CN114767660A

CN114767660A - 一种靶向协同降脂的纳米双药制备及应用

Info

Publication number: CN114767660A
Application number: CN202210708094.2A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 田晶晶; 朱龙佼; 杜再慧
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Xingyilian Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN114767660B

Abstract

本发明公开了一种装载天然产物靶向协同降脂的功能核酸纳米双药的制备方法及应用。利用oxyethyleneglycol bridge修饰核酸适体药物通过PCR扩增获得双侧5’端带有核酸适体粘性末端的扩增子，将纯化扩增子、焦磷酸根、镁离子、天然产物在70℃下进行一锅法自组装，得到功能核酸纳米双药。该纳米双药具有脂肪靶向性、粒径可压缩性、高效装载与刺激响应释放性等特性，在细胞水平与活体水平，能够实现细胞水平与活体水平的协同肥胖治疗。本发明制备核酸纳米药物的方法简单、成本低廉，非常适用于天然产物的递送与生物医学应用。

Description

一种靶向协同降脂的纳米双药制备及应用

技术领域

本发明属于生物纳米材料领域，具体涉及一种装载天然产物靶向协同降脂的功能核酸纳米双药的制备及应用。

背景技术

在营养健康减肥降脂领域，肥胖是一个严重的全球健康问题。它降低了国民生活质量，还会导致包括糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症在内的各种疾病、甚至死亡。与通过产热消耗脂肪的棕色脂肪组织相比，白色脂肪组织以三酰甘油的形式储存剩余的能量，分为皮下白色脂肪组织和内脏白色脂肪组织。虽然现有的方法，如微针、贴片和局部热疗，为皮下白色脂肪引起的肥胖提供了有效的解决方案，但它们在治疗内脏相关的肥胖时则面临严峻的挑战。尽管天然产物，如白藜芦醇、蒜素和姜黄素，可以通过白色脂肪褐变来对抗与白色脂肪相关的肥胖，但它们的靶向能力需要提高。因此，利用纳米技术实现天然产物的靶向协同治疗是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种装载天然产物靶向协同降脂的功能核酸纳米双药的制备方法及应用。

为了实现本发明的目的，利用oxyethyleneglycol bridge修饰核酸适体药物通过PCR扩增获得双侧5’端带有核酸适体粘性末端的扩增子，将纯化扩增子、焦磷酸根、镁离子、天然产物进行一锅法自组装，得到功能核酸纳米双药。该纳米双药具有脂肪靶向性、粒径可压缩性、高效装载与刺激响应释放性等特性，在细胞水平与活体水平，能够实现细胞水平与活体水平的协同肥胖治疗。本发明制备核酸纳米药物的方法简单、成本低廉，非常适用于天然产物的递送与生物医学应用。

第一方面，本发明提供一种靶向协同降脂纳米双药的制备方法，将纯化的PCR扩增子和天然产物在特定条件下通过一锅法自组装进行合成，制备的纳米双药具有靶向协同降脂功能；

包括以下步骤：将纯化的PCR扩增子、天然产物、焦磷酸根、镁离子在25 ℃~80 ℃条件下孵育5~60 min；

所述PCR扩增子是5’端带有核酸适体粘性末端的扩增子；

所述靶向功能是由核酸适体实现；

所述天然产物既具有降脂功能，同时也具有粒径压缩性。

所述PCR扩增子是以双链DNA为扩增模板，结合修饰核酸适体的上下游引物，进行PCR扩增得到的扩增产物；

所述上游引物tAdi-8-FP是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3通过oxyethyleneglycol bridge和间隔碱基TT连接所得，由5’至3’的连接顺序为SEQ ID NO.3、间隔碱基、oxyethyleneglycol bridge、间隔碱基、SEQ ID NO.1，所示序列为5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA TT oxyethyleneglycol bridge TTTACCGGGCATACCATCCAGA-3’;

所述下游引物tAdi-8-RP是由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3通过oxyethyleneglycol bridge和间隔碱基TT连接所得，由5’至3’的连接顺序为SEQ ID NO.3、间隔碱基、oxyethyleneglycol bridge、间隔碱基、SEQ ID NO.2所示序列为5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA TT oxyethyleneglycol bridge TTCTTGATTGAAGCCGATGCCG-3’。

所述核酸适体为核酸适体药物，是具有降脂功能的核酸序列，其长度为10~40个核苷酸；

所述核酸适体药物为SEQ ID NO.3，所示序列为5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA-3’。

所述天然产物为黄芩苷。

所述特定条件是纯化的PCR扩增子和天然产物在焦磷酸根、镁离子的条件下自组装。

所述焦磷酸根的浓度范围为0.25~2.00 mM；

所述镁离子与PCR扩增子中磷酸基团的摩尔比在1∶5000~1∶50之间；

所述天然产物为黄芩苷，其浓度范围为0~5 mg/mL；

所述自组装条件是25 ℃~80 ℃，5~60 min。

优选地，焦磷酸根的浓度为1.00 mM，镁离子与PCR扩增子中磷酸基团的摩尔比为1∶400，天然产物为黄芩苷，其浓度范围为1mg/mL，自组装的温度为70 ℃，自组装的时间为10min。

所述自组装体系是0.025 mM的磷酸基团，1mM的焦磷酸钾，8.5 mM的氯化镁，1×PCRbuffer（Mg²⁺plus）。

随后，使用冷冻离心机于4 ℃下12000rpm/min离心30min，弃上清；加入20 μL去离子水充分洗涤，于4 ℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后避光晾干过夜。

另一方面，本发明提供一种靶向协同降脂纳米双药，利用上述的制备方法，获得具有脂肪靶向性、粒径可压缩性、高效装载与刺激响应释放性的纳米双药。

所述脂肪靶向性是在细胞水平，纳米双药对3T3-L1前脂肪细胞具有靶向特异性；在活体水平，纳米双药对白色脂肪具有靶向特异性；

所述功粒径可压缩性是天然产物对纳米双药具有粒径压缩作用，粒径分布在200~500 nm；

具体地，0~2 mg/mL的黄芩苷能够将纳米双药的粒径压缩至200~300 nm；

所述高效装载与刺激响应释放性是纳米双药能够有效装载天然产物与核酸适体药物，对天然产物与适体药物的装载率均高于80%；纳米双药在中性pH条件下稳定存在，酸性pH条件能够刺激纳米双药发生刺激响应性缓释。

具体地，纳米双药对核酸适体药物SEQ ID NO:3的装载率高达98%；纳米双药对黄芩苷的装载率高于90%。

纳米双药在中性pH条件下稳定存在，核酸适体药物SEQ ID NO:3、黄芩苷在72 h内的释放率小于10%。

酸性pH条件能够刺激纳米双药发生刺激响应性缓释。具体地，纳米双药在pH 5.0的HCl-Tris缓冲液中，核酸适体药物SEQ ID NO:3、黄芩苷在72 h内的释放率在5%~70%区间。

第三方面，纳米双药能够在细胞水平与活体水平发挥协同肥胖治疗效果。

在细胞水平，纳米双药中的核酸适体药物SEQ ID NO:3与黄芩苷能够协同降低3T3-L1脂肪细胞中的脂滴含量。

具体地，纳米双药有效降低3T3-L1脂肪细胞中50%~90%脂滴含量。

在活体水平，纳米双药中的核酸适体药物SEQ ID NO:3与黄芩苷能够协同防治饮食诱导的C57BL/6J肥胖雄鼠的肥胖。

具体地，纳米双药使饮食诱导的C57BL/6J肥胖雄鼠体重减轻20%~40%；显著降低饮食诱导的C57BL/6J肥胖雄鼠棕色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、内脏白色脂肪组织与脏脏的组织质量；有效防治脂肪肝；有效降低饮食诱导的C57BL/6J肥胖雄鼠血清中的甘油三酯含量。

另一方面，纳米双药制备方法在靶向降脂功能纳米材料制备中的应用；以及纳米双药在靶向脂肪及肥胖治疗中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1. 本发明公开了一种装载天然产物靶向协同降脂的功能核酸纳米双药的制备方法，将共价修饰核酸适体药物纯化扩增子、焦磷酸根、镁离子、天然产物在70℃下进行一锅法自组装，实现了纳米双药的低成本、短时高效的制备。

2. 纳米双药具有脂肪细胞靶向性、白色脂肪脂肪组织靶向性。

3. 天然产物能够压缩纳米双药的粒径至200~500 nm。

4. 纳米双药能够有效装载高达80%的核酸适体药物与高达80%的天然产物；在酸性pH条件下，纳米双药能够响应性缓释适体药物与天然产物。

5. 本发明在细胞水平与活体水平证明了纳米双药中的核酸适体药物与天然产物能够发挥协同肥胖治疗效果，为核酸纳米材料在靶向协同肥胖治疗与生物医学领域的应用提供了借鉴。

附图说明

图1为一种靶向协同降脂的纳米双药制备及应用的原理图

图2为添加黄芩苷前对PCR纳米载体的表征。（A）70℃自组装形成的PCR纳米载体的扫描电镜表征；（B-C）70℃自组装形成的PCR纳米载体元素的定性与定量分析；（D）70℃自组装形成的PCR纳米载体的粒径表征。

图3为黄芩苷对PCR纳米双药粒径压缩后的表征。（A）黄芩苷压缩的70℃自组装形成的PCR纳米载体的扫描电镜表征；（B-C）黄芩苷压缩的70℃自组装形成的PCR纳米载体的定性与定量分析；（D）黄芩苷压缩的70℃自组装形成的PCR纳米载体的粒径表征。

图4为绘制的黄芩苷定量标准曲线。

图5为纳米双药对黄芩苷的装载率。

图6为纳米双药中适体药物Adi-8与黄芩苷baicalin的刺激响应性释放。

图7为纳米双药对3T3-L1脂肪细胞的靶向性验证，图中标尺为20 μm。

图8为纳米双药对HepG2肝癌细胞的非靶向细胞内化过程，图中标尺为20 μm。

图9为PCR纳米双药的细胞降脂表型。（A）3T3-L1前脂肪细胞诱导分化形成的高脂细胞模型组；（B）非靶向空载的纳米递送系统（0.76 ng/μL磷酸基团/100 μM PPi/ mL 培养基）；（C）靶向空载的纳米递送系统（0.76 ng/μL磷酸基团/100 μM PPi/ mL 培养基）；（D）装载低浓度黄芩苷的靶向协同纳米递送系统（0.76 ng/μL磷酸基团/100 μM PPi/ 100 μM黄芩苷/ mL 培养基）；（E）装载高浓度黄芩苷的靶向协同纳米递送系统（0.76 ng/μL磷酸基团/100 μM PPi/ 300 μM黄芩苷/ mL 培养基）；(F) 油红染色定量分析。0.005＜p＜0.01，**；0.001＜p＜0.005，***。

图10为非靶向黄芩苷纳米载体与靶向纳米双药的活体成像。

图11为非靶向黄芩苷纳米载体与靶向纳米双药的活体成像定量分析。

图12为非靶向黄芩苷纳米载体与靶向纳米双药的组织器官成像。

图13为非靶向黄芩苷纳米载体与靶向纳米双药的组织器官成像定量分析。

图14为C57BL/6J雄鼠在10周造模给药期的体重变化，p＜0.005，***。

图15为不同药物处理对小鼠脂肪组织及肝脏质量的影响，0.001＜p＜0.005，***；p＜0.0001，****。

图16为不同药物处理对小鼠血清学脂肪相关成分的影响，0.01＜p＜0.05，*。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1纳米双药的可控组装

首先，以沙门氏菌基因组为扩增模板，使用tAdi-8-FP与tAdi-8-RP为扩增引物，进行PCR扩增，体系组分如表1所示：

表1 PCR扩增体系

其中上游引物tAdi-8-FP：

5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA TT oxyethyleneglycol bridge TTTACCGGGCATACCATCCAGA-3’;

下游引物tAdi-8-RP：

5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA TT oxyethyleneglycol bridge TTCTTGATTGAAGCCGATGCCG-3’;

oxyethyleneglycol bridge，具体结构为：

；

其中核酸适体药物为：5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATA-3’，如SEQ IDNO.3所示。

添加完PCR的反应体系后，涡旋混匀、瞬时离心，使反应液全部集中在PCR管底部，进行PCR扩增反应，PCR扩增程序如表2所示：

表2PCR扩增程序

扩增结束后，进行PCR产物的纯化：

①将6管PCR产物合并共300 uL，加入1/10体积的乙酸钠（3M，pH 5.2）于DNA溶液中充分混匀；

②加入2.5倍体积的冰预冷的无水乙醇，混合均匀，置于-80℃静置过夜；

③使用0℃预冷的离心机于12000 rpm离心30min，小心地移去上清液，吸去管壁上的所有液滴；

④加入700 uL的80%乙醇，使用0℃预冷的离心机于12000 rpm离心10 min，小心移除上清液，吸去管壁上所有的液滴；

⑤于室温下将开盖的EP管置于试验台上晾干至液体挥发后，加入50 uL RNasefree water溶解DNA；

⑥使用Nanodrop定量，并将PCR纯化子的浓度稀释到304.05 ng/uL。

获得PCR扩增纯化子后，进行纳米双药的一锅法自组装，自组装条件为70℃反应10min，体系如表3：

表3纳米双药一锅法自组装

使用冷冻离心机于4 ℃下12000 rpm/min离心30 min，弃上清；加入20 μL去离子水充分洗涤，于4 ℃下12000 rpm/min离心30 min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后避光晾干过夜。

自组装结果如图2与图3所示。如图2所示，当自组装体系中尚未添加黄芩苷时，SEM观察到反应10 min后形成的纳米花（如图2A）。通过SEM-EDS分析，核酸纳米花含有O元素、P元素与Mg元素，花状结构的花瓣较厚，具有较高的dsDNA含量（如图2B与图2C），纳米花的平均半径为632.93 nm（如图2D）。

在一锅法自组装体系中添加黄芩苷，能够压缩纳米花的粒径。如图3所示，加入1mg/mL的黄芩苷后，纳米花的粒径从632.93 nm有效压缩至214.76 nm。

根据黄芩苷定量标准曲线（图4），计算纳米双药对50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、750 ng/mL、1000 ng/mL、1500 ng/mL、2000 ng/mL、2500 ng/mL与3000 ng/mL黄芩苷的装载率（图5），分别为98.90%、99.15%、98.44%、78.93%、66.57%、43.04%、33.31%、25.83%、21.07%，纳米花对黄芩苷的装载能力分别为6.50 g/gDNA、13.05 g/gDNA、64.76 g/gDNA、77.89 g/gDNA、87.59 g/gDNA、84.87 g/gDNA、87.66 g/gDNA、85.30 g/gDNA与85.66 g/gDNA；最大装载能力平均为86.21 g/gDNA。

如图6所示，与pH 7.4持续低剂量释放相比，pH 5.0时纳米双药中黄芩苷的比例在前24 h上升，之后在24~72 h保持稳定，tAdi-8的比例也呈现相同的趋势。因此，PCR纳米双药在中性条件下表现出pH依赖性的刺激响应特性和优越的生物稳定性。

实施例2纳米双药的脂肪细胞靶向性验证

(1) 细胞接种：

①预平衡：在玻璃底培养皿中加入3 mL培养液，在培养箱中放置15分钟进行预平衡；

②接种细胞：用移液器吸去培养液，在培养皿底孔中加入1 mL含细胞的培养液，在培养箱中放置2小时，让细胞沉降贴壁；

③加培养液：小心加入1 mL不含细胞的培养液。该步骤用于为细胞提供足够的培养液，同时减少由于水份挥发带来的渗透压的变化；

(2) 细胞给药：待细胞生长至细胞融合率60%-70%，如表所示，进行加药处理：

表4细胞给药条件

Cy5染料链为SEQ ID NO.4的3’端标记Cy5荧光染料:5’-TCTTCCTGCACCTTCGCTTCTCATTTT-Cy5-3’。

(3) 溶酶体染色：

①取0.5 μL的Lyso-Tracker Green加入到10 mL的细胞培养液中（1∶20000的比例稀释），混匀后即为Lyso-Tracker Green工作液；

②Lyso-Tracker Green工作液使用前需37℃预温育15 min；

③去除细胞培养液，加入步骤1配制好的并37℃预温育的Lyso-Tracker Green染色工作液，与细胞37℃共孵育一段时间；

④去除Lyso-Tracker Green染色工作液，加入新鲜的细胞培养液；

(4) 细胞固定：洗涤细胞，用4% (V/V) PFA在PBS中固定20 min; PBS洗涤2次；

(5) 细胞核染色：

①加入2 mL Hoechst 33342染色液，室温染色40 min；

②吸除Hoechst 33342染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟；

③使用激光共聚焦显微镜观察；

如图7与图8所示，3T3-L1前脂肪细胞与HepG2肝癌细胞的细胞内化与共定位分析共同表明，PCR纳米双药花通过核酸适体靶向3T3-L1前脂肪细胞，通过脂肪细胞膜相关蛋白（Adipocyte Plasma Membrane Associated Protein，APMAP）结合、介导细胞内吞，使纳米双药具有更高的细胞内吞效率、更快的细胞内化速度、更强的溶酶体捕获与逃逸能力。

实施例3纳米双药在细胞水平的协同肥胖治疗

细胞复苏：预先将水浴锅温度设定为37℃后，从液氮中取出冻存的3T3-L1前脂肪细胞，立即转移至37℃水浴锅中并快速摇晃，使细胞冻存液完全融化；融化后向其中加入1mL的DMEM完全培养基 (90% DMEM培养基 + 10% 小牛血清)使细胞重悬，混匀后转移至10mL离心管中，1500 rpm离心5 min；弃掉上清液，加入2 mL的DMEM完全培养基重悬，全部接种至含8 mL DMEM完全培养基的10 cm细胞培养皿中，混匀后置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养，次日换液，待细胞融合度至80%左右即可传代；

细胞传代：轻轻晃动培养皿使细胞碎片和死细胞脱落，用3 mL的PBS缓冲液漂洗1-2次后，加入1 mL胰酶，轻摇培养皿使胰酶覆盖整个底部，放入37°C，5% CO2培养箱中培养3min；当细胞质皱缩为球状，轻轻摇动瓶身有部分而不是大片细胞从底面游离时，加入2 mL完全培养基终止胰酶消化；用移液器将附着在培养皿底部的细胞吹落并将细胞悬液转移至无菌离心管中，1500 rpm离心5 min；离心结束后弃掉上清液，再加入适量完全培养基重悬细胞，用移液枪吹散离心后的细胞团，按实验需要分装至新的培养皿中，置于37℃，5% CO₂培养箱中继续培养；

诱导分化：取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞，接种于6孔细胞板中，细胞接种量为8000个/孔；每两天换一次液；待细胞长满至细胞融合率的80%后，让其接触抑制2 day；然后换含有不同药物的诱导分化培养基培养2 day，再使用含有不同药物的分化维持培养基培养，每两天换液，直到细胞分化完成80-90%以上分化才算完成，油红染色评价分化率；

油红染色：将分化后的脂肪细胞用适量的PBS洗涤两次，轻轻摇动，清洗后去除PBS，室温下用4%聚甲醛固定20 min；弃去多聚甲醛，用PBS洗涤3次后，用60%的异丙醇浸润15 s；加入油红工作液，室温避光10-20 min；纯水清洗2次以上，直到洗液无色后，放在倒置显微镜下观察拍照；油红拍摄完毕后，吸取细胞板中的水、晾干；在6孔板中加入异丙醇，使染到细胞中的油红溶解、分散到异丙醇中，酶标仪520 nm测吸光值；

如图9所示，利用诱导分化培养基（0-2 day）与分化维持培养基（2-14 day）培养3T3-L1前脂肪细胞，细胞形态经历了：细胞开始收缩变圆、生成细小脂滴、脂肪滴明显聚集的过程，油红染色表明：3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成为成熟的脂肪细胞，具有明显的脂肪状表型，成功建立了高脂细胞模型，可以进行纳米双药的靶向协同降脂验证（图9A）；将非靶向空载的纳米载体（ntNC）添加到诱导分化培养基（0-2 day）与分化维持培养基（2-14 day）中培养3T3-L1前脂肪细胞，与高脂细胞模型组（Obesitymodel）相比，脂滴含量没有明显变化（图9B），表明：非靶向空载的纳米递送系统不具有降脂作用；将适体药物Adi-制备成适体纳米药物aptND分别添加到诱导分化培养基（0-2 day）与分化维持培养基（2-14 day）中培养3T3-L1前脂肪细胞，与高脂细胞模型组相比，3T3-L1前脂肪细胞分化至成熟脂肪细胞的比例下降，脂滴含量降低(图9C)，表明：基于Adi-制备成适体纳米药物aptND具有一定的降脂功能。将装载不同浓度黄芩苷的纳米双药bcaND添加到诱导分化培养基（0-2 day）与分化维持培养基（2-14 day）中培养3T3-L1前脂肪细胞，与aptND组相比，3T3-L1前脂肪细胞的分化程度与脂滴含量进一步降低；装载了高浓度黄芩苷（300μM）的bcaND组比装载了低浓度黄芩苷（100 μM）的bcaND组具有更强的协同降脂作用（图9D、E）。这表明：纳米双药中，黄芩苷与具有抗肥胖功能的tAdi-8核酸适体发挥了协同降脂作用，并且协同降脂作用与装载的黄芩苷剂量呈正相关。

实施例4纳米双药的白色脂肪组织靶向性验证

采购8只10周龄的C57BL/6J雄鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），根据体重淘汰体重差异较大的个体，将其随机分成2组，每组3只，进行为期一周的适应性饲养。适应期结束后，分别腹腔注射非靶向递送的黄芩苷纳米药物与靶向递送的纳米双药，注射剂量为150 mg/mL，给药体积为10 mL/kg；在腹腔注射后的预定时间点（0 h、0.5h、1 h、2 h、4h、6 h、8 h、24 h）进行活体成像，定量读取活体信号强度；在24 h活体成像结束后，立刻宰杀小鼠，分别取心、肝、脾、肺、肾、肩胛棕色脂肪、内脏附睾白色脂肪、皮下腹股沟白色脂肪进行组织器官成像，定量读取组织脏器的信号强度。

如图10与图11所示，Cy5标记的非靶向递送的黄芩苷纳米药物与靶向递送的纳米双药相比，在0.5 h、1 h、2 h、6 h与8 h都呈现出显著靶向腹部脂肪的作用（0.01＜p＜0.05，*）。

如图12与图13所示，Cy5标记靶向递送的纳米双药能够显著靶向至附睾处内脏白色脂肪（0.005＜p＜0.01，**）。因此，基于PCR纳米双药具有优越的靶向性。

实施例5纳米双药在活体水平的协同肥胖治疗

动物实验获得中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准后，采购42只5~6周龄的C57BL/6J雄性小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），经专业清洁级包装处理后送至中国农业大学西校区无特定病原体及SPF（Specific Pathogen Free，SPF）动物房，饲养环境相对湿度RH为55±10%，饲养环境温度T为22±2℃，严格遵循光照条件为12h的昼夜交替间隔照明。

将42只C57BL/6J雄性小鼠在SPF动物房内进行耳标固定，根据体重淘汰体重差异较大的实验小鼠，并将其随机分成6组，每组6只，进行为期一周的环境适应性饲养。适应期结束后，进行为期10周的分组饲喂及药物处理。分组如表5所示，

表5纳米双药在活体水平的实验设计

CK组：在为期10周的维持饲料饲喂期间，每隔72h根据实验小鼠的当天体重腹腔注射含DMSO（0.1%）的PBS注射剂，注射体积为10 mL/kg。

HFD试验组：在为期10周的60%高脂饲料饲喂期间，每隔72h根据本组小鼠的当天体重腹腔注射含DMSO（0.1%）的PBS注射剂，注射体积为10 mL/kg。

Baicalin试验组：在为期10周的60%高脂饲料饲喂期间，每隔72h根据本组小鼠的当天体重腹腔注射黄芩苷注射液，给药剂量为150 mg/kg，注射体积为10 mL/kg。

aptND试验组：在为期10周的60%高脂饲料饲喂期间，每隔72h根据本组小鼠的当天体重腹腔注射靶向载体Adipo-8（aptamer nanodrug，aptND），150 mg/kg（按黄芩苷计算），注射体积为10 mL/kg。

NbcaND试验组：在为期10周的60%高脂饲料饲喂期间，每隔72h根据本组小鼠的当天体重腹腔注射非靶向递送的黄芩苷（Nontargeted baicalin-compressed aptamernanodrug, NbcaND），给药剂量为150 mg/kg（按黄芩苷计算），注射体积为10 mL/kg。

bcaND试验组：在为期10周的60%高脂饲料饲喂期间，每隔72h根据本组小鼠的当天体重腹腔注射靶向递送的黄芩苷（baicalin-compressed aptamer nanodrug, bcaND），给药剂量为150 mg/kg（按黄芩苷计算），注射体积为10 mL/kg。

如图14所示，从小鼠的体重水平看，在为期10周的高脂饮食饲喂期间，每隔72 h以腹腔注射方式给药，成功建立了饮食诱导的肥胖模型（Diet Induced Obesity Models，DIOModels）（p=0.000＜0.001，****）；不同药物处理组的体重增幅：bcaND（PCR纳米双药组，p=0.001＜0.005，***）＜Baicalin组（0.005＜p＜0.01，**）＜aptND组（0.01＜p=0.031＜0.05，*）＜NbcaND组（0.01＜p=0.012＜0.05，*）＜HFD组，表明剪裁的tAdi-8适体药物具有抗肥胖活性，黄芩苷适体纳米药物具有协同降脂功能。

如图15所示，分析了小鼠不同脂肪组织与肝脏质量，发现PCR纳米双药能够广谱性降低棕色脂肪、皮下白色脂肪、内脏白色脂肪与肝脏组织的质量，并对降低内脏白色脂肪质量具有更显著的效果。

如图16所述，血生化分析显示了PCR纳米双药具有显著降低DIO小鼠血清中甘油三酯的效果（0.01＜p=0.016＜0.05，*），进一步证实了与单独的黄芩苷和tAdi-8适体纳米药物相比，纳米双药具有更强的协同降脂功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种靶向协同降脂的纳米双药制备及应用

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccgggcat accatccaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttgattgaa gccgatgccg 20

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagaagcg aaggtgcagg aagatttgtc gata 34

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcttcctgca ccttcgcttc tcatttt 27

Claims

1.一种靶向协同降脂纳米双药的制备方法，其特征在于：将纯化的PCR扩增子和天然产物在特定条件下通过一锅法自组装进行合成，制备的纳米双药具有靶向协同降脂功能；

所述PCR扩增子的5’端带有核酸适体粘性末端；

所述靶向功能是由核酸适体实现；

所述天然产物既具有降脂功能，同时也具有粒径压缩性。

2.根据权利要求1所述的纳米双药的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增子是以双链DNA为扩增模板，结合修饰核酸适体的上下游引物，进行PCR扩增得到的扩增产物；

所述上游引物tAdi-8-FP是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3通过oxyethyleneglycolbridge和间隔碱基TT连接所得，由5’至3’的连接顺序为SEQ ID NO.3、间隔碱基、oxyethyleneglycol bridge、间隔碱基、SEQ ID NO.1，所示序列为5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATATToxyethyleneglycol bridgeTTTACCGGGCATACCATCCAGA-3’;

所述下游引物tAdi-8-RP是由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3通过oxyethyleneglycolbridge和间隔碱基TT连接所得，由5’至3’的连接顺序为SEQ ID NO.3、间隔碱基、oxyethyleneglycol bridge、间隔碱基、SEQ ID NO.2所示序列为5’-ATGAGAAGCGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCGATATToxyethyleneglycol bridge TTCTTGATTGAAGCCGATGCCG-3’。

3.根据权利要求2所述的纳米双药的制备方法，其特征在于，所述核酸适体为核酸适体药物，是具有降脂功能的核酸序列，其长度为10~40个核苷酸；

4.根据权利要求1所述的纳米双药的制备方法，其特征在于，所述天然产物为黄芩苷。

5.根据权利要求1所述的纳米双药的制备方法，其特征在于，所述一锅法自组装是将纯化的PCR扩增子和天然产物在焦磷酸根、镁离子的条件下自组装。

6.根据权利要求5所述的纳米双药的制备方法，其特征在于，

所述焦磷酸根的浓度范围为0.25~2.00 mM；

所述镁离子与PCR扩增子中磷酸基团的摩尔比在1∶50~1∶5000之间；

所述天然产物为黄芩苷，其浓度范围为0~5 mg/mL。

7.一种靶向协同降脂纳米双药，其特征在于，利用权利要求1所述的制备方法，获得具有脂肪靶向性、粒径可压缩性、高效装载与刺激响应释放性的纳米双药。

8.根据权利要求7所述的纳米双药，其特征在于，

所述粒径可压缩性是天然产物对纳米双药具有粒径压缩作用，粒径分布在200~500nm；

9.根据权利要求1所述的制备方法在功能纳米材料制备中的应用。

10.根据权利要求7所述的纳米双药在靶向脂肪及肥胖治疗中的应用。