镁(Mg2PPi)是DNA/RNA的主要缩合剂(condensation agents)，通过静电相互作用使DNA/RNA紧密聚集成纳米颗粒，所以在研究纳米花的形成机理时，用Mg2+和P2O7 4-模拟RCA反应中形成的Mg2PPi。
优选地，所述焦磷酸盐为焦磷酸钠、焦磷酸钾或焦磷酸铵中的任意一种或至少两种的混合。
根据本发明，所述自组装复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制核酸水溶液，向核酸水溶液中加入阳离子溶液反应后，调节pH孵育；
(2)向步骤(1)的混合物中分次加入焦磷酸盐，超声，经过多次加热冷却后进行孵育；
(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
优选地，步骤(1)所述核酸水溶液的质量浓度为0.01-2mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL优选为0.08-1mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，所述核酸和阳离子要在一定的比例，阳离子过多，会使得阳离子/核酸系统由于电荷中和开始逐渐带上相反电荷，使DNA链之间的排斥作用占主导地位，DNA又从密实的球状逐渐的回复到自由线圈的状态，步骤(1)所述核酸和阳离子的摩尔比为1:(10-1500)，例如可以是1:10、1:80、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1100、1:1200、1:1300、1:1400、1:1500，优选为1:(100-300)，进一步优选为1:200，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，所述混合物中pH过酸或过碱都不利于本申请纳米花结构的自组装材料的生成，pH过低会使形成的纳米花颗粒解离，pH过高会使Mg2+沉淀为Mg(OH)2不能达到用P2O7 4-固化核酸线圈结构的的效果，进而影响对机理的解释。步骤(1)所述的pH为6-9，例如可以是6、6.5、7、7.5、7.6、7.8、8、8.1、8.2、8.3、8.5、8.6、8.8或9优选为7-8.5，进一步优选为8，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述孵育的温度为20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明所述的孵育方式为本领域公知的孵育方式都可行，本领域技术人员可以根据实际需要选择孵育的方式，在此不做特殊限定。
优选地，所述孵育的时间为8-24h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，优选为10-18h，进一步优选为12h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，所述焦磷酸盐采用分次缓慢加入，可以使焦磷酸盐均匀的分散在整个体系，利于形成均匀的纳米花颗粒，主要是由于采用这样的方式所述自组装复合材料的纳米花结构形成的更好，结合度更高，产率也高，可达100％，步骤(2)所述分次加入焦磷酸盐的次数为3-10次，例如可以是3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次，优选为4-8次，进一步优选为5次，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述焦磷酸盐和核酸的摩尔比为(10-25):1，例如可以是10:1、12:1、15:1、16:1、18:1、19:1、19.5:1、20:1、21:1、23:1、25:1，优选为19.5:1，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述超声的频率为20-50KHz，例如可以是20KHz、22KHz、23KHz、25KHz、28KHz、30KHz、32KHz、33KHz、35KHz、36KHz、38KHz、40KHz、42KHz、43KHz、45KHz、48KHz、50KHz，优选为40KHz，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述超声的时间为0.5-5min，例如可以是0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min或5min，优选为1-3min，进一步优选为1min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(2)所述多次加热冷却的次数为1-5次，例如可以是1次、2次、3次、4次或5次，优选为2-3次，进一步优选为2次，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述加热的温度为70-90℃，例如可以是70℃、71℃、72℃、73℃、75℃、76℃、78℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃，优选为80-88℃，进一步优选为85℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述加热的时间为10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min，优选为15-25min，进一步优选为20min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述孵育的温度为20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述孵育的时间为24-72h，例如可以是24h、25h、26h、28h、30h、31h、32h、35h、36h、38h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、53h、55h、56h、58h、60h、62h、65h、66h、68h、70h或72h，优选为30-60h，进一步优选为48h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
作为优选技术方案，所述自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制质量浓度为0.01-2mg/mL核酸水溶液，向核酸水溶液中加入阳离子溶液，所述核酸和阳离子的摩尔比为1:(10-1500)，反应后，调节pH为6-9，20-40℃孵育8-24h；
(2)向步骤(1)的混合物中分3-10次加入与核酸摩尔比为(10-25):1的焦磷酸盐，20-50KHz超声0.5-5min，经过1-5次70-90℃加热10-30min后冷却，进行20-40℃孵育24-72h；
(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
作为最优选的技术方案，所述自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制质量浓度为0.1mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Mg2+溶液，所述DNA和Mg2+的摩尔比为1:200，反应后，调节pH为8，30℃孵育12h；
(2)向步骤(1)的混合物中分5次加入与DNA水溶液摩尔比为19.5:1的焦磷酸盐，40KHz超声1min，经过2次85℃加热20min后冷却，进行30℃孵育48h；
(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
本发明制备方法制备得到的自组装复合材料产率接近100％，颗粒在500nm以下，自组装复合材料呈现美观的纳米花结构，Rg/Rh＝0.775，是致密的球状结构，后期可作为药物载体。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的自组装材料或如第二方面所述的制备方法制备的自组装材料用于药物载体、重金属离子的吸附、生物催化或细胞筛选领域。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的自组装复合材料为具有高比表面积的纳米花结构，该DNA纳米花自组装复合材料的产率接近100％，颗粒在500nm以下，利于后期的利用；
(2)本发明的自组装复合材料中的DNA或RNA是动植物细胞的内源性大分子具有低的毒性和良好的生物相容性，DNA除了作为遗传信息的携带者之外，还可以起到靶向识别、酶催化等作用，引入功能核酸可实现DNA纳米花复合材料的多功能一体化，其全部采用天然的生物分子，生物相容性好，细胞毒性小，且生产成本低，利于大规模生产开发。
附图说明
图1为自组装材料Mg2PPi/DNA-NFs的制备流程图；
图2为共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图，标尺为7.5μm，其中，图2(a)为自组装材料Mg2PPi/DNA-NFs，图2(b)为Mg2PPi。
图3为自组装材料Mg2PPi/DNA-NFs的热重结果图；
图4为自组装材料Mg2PPi/DNA-NFs的电镜结果图，标尺为1μm，其中，图4(a)为DNA和镁离子的摩尔比为1:50，图4(b)为DNA和镁离子的摩尔比为1:200，图4(c)为DNA和镁离子的摩尔比为1:500，图4(d)为DNA和镁离子的摩尔比为1:800，图4(e)为DNA和镁离子的摩尔比为1:1500；
图5为不同DNA和镁离子的摩尔比的情况下自组装材料Mg2PPi/DNA-NFs的产率曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1制备自组装复合材料
所述自组装复合材料的制备方法如图1所示，包括如下步骤：
(1)将核酸进行扩增，具体采用滚环扩增技术，具体的，以线性单链模板DNA与引物(一条寡聚核酸同模板序列首尾互补)相互识别，首尾两端闭合成环，在连接酶的作用下连接成环状单链DNA；
(2)在聚合酶以及dNTPs存在的条件下，从引物开始复制环状模板，通过链置换作用进行无限单链扩增，产生具有重复模板序列的长单链核酸分子；
(3)配制质量浓度为0.1mg/ml DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Mg2+溶液，所述DNA和Mg2+的摩尔比为1:200，反应后，调节pH为8，30℃孵育12h；
(4)向步骤(3)的混合物中分5次加入与DNA水溶液摩尔比为19.5:1的焦磷酸盐，超声1min，经过2次85℃加热20min后冷却，进行30℃孵育48h；
(5)将步骤(4)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
实施例2
该实施例将实施例1的自组装复合材料与焦磷酸镁通过gel red染色，用共聚焦激光扫描显微镜进行验证，结果如图2所示。
从图2(a)-2(b)可以看出，在405nm激发光下激发时，Mg2PPi/DNA-NFs发射明显的蓝色荧光，而Mg2P2O7溶液在更大的放大倍数下仍不能观察到明显的蓝色荧光，gel red可以使DNA分子染色，然而却不能使无机晶体染色，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察，证实DNA分子裹进纳米花颗粒中。
实施例3
该实施例将实施例1的自组装复合材料用TGA和XRD进行验证，结果如图3所示。
由图3可以看出，TGA图可知：Mg2PPi/DNA-NFs的失重分为三个阶段：50-137℃，失重了6.5％，为自由水的挥发；137-183℃，失重了9.0％，该部分为没有挥发的自由水和部分的DNA开始热解；183-800℃，失重了22.7％，该部分是DNA的热解，整个热过程有58.5％质量剩余，由于Mg2PPi的熔点为1383℃，所以该阶段的残余的物质为Mg2PPi，说明制备的复合材料同时具备DNA和Mg2PPi的成分。
实施例4
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:50之外，其它与实施例1相同。
对比例1
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:500之外，其它与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:800之外，其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:1500之外，其它与实施例1相同。
实施例5
该实施例将实施例1、实施例4和对比例1-3自组装复合材料用SEM进行验证，结果如图4-5所示。
从图4(a)-(e)的电镜图可以看出，当DNA和镁离子浓度的比值达到1:50时，开始有纳米花结构产生且随着镁离子的增多纳米花的形貌和分布逐渐改善，说明镁离子在形成Mg2PPi/DNA-NFs中起到至关重要的作用。
从图5可以看出，当DNA和镁离子浓度的比值达到1:50时，纳米花结构的自组装材料的产率为100％，与电镜测的结果吻合。
实施例6
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:100之外，其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除没有Mg2+之外，其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:1之外，其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:25之外，其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:400之外，其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:800之外，其它与实施例1相同。
对比例9
与实施例1相比，除DNA和Mg2+的摩尔比为1:1600之外，其它与实施例1相同。
实施例8
该实施例将实施例1、实施例6和对比例4、对比例7-9自组装复合材料测试进行DNA缩聚产物的静态光散射检测，并计算其Rg/Rh，进而确定核酸的结构形态。其中，Rh代表流体力学半径，Rg代表动力学半径，结果如下表1所示；
表1
从表1可以看出，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:0(没有Mg2+)，自组装复合材料呈现单分散的自由线圈，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:100时，自组装复合材料从单分散的自由线圈变成空心球状，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:200时，自组装复合材料变成实心球，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:400及以上时，自组装复合材料变成介于球状和单分散的自由线圈之间的形态，可见，只有DNA和Mg2+的摩尔比在一定范围内才可形成球状的自组装复合材料。
实施例9
该实施例将实施例1、实施例6和对比例4-6、对比例8自组装复合材料测试进行Zeta电位测试，结果如下表2所示；
表2
从表2可以看出，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:0(没有Mg2+)，自组装复合材料的Zeta电位为-30.4，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:1时，自组装复合材料的Zeta电位为-26.88，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:25时，自组装复合材料的Zeta电位为-22.62，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:100时，自组装复合材料的Zeta电位为-6.59，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:200时，自组装复合材料的Zeta电位为-1.25，当DNA和Mg2+的摩尔比为1:800时，自组装复合材料的Zeta电位为5.28，可见，随着镁离子量的增多，由于电荷中和使其Zeta电位逐渐增大，当镁离子的含量增大到一定程度，体系的Zeta电位成为正值，使整个体系带上反相电荷，如果进一步增加Mg2+的含量会使体系内的静电斥力增强，不利于纳米化结构的形成。
实施例10
所述自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将核酸进行扩增，具体采用滚环扩增技术，具体的，以线性单链模板RNA与引物(一条寡聚核酸同模板序列首尾互补)相互识别，首尾两端闭合成环，在连接酶的作用下连接成环状单链RNA；
(2)在聚合酶以及dNTPs存在的条件下，从引物开始复制环状模板，通过链置换作用进行无限单链扩增，产生具有重复模板序列的长单链核酸分子；
(3)配制质量浓度为0.05mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Zn2+溶液，所述RNA和Zn2+的摩尔比为1:50，反应后，调节pH为6，20℃孵育24h；
(4)向步骤(3)的混合物中分3次加入与DNA水溶液摩尔比为…的焦磷酸盐，超声0.5min，经过1次90℃加热30min后冷却，进行20℃孵育72h；
(5)将步骤(4)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
以本实施例制得的自组装复合材料，其性质与实施例1得到的自组装复合材料的效果相似。
实施例11
所述自组装复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将核酸进行扩增，具体采用滚环扩增技术，具体的，以线性单链模板DNA与引物(一条寡聚核酸同模板序列首尾互补)相互识别，首尾两端闭合成环，在连接酶的作用下连接成环状单链DNA；
(2)在聚合酶以及dNTPs存在的条件下，从引物开始复制环状模板，通过链置换作用进行无限单链扩增，产生具有重复模板序列的长单链核酸分子；
(3)配制质量浓度为3mg/mL DNA水溶液，向DNA水溶液中加入Ca2+溶液，所述RNA和Ca2+的摩尔比为1:350，反应后，调节pH为9，40℃孵育8h；
(4)向步骤(3)的混合物中分10次加入与DNA水溶液摩尔比为…的焦磷酸盐，超声5min，经过5次70℃加热10min后冷却，进行40℃孵育24h；
(5)将步骤(4)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
以本实施例制得的自组装复合材料，其性质与实施例1得到的自组装复合材料的效果相似。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的载药聚合物纳米胶束及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种自组装复合材料，其特征在于，所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒，所述颗粒的粒径小于500nm。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述颗粒的粒径为100-500nm，优选为300-500nm；
优选地，所述核酸收缩后为球形结构，所述核酸收缩后的Rg/Rh为0.775。
3.一种如权利要求1或2所述的自组装复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向核酸水溶液中加入阳离子反应后，再加入焦磷酸盐，制备得到所述自组装复合材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为单链DNA和/或RNA；
优选地，所述核酸的碱基数量为1000-12000bp，优选为2000-10000bp，进一步优选为10000bp；
优选地，所述阳离子为Mg2+、Ca2+、Zn2+或Fe2+中的任意一种或至少两种的混合，优选为Mg2+；
优选地，所述焦磷酸盐为焦磷酸钠、焦磷酸钾或焦磷酸铵中的任意一种或至少两种的混合。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制核酸水溶液，向核酸水溶液中加入阳离子溶液反应后，调节pH孵育；
(2)向步骤(1)的混合物中分次加入焦磷酸盐，超声，经过多次加热冷却后进行孵育；
(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
6.根据权利要5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸水溶液的质量浓度为0.01-2mg/mL，优选为0.04-1mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL；
优选地，步骤(1)所述核酸和阳离子的摩尔比为1:(10-1500)，优选为1:(100-300)，进一步优选为1:200；
优选地，步骤(1)所述的pH为6-9，优选为7-8.5，进一步优选为8；
优选地，所述孵育的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃；
优选地，所述孵育的时间为8-24h，优选为10-18h，进一步优选为12h。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述分次加入焦磷酸盐的次数为3-10次，优选为4-8次，进一步优选为5次；
优选地，所述焦磷酸盐和核酸的摩尔比为(10-25):1，优选为19.5:1；
优选地，步骤(2)所述超声的频率为20-50KHz，优选为40KHz；
优选地，步骤(2)所述超声的时间为0.5-5min，优选为1-3min，进一步优选为1min。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述多次加热冷却的次数为1-5次，优选为2-3次，进一步优选为2次；
优选地，所述加热的温度为70-90℃，优选为80-88℃，进一步优选为85℃；
优选地，所述加热的时间为10-30min，优选为15-25min，进一步优选为20min；
优选地，所述孵育的温度为20-40℃，优选为25-35℃，进一步优选为30℃；
优选地，所述孵育的时间为24-72h，优选为30-60h，进一步优选为48h。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制质量浓度为0.01-2mg/mL核酸水溶液，调节pH为6-9，向核酸水溶液中加入阳离子溶液，所述核酸和阳离子的摩尔比为1:(10-1500)，20-40℃孵育8-24h；
(2)向步骤(1)的混合物中分3-10次加入与核酸摩尔比为(10-25):1的焦磷酸盐，20-50KHz超声0.5-5min，经过1-5次70-90℃加热10-30min后冷却，进行20-40℃孵育24-72h；
(3)将步骤(2)孵育后的混合物离心水洗，得到所述自组装复合材料。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的自组装材料或如权利要求5-9中任一项所述的制备方法制备的自组装材料用于药物载体、重金属离子的吸附、生物催化或细胞筛选领域。
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