CN102949728A - 一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体及其制备方法。首先通过溶解凝胶法制备出介孔硅纳米颗粒，并将其开发成为药物分子的纳米储存器；而后，利用简单的化学修饰方法在介孔硅纳米储存器的表面引入二硫键，并将其作为连接纽带；其次，创新地采用生物相容性的天然细胞外基质—胶原分子固定至介孔硅纳米储存器表面，并将其开发成为介孔硅纳米储存器的纳米封装器；最后，将乳糖酸分子修饰至介孔硅/胶原纳米复合系统表面，并将其作为肝癌细胞膜表面受体（ASGP-R）的特异性受体，从而构建出一种兼具细胞特异性靶向性和还原性物质/酶响应性的介孔硅/胶原—乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。
Description
技术领域
本发明属于医用材料领域，涉及一种多功能医药纳米载体的构建方法。
背景技术
经过半个多世纪的探索与发展，智能药物控制释放系统在医学领域充分展示了其潜在的应用价值。控释给药也逐渐成为生物医学研究领域的一个重要分支，其横跨了工程技术、组织工程、生物材料与临床医学等多类交叉学科。Robert Langer等开创的微机电给药系统，利用外界远程信号实现系统的体内控制释放。然而，系统释放出来的药物分子不能特异性的识别靶细胞，药物分子大部分分布于正常组织并被正常细胞所摄取；而病变组织中的药物分布较少，造成药物递送效力较低，增加了药物在体内的毒副作用。因此，研究人员都在寻找特定的生物材料作为药物载体，设计更加新型的药物控制释放系统，提高功能药物被病变细胞摄入的效率。
纳米技术的迅速发展为制备并设计新型的智能药物释放系统提供了可能性。纳米粒子和纳米胶囊是指粒径分布在10-100纳米之间的固态胶体粒子，可通过细胞吞噬作用进入细胞体内。因此，研究人员通过整合药物化学和纳米技术，设计新型的纳米控制释放系统，努力提高活性药物分子被细胞摄入的效率。药物分子可以通过物理作用（扩散作用、吸附作用）或化学作用（亲疏水性作用、化学交联作用）粘附在纳米颗粒的表面，形成药物分子/纳米颗粒的复合系统。这类纳米药物控释系统可实现药物的缓释，并提高药物的细胞摄入率。纳米药物控制释放系统的研究是传统药物制剂的进一步深化和发展，属于当今最前沿的研究领域之一。其具有较好的医学应用前景，尤其在抗肿瘤领域已获得了较好的临床效果，该学科已促进了药学、医学、材料、化学、生物、等领域多学科的交叉与融合。
为了促使纳米控制释放系统具有更好的疗效，并减少毒副作用；相关材料科学家、生物学家及临床医生都在共同努力设计一种新型的智能控释系统，使其不仅能特异性识别靶位组织，还能针对病变细胞实行特定信号的定向“爆破”。具体来说，就是其能在特定的时刻，以合适的速率，将所需剂量的药物导入人体所需要的部位，即药物定点、定时、定量地释放，充分的利用了药物的疗效，避免药物积累中毒，减轻药物的毒副作用，达到治愈的目的。
介孔硅纳米材料是一种孔径在2-50nm范围内的材料，其比表面积大（通常为900 g/cm-3）、表面特性活泼（丰富的-OH），是一种很好的生物相容性药物载体。但是，采用介孔硅纳米材料制备兼具还原响应性和靶向性的药物载体时，需要通过多个工艺步骤来进行表面修饰。目前，在制备介孔硅纳米材料药物载体的领域中，由于工艺的原因，往往还原响应性和靶向性难以兼顾，而且转化率较低，药物的性能不尽人意。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在构建一种兼具细胞特异性靶向性和还原性物质/酶响应性的介孔硅/胶原—乳糖酸多功能复合型控释系统。该方法具有操作简单、成本低廉、通用性强，不需要特殊设备。利用该方法制备的多功能性介孔硅/胶原分子纳米复合材料具有较好的细胞相性；其能被肝癌细胞所特异性识别，并能在细胞内还原响应性酶（谷胱甘肽）的作用下实现定向“爆破”，在抗癌治疗领域具有广阔的临床应用价值。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的， 一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a．制备介孔硅纳米颗粒；
b．采用3-氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤a所得的介孔硅纳米颗粒，获得氨基化介孔硅纳米颗粒；
c．配置丁二酸酐和丙酮的混合液，所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的浓度为1～2 mol/L；将步骤b中获得的氨基化的介孔硅纳米复合材料按重量体积比0.0075～0.015g/mL加入到丙酮中，室温下搅拌3～6 h后，逐滴加入过量的所述丁二酸酐和丙酮的混合液，搅拌18～36 h，洗涤、离心分离、烘干后获得白色粉末状的羧基化的介孔硅纳米材料；
d．采用胱胺分子功能化步骤c所得的羧基化介孔硅纳米颗粒，制备出二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒；
e．将药物负载到步骤d所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内，再采用胶原分子封堵所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒，制备出介孔硅/胶原分子还原响应性纳米复合系统；
f．采用乳糖酸分子功能化步骤e所得的介孔硅/胶原分子纳米复合系统，制备出兼具细胞特异性靶向性和还原响应性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。
制备介孔硅纳米颗粒在本领域中具有多种方法，但是，所采用的工艺方法对介孔的孔径、表面活性等有重要影响。本发明公开一种制备介孔硅纳米颗粒的详细工艺，即所述步骤a中，所述制备介孔硅纳米颗粒是将十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠均匀分散至二蒸水中获得混合溶液，对混合溶液搅拌并加热至70～90℃后，采用匀速加样器将正硅酸四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中，并剧烈搅拌2 h，获得白色悬浊液。将所述白色悬浊液均匀分散于甲醇和盐酸的混合液之中，剧烈搅拌后，于水浴锅中回流48h，获得介孔二氧化硅纳米颗粒。本步骤中，所述十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠与正硅酸四乙酯的重量比为1∶0.1～0.3∶3～6。
作为优选步骤b中选用3-氨丙基三甲氧基硅烷来实现介孔硅纳米颗粒的氨基化，即所述制备氨基化介孔硅纳米颗粒是将步骤a中所获得的介孔二氧化硅纳米颗粒按重量体积比0.01～0.3g/mL均匀分散在甲苯中，搅拌24h后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，于55～65℃的水浴锅中回流36 h，离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料。本步骤中，所述甲苯与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为：70 ～100∶0.75～1.5。
本发明中，将介孔硅纳米材料羧基化是进一步获得二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒的必经环节。然而，将介孔硅纳米材料羧基化较为困难，且转化率较低。本发明公开了一种转化率高达95％的将介孔硅纳米材料羧基化的方法。即所述步骤c是将0.15g～0.3g的氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在丙酮溶液中，并于室温下搅拌3～6 h。然后，逐滴加入过量的1～2 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室温下继续搅拌18～36 h后离心获得白色粉末。最后，用双蒸水和无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料。
作为优选，所述步骤c是将0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室温下搅拌4 h。然后，逐滴加入10 mL丁二酸酐浓度为 1.5 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室温下继续搅拌24 h后离心获得白色粉末。最后，用双蒸水和无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料。
采用丁二酸酐处理后所获得的羧基化的介孔硅纳米材料中，羧基的活性较低。因此，为了提高转化率，步骤d中，需要先将步骤c所得的羧基化的介孔硅纳米材料、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解在pH=5～6的PBS缓冲液中，搅拌3 h，以活化所述羧基化的介孔硅纳米材料的羧基。再将过量的胱胺盐酸盐加入到活化后的所述羧基化的介孔硅纳米材料溶液中，室温下搅拌36～48h后离心。最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤所述离心操作所获得的产物，在高度真空中干燥后即得到所述二硫键功能化介孔硅纳米材料。
制备出二硫键功能化介孔硅纳米材料即完成了载体的制备，在进行封堵前，需要将药物负载到载体上。本发明的载体可以负载多种类型的药物。问了验证效果，本发明以异硫氰酸荧光素（FITC）作为标记“药物”，先将0.514 mM的FITC溶解于30 mL的pH ＝6.0的PBS缓冲溶液中，再加入步骤d所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒，使得FITC负载到所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内。之后将胶原、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、N-羟基琥珀酰亚胺和负载了FITC的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒在溶液中混合，室温搅拌24 h，离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统。本步骤中，所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒、胶原、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为：60～90∶15～25∶8～12∶3～6 。
步骤f中，是先将50～70 mg的乳糖酸、25～35 mg 的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和10～20 mg的N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解于3～5 mL的pH=5.5～6.5的 PBS溶液中获得混合物，室温搅拌4～6 h，以活化所述乳糖酸的羧基。之后，将本步骤中所述混合物加至步骤e所获得的介孔硅/胶原复合系统溶液中，搅拌18～24 h后，离心并使用pH=7.0～7.4的PBS缓冲溶液充分洗涤，即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统。
本发明还包括采用上述方法获得的兼具还原响应性和靶向性的多功能复合型介孔硅纳米药物载体。
本发明的有益效果在于：该方法具有操作简单、成本低廉、通用性强，不需要特殊设备。利用该方法制备的多功能性介孔硅/胶原分子纳米复合材料具有较好的细胞相容性。其能被肝癌细胞所特异性识别，并能在细胞内还原响应性酶（谷胱甘肽）的作用下实现定向“爆破”，在抗癌治疗领域具有广阔的临床应用价值。
附图说明
图1为介孔硅纳米颗粒和介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合颗粒的特征图：A和B分别为介孔硅纳米颗粒和介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合颗粒的透射电镜形貌图；C和D分别是修饰后介孔硅纳米颗粒的吸附等压线相对压力变化和孔径变化的特征图；
图2为介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合系统的还原响应性释放特性图：A是系统的还原响应性释放特性图（DTT刺激）；B是还原响应性脉冲式释放特性（DTT刺激）；C是系统的长时间还原响应性释放特性；
图3为共聚焦监控对照组（无纳米颗粒，a1-a3）、介孔硅纳米颗粒(b1-b3)和介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合颗粒(c1-c3)被细胞吞噬后的胞内分布状况；
图4为细胞流式仪监控肝癌细胞与纳米颗粒间的相互作用特性：A为肝癌细胞吞噬FITC荧光分子、MSNsFITC纳米颗粒和LA-Col-linker-MSNsFITC纳米复合颗粒后的荧光定量分析；B为肝癌细胞（HepG2）和内皮细胞（EC）吞噬LA-Col-linker-MSNsFITC纳米复合颗粒后的荧光定量分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，作出各种替换和变更，均应包括在本发明范围内。
本发明采用溶胶凝胶和模板法制备单分散的具有规则孔道结构的介孔硅纳米材料；而后利用化学修饰方法，在介孔硅纳米材料表面构建出具有多生物功能的介孔硅/胶原-乳糖酸复合纳米颗粒。在制备过程中，诸多因素可以影响介孔硅纳米材料颗粒的合成，例如反应溶液（水）的体积、水解主体（正硅酸四乙酯）和表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵）的浓度以及反应温度和pH条件等，不同的制备方法可得到具有不同形貌特征的介孔硅纳米材料。本发明对反应体系和反应条件进行了考察，包括不同比例的反应物（正硅酸四乙酯和正硅酸四乙酯在水溶液中的浓度）和反应条件等。结果显示，当十六烷基溴化铵/正硅酸四乙酯/水之间的质量比小于1：10：480或小于5：10：480的时候，制备的纳米颗粒不具有规则的介孔硅结构；当反应体系的温度低于60℃或pH小于9.5的时候，纳米颗粒的制备过程比较缓慢；而当将十六烷基溴化铵/正硅酸四乙酯/水之间的质量比控制在1：5: 480的时，反应温度置于80℃，pH条件置于11的条件时候，可以制备出具有规则孔道结构的介孔硅纳米材料；因此，本发明的反应主体优选十六烷基三级基溴化铵/正硅酸四乙酯 /水的质量比为1：5: 480，反应温度置于80℃，pH条件置于11。
实施例1
本实施例主要包括以下步骤：
a．利用溶胶凝胶和模板法制备出单分散的介孔硅纳米颗粒；
b．采用3-氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤a所得的介孔硅纳米颗粒，制备氨基化的介孔硅纳米颗粒；
c．采用琥珀酸酐与步骤b所得的氨基化介孔硅纳米颗粒反应，制备出羧基化的介孔硅纳米颗粒；
d．采用胱胺分子（富含二硫键）功能化步骤c所得的羧基化介孔硅纳米颗粒，制备出二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒；
e．采用胶原分子封堵步骤d所得的二硫键功能化介孔硅纳米颗粒，制备出介孔硅/胶原分子还原响应性纳米复合系统；
f．采用乳糖酸分子功能化e所得的介孔硅/胶原分子纳米复合系统，制备出兼具细胞特异性靶向性和还原响应性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。
优选的，所述步骤a是将200~800 mL的水溶液作为反应溶剂，0.5~2g的双亲性表面活性剂(十六烷基三甲基溴化铵，CTAB)作为模板剂，碱性条件（pH=11~13）和反应温度作为反应控制条件（75℃~85℃），通过正硅酸四乙酯的水解而合成。而后，将上述制备的带有表面活性剂介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散于100~150 mL的甲醇/盐酸（V：V=9：1）混合液中。剧烈搅拌后，将上述溶液置于65~80℃的水浴锅中回流36~48h，即可有效地抽取表面活性剂（CTAB），得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）。
更优选的是，所述步骤a是将1g十六烷基三甲基溴化铵与0.28 g氢氧化钠均匀分散至480 mL二蒸水中，剧烈搅拌并加热至80℃。用匀速加样器逐滴加入5 g正硅酸四乙酯至上述溶液中，并剧烈搅拌2 h，直至混合液成为白色悬浊液。而后，制备的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散于150 mL的甲醇/盐酸（135 mL：15 mL）混合液中。剧烈搅拌后，将上述溶液置于80℃的水浴锅中回流48h，即可有效地抽取表面活性剂（CTAB），得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）。
优选的，所述步骤b是利用3-氨基丙基硅烷偶联剂功能化步骤a得的介孔硅纳米颗粒；简单来说：就是将1.0~2.0g的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散在70 mL~100 mL的甲苯混合液中。剧烈搅拌24 h后， 加入0.75~1.5 mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于55-65℃的水浴锅中回流36~48 h，离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料(CTABMSNs-APTS)。
更为优选的，所述步骤b是利用3-氨基丙基硅烷偶联剂功能化步骤a得的介孔硅纳米颗粒；简单来说：将1.5g的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散在85 mL的甲苯混合液中。剧烈搅拌24 h后， 加入1 mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于60℃的水浴锅中回流36 h，离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料(CTABMSNs-APTS)。
优选的，所述步骤c是将0.15g~0.3g的氨基化的介孔硅纳米材料（APTS-MSN）均匀分散在丙酮溶液中，并于室温下搅拌3~6 h。然后，逐滴加入过量的1~2 mol/L的琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室温下继续搅拌18~36 h。最后，分别用双蒸水和无水乙醇充分洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料（COOH-MSNs）。
更为优选的，所述步骤c是将0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料（APTS-MSNs）均匀分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室温下搅拌4 h。然后，逐滴加入10 mL 1.5 mol/L琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室温下继续搅拌24 h。最后，分别用双蒸水和无水乙醇充分洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料（COOH-MSNs）。
优选的，所述步骤d是将0.1g~0.15g羧基化介孔纳米材料（COOH-MSNs），0.015~0.02mol的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)共同溶解在20~30 mL的PBS缓冲液中（pH=5~6），并搅拌3 h，活化介孔硅纳米材料的羧基。其次，将过量的1.0~2.0 g胱胺盐酸盐加入上述溶液，并在室温下搅拌36~48h。最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物，并在高度真空(＜1000 Pa)中干燥，除去介孔内残留的溶剂，即得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。
更为优选的，所述步骤d是将0.1g羧基化介孔纳米材料（COOH-MSNs），0.015 mol的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)共同溶解在20 mL的PBS缓冲液中（pH=5），并搅拌3 h，活化介孔硅纳米材料的羧基。其次，将1 g胱胺盐酸盐加入上述溶液，并在室温下搅拌36 h。最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物，并在高度真空(＜1000 Pa)中干燥，除去介孔内残留的溶剂，即得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。
优选的，所述步骤e是将0.5~0.6 mM的FITC溶解于25~40mL PBS (pH=5.5~6.5)缓冲溶液中。加入70~90 mg二硫键功能化的介孔硅纳米材料，搅拌18~24h。最后，将18~25 mg胶原，8-12 mg EDC和4~6 mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中，室温搅拌18~24 h。离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统，记为Col-linker-MSNs。
更为优选的，所述步骤e是将0.514 mM的FITC溶解于30 mL PBS (pH 6.0)缓冲溶液中。而后，加入80 mg二硫键功能化的介孔硅纳米材料，搅拌24h。最后，将20 mg胶原，10 mg EDC和5 mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中，室温搅拌24 h。离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统，记为Col-linker-MSNs。
优选的，所述步骤f是将50~70 mg乳糖酸、25-35 mg EDC以及10-20 mg NHS共同溶解于3~5 mL PBS溶液中（pH=5.5~6.5），室温搅拌4~6 h，活化乳糖酸的羧基。而后，将上述混合液加至介孔硅/胶原复合系统溶液中。搅拌18~24 h后，离心并使用PBS缓冲溶液（pH=7.0~7.4）洗涤多次，即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统。标记为LA-Col-linker-MSNs。
更为优选的，所述步骤f是将60 mg乳糖酸、30mg EDC以及15mg NHS共同溶解于4 mL PBS溶液中（pH=6.0），室温搅拌4 h，活化乳糖酸的羧基。而后，将4 mL上述混合液加至介孔硅/胶原复合系统溶液中。搅拌24 h后，离心，PBS缓冲溶液（pH 7.0）洗涤10次，即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统。标记为LA-Col-linker-MSNs。
实施例2
本实施例制备兼具还原响应性和靶向性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能纳米复合颗粒的制备。
包括以下步骤：a．介孔硅纳米颗粒的合成：首先，将1g十六烷基三甲基溴化铵与0.28 g氢氧化钠均匀分散至480 mL二蒸水中，剧烈搅拌并加热至80℃。用匀速加样器逐滴加入5 g正硅酸四乙酯至上述溶液中，并剧烈搅拌2 h，直至混合液成为白色悬浊液。而后，制备的带有表面活性剂的介孔硅纳米材料(CTABMSNs)均匀分散于150 mL的甲醇/盐酸（135 mL：15 mL）混合液中。剧烈搅拌后，将上述溶液置于80℃的水浴锅中回流48h，即可有效地抽取表面活性剂（CTAB），得到规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）。
b．氨基功能化介孔硅纳米颗粒的合成：首先，将a步骤所得的1.5g纳米颗粒(CTAB MSNs)均匀分散在85 mL的甲苯混合液中。剧烈搅拌24 h后， 加入1 mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于60℃的水浴锅中回流36 h，离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料(MSNs-APTS)。
c：羧基功能化介孔硅纳米颗粒的制备：首先，将b步骤所得的0.2g纳米材料（APTS-MSNs）均匀分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室温下搅拌4 h。然后，逐滴加入10 mL 1.5 mol/L琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室温下继续搅拌24 h。最后，分别用双蒸水和无水乙醇充分洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料（COOH-MSNs）。
d．二硫键功能化介孔硅纳米颗粒的制备：首先，将c步骤所得的0.1g纳米材料（COOH-MSN）、0.015 mol的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)共同溶解在20 mL的PBS缓冲液中（pH=5），并搅拌3 h，活化介孔硅纳米材料的羧基。其次，将1 g胱胺盐酸盐加入上述溶液，并在室温下搅拌36 h。最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤上述溶液的离心产物，并在高度真空(＜1000 Pa)中干燥，除去介孔内残留的溶剂，即得到二硫键功能化介孔硅纳米材料。
e．还原响应性介孔硅/胶原纳米复合系统的制备：首先，将0.514 mM的FITC溶解于30 mL PBS (pH 6.0)缓冲溶液中。而后，加入d步骤所得的80 mg的功能性纳米材料，搅拌24h。最后，将20 mg胶原，10 mg EDC和5 mg NHS共同加入到上述混合缓冲液中，室温搅拌24 h。离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统，记为Col-linker-MSNs。
f：兼具还原响应性和靶向性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能纳米复合颗粒的制备：首先，将60 mg乳糖酸、30mg EDC以及15mg NHS共同溶解于4 mL PBS溶液中（pH=6.0），室温搅拌4 h，活化乳糖酸的羧基。而后，将4 mL上述混合液加至e所得的纳米颗粒混和液中。搅拌24 h后，离心，PBS缓冲溶液（pH 7.0）洗涤10次，即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统。标记为LA-Col-linker-MSNs。
上述a步骤和f步骤处理后的介孔硅纳米材料和介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合颗粒的透射电镜图分别间图1. A和图1. B；可见本发明制备的介孔硅纳米颗粒具有规则有序的孔道结构，而经过胶原—乳糖酸分子修饰的介孔硅纳米材料的孔道比较模糊；该结果表明介孔硅胶原分子已经成功修饰至介孔硅纳米材料表面。实例a-f各个步骤处理后纳米材料的纳米孔道孔径和比表面积的特征分别间图1. C和图1. D；从图中可看出，介孔硅纳米颗粒的孔径和比表面积分别为~3.8 nm和~884 m2/g；而经过氨基、二硫键和胶原分子修时候，其孔径分别降低至3.3 nm、2.7 nm 和消失；而比表面积会分别降低至774 m2/g、474 m2/g、109 m2/g；上述结果进一步证明本发明所述的各个反应过程是成功可控的。
实施例3
本实施例作为本发明的第一个实验例，研究介孔硅/胶原—乳糖酸多功能纳米复合颗粒的还原响应性行为。
本研究以FITC作为模型药物，考察了介孔硅/胶原—乳糖酸复合系统的还原性响应性释放特性。
首先，本发明考察苏硫二糖醇（DTT）对纳米复合系统释放行为的影响。具体实验过程如下：将两组3.3 mg FITC标记的介孔硅/胶原—乳糖酸颗粒和3.3 mg胶原吸附的介孔硅纳米颗粒分别溶解于3 mL的 PBS中，并分别加载30 mg、0 mg和30 mg的DTT，制成三组混合液。而后，将上述混合液液全部转移到透析袋（分子量大于14000）中，并置于含有9 mL PBS的容器中，37℃旋转孵育24 h。在设定时间点取出培养液，荧光外分光光度计检测 520 nm处的荧光值。如图2.A所示：在DTT的刺激下，FITC标记的介孔硅/胶原—乳糖酸颗粒在2h内约80%的FITC荧光分子从纳米复合颗粒中“爆释”出来；而当其不具有DTT刺激信号时，约仅6.5%的FITC荧光分子从纳米复合颗粒中“泄露”出来；从而证实该系统对DTT具有快速的响应性。
而后，本发明继续考察FITC标记介孔硅/胶原—乳糖酸复合系统的“脉冲式”刺激响应。具体实验过程如下：首先，将3.3 mg的纳米复合系统溶解于3 mL的PBS中。并将该混合液液全部转移到透析袋（分子量大于14000）中，置于含有9 mL PBS的容器中，37℃旋转孵育3 h。而后，再加入40 mg DTT，考察FITC标记介孔硅/胶原—乳糖酸对DTT的“爆发式”刺激响应。最后，在设定时间点取出培养液，用荧光光度计检测FITC荧光强度，并绘制FITC的累积释放曲线。如图2.B所示：在不加载外界刺激信号时，2h内仅有7%的FITC分子从纳米复合颗粒候总释放出来；而当加载30mg 的DTT并培育3h后，高达80%的FITC分子从纳米复合颗粒中释放出来；上述结果表明介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合系统在生理条件下，能有效地封装功能药物；当暴露于还原性环境中时具有快速的响应性，突发式的释放功能药物。
最后，本发明考察FITC标记介孔硅/胶原—乳糖酸复合系统长时间暴露生理环境后，苏硫二糖醇的刺激性响应行为。具体实验过程如下：首先，将3.3 mg的FITC标记纳米复合颗粒溶解于3 mL 的PBS中。而后，将该混合液液全部转移到透析袋（分子量大于14000）中，并置于含有9 mL 的PBS容器中。37℃旋转孵育7天后，加入40mg DTT，考察纳米复合颗粒经过长时间的自然释放后，其对苏硫二糖醇的刺激响应性行为。最后，在设定时间点取出培养液，并用荧光分光光度计检测FITC的释放量。如图2. C所示：当FITC标记介孔硅/胶原—乳糖酸在PBS缓冲液中体外培育144 h后，约35%的FITC荧光分子泄露至缓冲液中。而当加入45 mg 的DTT后，约50%的FITC荧光分子立即“爆释”至溶液中；该结果表明制备的介孔硅/胶原—乳糖酸纳米复合系统具有长时间的还原响应性，并能长时间的有效封装功能性药物。
实施例4
本实施例作为本发明的第二个实验例，研究介孔硅/胶原—乳糖酸多功能纳米复合颗粒在肝癌细胞内的分布状况。
选取实施例2制备而得到的FITC标记的介孔硅/胶原—乳糖酸多功能纳米复合颗粒，并利用激光共聚焦扫描显微镜监控肝癌细胞（HepG2）内吞纳米复合颗粒后的胞内分布状况。如图3所示：当使用FITC模型药物与肝癌细胞共培养不同的时间后，肝癌细胞内部均不具有荧光分子（图3. a1-a3）；而当利用MSNsFITC纳米颗粒与肝癌细胞共培养2h后，肝癌细胞内出现荧光分子 (图3. b2)；培养4h和24h后，细胞内的荧光强度逐渐增强(图3. b2-b3)；当利用LA-Col-Linker-MSNsFITC颗粒与肝癌细胞共培养2h后，HepaG2细胞胞浆内出现了大量荧光颗粒（图3. a）；当培养4h和24h后，胞浆内的荧光强度（图3. b2-b3）明显强于其他实验组。该结果表明LA-Col-Linker-MSNFITC纳米颗粒能与HepaG2细胞持续的发生特异性作用，并被不断地被细胞摄入和环绕着细胞核分布，不损坏细胞的结构和损失细胞的功能。
实施例5
本实施例作为本发明的第三个实验例，研究介孔硅/胶原—乳糖酸多功能纳米复合颗粒与肝癌细胞/内皮细胞间的相互作用。
选取实施例2制备而得到的LA-Col-Linker-MSNFITC多功能纳米复合颗粒，并利用流式分析仪检测细胞吞噬纳米复合颗粒的效率。如图4. A所示：当利用MSNFTIC和LA-Col-Linker-MSNFITC纳米颗粒与HepaG2细胞分别培养2 h及4 h后，摄入LA-Col- Linker-MSNFITC颗粒的HepaG2细胞数量分别为MSNsFITC纳米颗粒的3倍及2倍。上述结果证实LA-Col-Linker-MSNFITC比MSNFITC更易被HepaG2细胞所吞噬。其机理在于：介孔硅纳米颗粒呈现负电荷特性，与细胞膜表面的负电荷相互排斥。而胶原/介孔硅纳米复合离子呈现中性电荷特征，易与细胞膜结合；同时胶原属于细胞外基质的重要组成部分，容易与细胞膜发生作用。此外，肝细胞膜上存在无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R），而乳糖酸是ASGP-R的一种特异配体，能与肝细胞膜上的ASGP-R发生特异性识别作用。
为了进一步考察LA-Col-Linker-MSNs纳米复合颗粒与HepaG2细胞的靶向特异性识别作用机制，本发明选取细胞流式仪检测不同类细胞吞噬LA-Col-Linker-MSNsFITC纳米复合颗粒的效率。由于HUVEC细胞株与HepaG2细胞具有相似的形态特征与生长模式，因此本发明选用其作为对照组。如图4.b所示：当LA-Col-Linker-MSNFITC纳米复合颗粒与HUVEC细胞株和HepaG2细胞分别培养2 h后，HepaG2细胞摄入纳米复合颗粒的量是HUVEC细胞摄入纳米复合颗粒的2倍；当培养4h后， HepaG2细胞摄入纳米复合颗粒的量是HUVEC细胞的2.2倍。结果表明LA-Col-Linker-MSNFITC纳米颗粒能与HepaG2细胞发生特异性识别作用。其机理在于肝细胞膜上存在无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R），而乳糖酸是ASGP-R的一种特异配体，能与肝细胞膜上的ASGP-R发生特异性识别作用。
Claims (9)
1.一种兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a．制备介孔硅纳米颗粒；
b．采用3-氨基丙基硅烷偶联剂修饰步骤a所得的介孔硅纳米颗粒，获得氨基化介孔硅纳米颗粒；
c．配置丁二酸酐和丙酮的混合液，所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的浓度为1～2 mol/L；将步骤b中获得的氨基化的介孔硅纳米复合材料按重量体积比0.0075～0.015g/mL加入到丙酮中，室温下搅拌3～6 h后，逐滴加入过量的所述丁二酸酐和丙酮的混合液，搅拌18～36 h，洗涤、离心分离、烘干后获得白色粉末状的羧基化的介孔硅纳米材料；
d．采用胱胺分子功能化步骤c所得的羧基化介孔硅纳米颗粒，制备出二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒；
e．将药物负载到步骤d所获得的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内，再采用胶原分子封堵所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒，制备出介孔硅/胶原分子还原响应性纳米复合系统；
f．采用乳糖酸分子功能化步骤e所得的介孔硅/胶原分子纳米复合系统，制备出兼具细胞特异性靶向性和还原响应性的介孔硅/胶原-乳糖酸多功能复合型纳米药物载体系统。
2. 根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：步骤a中，所述制备介孔硅纳米颗粒是将十六烷基三甲基溴化铵与氢氧化钠均匀分散至二蒸水中获得混合溶液，对混合溶液搅拌并加热至70～90℃后，采用匀速加样器将正硅酸四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中，并剧烈搅拌2 h，获得白色悬浊液；将所述白色悬浊液均匀分散于甲醇和盐酸的混合液之中，剧烈搅拌后，于水浴锅中回流48h，获得介孔二氧化硅纳米颗粒；本步骤中，所述十六烷基三甲基溴化铵、氢氧化钠与正硅酸四乙酯的重量比为1∶0.1～0.3∶3～6。
3.根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：步骤b中，所述制备氨基化介孔硅纳米颗粒是将步骤a中所获得的介孔二氧化硅纳米颗粒按重量体积比0.01～0.3g/mL均匀分散在甲苯中，搅拌24h后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，于55～65℃的水浴锅中回流36 h，离心即得到氨基化的介孔硅纳米复合材料；本步骤中，所述甲苯与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为：70 ～100∶0.75～1.5。
4.根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：所述步骤c是将0.15g～0.3g的氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在丙酮溶液中，并于室温下搅拌3～6 h；然后，逐滴加入过量的1～2 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室温下继续搅拌18～36 h后离心获得白色粉末；最后，用双蒸水和无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料。
5. 根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：所述步骤c是将0.2 g 氨基化的介孔硅纳米材料均匀分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室温下搅拌4 h；然后，逐滴加入10 mL丁二酸酐浓度为 1.5 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室温下继续搅拌24 h后离心获得白色粉末；最后，用双蒸水和无水乙醇分别洗涤离心得到白色粉末，除去残留溶剂，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅纳米材料。
6.根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：步骤d中，首先将步骤c所得的羧基化的介孔硅纳米材料、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解在pH=5～6的PBS缓冲液中，搅拌3 h，以活化所述羧基化的介孔硅纳米材料的羧基；再将过量的胱胺盐酸盐加入到活化后的所述羧基化的介孔硅纳米材料溶液中，室温下搅拌36～48h后离心；最后，用双蒸水和无水乙醇洗涤所述离心操作所获得的产物，在高度真空中干燥后即得到所述二硫键功能化介孔硅纳米材料。
7.根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：步骤e中，药物负载到二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒内后，将胶原、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、N-羟基琥珀酰亚胺和负载了药物的二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒在溶液中混合，室温搅拌24 h，离心得到的产物即为还原响应性介孔硅/胶原复合系统；本步骤中，所述二硫键修饰的介孔硅纳米颗粒、胶原、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为：60～90∶15～25∶8～12∶3～6 。
8.根据权利要求1所述的兼具还原响应性和靶向性的介孔硅纳米药物载体的方法，其特征在于：步骤f中，是先将50～70 mg的乳糖酸、25～35 mg 的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物和10～20 mg的N-羟基琥珀酰亚胺共同溶解于3～5 mL的pH=5.5～6.5的 PBS溶液中获得混合物，室温搅拌4～6 h，以活化所述乳糖酸的羧基；之后，将本步骤中所述混合物加至步骤e所获得的介孔硅/胶原复合系统溶液中，搅拌18～24 h后，离心并使用pH=7.0～7.4的PBS缓冲溶液充分洗涤，即得到乳糖酸功能化的还原响应性细胞靶向介孔硅/胶原复合系统。
9.采用1～8任一权利要求所获得的兼具还原响应性和靶向性的多功能复合型介孔硅纳米药物载体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130306 |