CN105153412B

CN105153412B - 一种多肽嵌段聚合物及其制备方法、用途

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Publication number: CN105153412B
Application number: CN201510425356.4A
Authority: CN
Inventors: 李景果; 栗占荣; 张俊杰; 王丽娅
Original assignee: INST OF OPHTHALMOLOGY HENAN PROV
Current assignee: INST OF OPHTHALMOLOGY HENAN PROV
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: CN105153412A

Abstract

本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体涉及一种多肽嵌段聚合物及其制备方法、用途。分子式为：PLAsp(DIP)_n‑b‑PLLys_m。制备步骤：(1)合成N‑ε‑苄氧羰基赖氨酸苄酯；(2)合成N‑ε‑苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys‑NCA；(3)合成β‑天冬氨酸苄酯；(4)合成β‑天冬氨酸酸酐BLAsp‑NCA；(5)合成Bu‑PBLAsp_n；(6)合成PBLAsp_n‑b‑PCBLLys_m；(7)合成PLAsp(DIP)_n‑b‑PCBLLys_m；(8)合成PLAsp(DIP)_n‑b‑PLLys_m。多肽嵌段聚合物作为药物传输载体的用途。本发明多肽嵌段聚合物自组装形成囊泡体系，可以作为药物联合传输载体，该囊泡体系对pH敏感，可以同时传输化学药物和基因药物，达到协同增效；该载体由多肽单元组成，生物相容性好，毒性小，该载体可以联合传输两种药物，从而实现载体定位、化疗与基因治疗的一体化，具有广泛的应用价值。

Description

一种多肽嵌段聚合物及其制备方法、用途

技术领域

本发明属于高分子化学与生物医学工程技术领域，具体涉及一种多肽嵌段聚合物及其制备方法、用途。

背景技术

恶性肿瘤已成为威胁人类身体健康的重大疾病，化学药物治疗和基因治疗是临床上的两种主要治疗手段，但化学药物治疗中抗肿瘤药物的应用同时有很多缺陷：多数具有很大的毒性，缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，会杀伤大量的正常细胞；而基因治疗中基因药物的非特异性的细胞吸收、容易被体内活性物质吸附、容易被巨噬细胞吞噬和生物酶分解等体内应用时的不稳定性，也影响了其应用。化学药物治疗和基因治疗两种最有前景的癌症治疗方法，都需要用载体高效安全地输送到肿瘤细胞。因此，设计和开发出安全有效的运输方式，具有重要的现实意义与广泛的应用前景。聚合物纳米载体被认为是最有应用前景的用于癌症治疗的运输方式

聚合物纳米载体是将纳米技术与纳米材料应用于药学领域产生的，是纳米医学新领域，近年来发展十分迅速。这些纳米载体材料具有调节药物在机体内分布和代谢的功能，在不损害机体健康组织的情况下，选择性地抑制和杀死癌变组织及细胞。聚合物纳米载体被认为在解决基因和化学治疗的困难中起到了重要的作用而成为研究热点。聚合物纳米载体因其具有高的载药能力、长的体内循环时间、低的自身毒性等优点，引起越来越多的关注和应用。

作为输送抗癌药物和基因药物的聚合物载体，智能性地控制释放是提高药物疗效的一个关键因素。将药物智能输送到病变组织和细胞后，只有药物快速释放，达到一定的药物浓度才能获得很好的治疗效果。目前纳米药物载体研究面临的两大难题：一是载药纳米粒子在运输过程中的药物渗漏，会影响疗效并产生毒副作用；二是载药纳米粒子在进入病变部位细胞之后，药物释放变得过于缓慢，不仅难以杀死细胞，而且还会诱导细胞产生耐药性。为解决这两个难题，必须设计并合成新型的聚合物药物体系，并发展有效控制药物释放方法，从而改善药物释放性能，提高药物的生物利用率。刺激敏感型聚合物纳米载体，因其能有效进行药物的控制释放，近年来逐渐引起人们的广泛关注。在众多的刺激敏感型聚合物纳米载体，研究最多的是具有pH敏感型聚合物纳米载体。

化疗过程中，肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性是化疗失败或效果不佳的重要原因。造成肿瘤细胞产生多药耐药性的原因与抗细胞凋亡基因和药物流出基因两类耐药基因的表达上调有关，导致通过化疗诱导肿瘤细胞凋亡的作用大大降低。通过siRNA可以高效沉默细胞抗凋亡基因的表达，使细胞对放疗的敏感性显著提高。抑制肿瘤抗药性成为提高肿瘤化疗效果的关键，通过RNA干扰技术抑制癌细胞耐药基因的表达，有望解决肿瘤耐药性的难题。小分子抗癌药物和核酸药物联合治疗是改善治疗效果的有效途径。

抗癌药物和基因药物的联合治疗可以提高肿瘤组织的治疗效果，增强抗肿瘤效应；同时可降低化疗药物对正常组织器官的毒性作用，增加药物的靶向性；两者联用还有助于防止和推迟耐药性的产生，两种给药方式的优势互补，可以起到协同的肿瘤治疗效果，同时也为肿瘤的治疗提供了较为崭新的思路与方法，也为肿瘤的临床治疗提供了科学的理论基础。目前现有技术中缺乏能同时实现化疗、基因治疗和精确定位的多功能纳米载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有肿瘤化学药物和基因药物治疗所用的靶向药物载体的研究缺陷，提供一种多肽嵌段聚合物，同时提供其制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种多肽嵌段聚合物，分子式为：PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m，结构式为：

其中，m、n为正整数，且m∶n＝1∶5。

制备方法，包括以下步骤：

S1.合成N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯：以赖氨酸/赖氨酸盐酸盐和氯甲酸苄酯为原料，硫酸铜为催化剂，NaOH溶液和/或NaHCO₃溶液为溶剂，于-4～4℃反应；反应结束后，后处理得N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯；

S2.合成N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys-NCA：以N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯和三光气为原料，乙酸乙酯为溶剂，回流反应；反应结束后，后处理得N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys-NCA；

S3.合成β-天冬氨酸苄酯：以天冬氨酸和苯甲醇为原料，无水乙醚为溶剂，浓硫酸为催化剂，室温反应；反应结束后，后处理得β-天冬氨酸苄酯；

S4.合成β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA：以β-天冬氨酸苄酯和三光气为原料，乙酸乙酯为溶剂，回流反应；反应结束后，后处理得β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA；

S5.合成Bu-PBLAsp_n：以BLAsp-NCA和正丁胺为原料，CH₂Cl₂为溶剂，于35～40℃反应；反应结束后，后处理得Bu-PBLAsp_n；

S6.合成PBLAsp_n-b-PCBLLys_m：以Bu-PBLAsp_n和CBLLys-NCA为原料，DMF为溶剂，N₂保护下，于35～40℃反应；反应结束后，后处理得PBLAsp_n-b-PCBLLys_m；

S7.合成PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m：以PBLAsp_n-b-PCBLLys_m和N，N-二异丙基乙二胺为原料，DMSO为溶剂，于35～40℃反应；反应结束后，后处理得PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m；

S8.合成PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m：以PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m和溴化氢为原料，冰醋酸为溶剂，室温反应；反应结束后，后处理得PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m；

S1-S8中，N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯、N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys-NCA、β-天冬氨酸苄酯、β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA、Bu-PBLAsp_n、PBLAsp_n-b-PCBLLys_m、PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m、PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m的结构式分别为：

具体步骤为：

S1.合成N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯：将80～120mmol赖氨酸/赖氨酸盐酸盐和160～240mmol NaOH溶于60～100ml水中配成溶液，将40～60mmol硫酸铜溶于30～50ml水中形成的硫酸铜溶液滴加到上述溶液中；将反应体系降到-4～4℃，此条件下，加入90～150mmolNaHCO₃，然后滴加100～160mmol的氯甲酸苄酯，-4～4℃条件下反应2～4h；室温静置，将反应体系中的沉淀收集，依次用水和丙酮洗涤，干燥；将90～130mmol EDTA加入到300～500ml水中，煮沸，将上述产物分批加入，同时用盐酸调节体系的pH值，使保持在6～8，收集沉淀，沉淀在水中重结晶两次，得目标产物N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯；

S2.合成N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys-NCA：8～12g N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯中加入150～250mL乙酸乙酯，升温到回流状态，搅拌下，滴加三光气3.0～4.2g的乙酸乙酯溶液80～120ml；滴加结束，待反应液变透明后，再反应0.2～1h，停止加热；密封反应体系，用冰盐浴冷却，冷却完全后，依次用0～6℃的饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，加入石油醚沉淀，0～4℃静置，收集沉淀，乙酸乙酯/石油醚重结晶，干燥，得目标产物N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐CBLLys-NCA；

S3.合成β-天冬氨酸苄酯：5～15ml浓硫酸用80～120ml无水乙醚稀释后，冷却至室温，加入120～150mL苯甲醇，搅拌，蒸掉乙醚；分批加入0.1～0.2mol天冬氨酸，室温反应20～28h后；加入180～220mL 95％乙醇和30～70ml吡啶，0～4℃静置，收集沉淀，先用水洗涤再用无水乙醚洗涤，抽干，沉淀在水中重结晶，得β-天冬氨酸苄酯；

S4.合成β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA：20～30gβ-天冬氨酸苄酯中加入150～250mL乙酸乙酯，升温到回流状态，搅拌下，滴加三光气12.1～14.5g的乙酸乙酯溶液100～150ml；滴加结束，待反应液变透明后，再反应0.2～1h，停止加热；密封反应体系，用冰盐浴冷却，冷却完全后，依次用0～6℃的饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，加入石油醚沉淀，0～4℃静置，收集沉淀，乙酸乙酯/石油醚重结晶，干燥，得到标产物β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA；

S5.合成Bu-PBLAsp_n：15～25μL正丁胺中加入50～80mL CH₂Cl₂，充分搅拌；称取5～8g BLAsp-NCA，加入2～8mLDMF溶解，然后将DMF溶液滴加到CH₂Cl₂溶液中，摇匀；密封反应体系，35～40℃加热搅拌反应60～80h；反应结束后，先蒸馏除去CH₂Cl₂，再将反应液滴入乙醚中沉淀，-15～-20℃静置，乙醚反复离心洗涤沉淀，真空干燥得目标产物Bu-PBLAsp_n；

S6.合成PBLAsp_n-b-PCBLLys_m：2.5～4.0g Bu-PBLAsp_n溶解在10～20mL DMF中；1.0～1.5g CBLLys-NCA溶解在10～15mL DMF中，并转移到上述体系中，N₂保护下，35～40℃反应60～80h；将反应液滴入乙醚中沉淀，收集沉淀，得目标产物PBLAsp_n-b-PCBLLys_m；

S7.合成PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m：称取1.6～2.0g PBLAsp_n-b-PCBLLys_m，用15～20mL DMSO溶解，加入8～10mLN，N-二异丙基乙二胺，于35～40℃搅拌下反应24～36h；将反应液滴入乙醚中沉淀，收集沉淀，得目标产物PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m；

S8.合成PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m：0.2～0.3mmol PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m溶解到30～40mL冰醋酸中，加入3～8mL质量分数33％的HBr冰醋酸溶液，室温下搅拌反应3～5h；然后加入乙醚沉淀，收集沉淀并用乙醚洗涤，蒸去乙醚，干燥；干燥后的聚合物用水溶解，水中透析5～7天，得目标产物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m。

多肽嵌段聚合物作为药物传输载体的用途。

所述药物为化学药物和/或基因药物。

所述药物传输载体是由多肽嵌段聚合物自组装得到的囊泡体系；自组装得到囊泡体系的过程为：多肽嵌段聚合物在酸性条件下溶解，然后用浓度逐渐减小的碱液调节溶液pH至7.2～7.6，然后经过滤膜过滤即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明多肽嵌段聚合物自组装形成囊泡体系，可以作为药物联合传输载体，该囊泡体系对pH敏感，可以同时传输化学药物和基因药物，达到协同增效；该载体由多肽单元组成，生物相容性好，毒性小，该载体可以联合传输两种药物，从而实现载体定位、化疗与基因治疗的一体化，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1：聚合物Bu-PBLAsp_n(A)和PBLAsp_n-b-PCBLLys_m(B)的核磁谱图；

图2：聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m(A)和PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m(B)的核磁谱图；

图3：聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m在不同pH下的核磁谱图；

图4：聚合物Bu-PBLAsp_n、PBLAsp_n-b-PCBLLys_m、PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m(A)和PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m(B)的凝胶渗透色谱图；

图5：PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m(a)，PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m(b)和PBLAsp_n-b-PCBLLys_m(c)红外谱图；

图6：空白囊泡药物负载前后粒径变化图(A)和不同氮磷比下联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)的粒径和电位图(B)；

图7：联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)在不同氮磷比下的凝胶电泳图；

图8：聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m的酸碱滴定图；

图9：空白囊泡的透射电镜图。

图10：载药囊泡PAL@DOX在不同pH下的荧光谱图(A)和药物释放图(B)；

图11：联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)被细胞吸收后不同时间点的激光共聚焦图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1多肽嵌段聚合物的合成

多肽嵌段聚合物，分子式为：PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m，结构式为：

其中，m＝25，n＝125。

PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m合成步骤：

(1)N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯的合成，反应机理及反应过程如下：

赖氨酸盐酸盐18.25g(100mmol)和NaOH 8.0g(200mmol)溶于80ml水中配成溶液，30℃条件下，将硫酸铜溶液(12.5g五水硫酸铜(50mmol)溶于40ml水中)滴加到上述溶液中；将反应体系降到0℃，此条件下，加入10g NaHCO₃(120mmol)，然后滴加过量的氯甲酸苄酯19ml(130mmol)，0℃条件下反应3小时，室温过夜；将反应体系中的N-Cbz-Lys-Cu²⁺络合物蓝色沉淀收集，依次用200ml水和100ml丙酮洗涤，干燥；将40g EDTA(110mmol)加入到400ml水中，煮沸，将上述产物分批加入，同时用盐酸调节体系的pH值，使保持在7.0，收集白色沉淀，沉淀在水中重结晶两次，-50℃冻干，得到目标产物N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯；

(2)N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐(CBLLys-NCA)的合成，反应机理及反应过程如下：

10g N-ε-苄氧羰基赖氨酸苄酯加入到干燥的500mL三口瓶中，然后加入200mL新蒸的乙酸乙酯，升温到回流状态，搅拌下，缓慢滴加三光气(3.6g)的乙酸乙酯溶液(100ml)；滴加结束后，待反应液变透明后，再反应半个小时后，停止加热；将反应体系密封后，用冰盐浴冷却，冷却完全后，依次快速地用冷(4℃)的饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，加入大量新蒸石油醚沉淀，(4℃)冷冻过夜；将沉淀收集，乙酸乙酯/石油醚重结晶两次，干燥，得到目标产物N-ε-苄氧羰基赖氨酸酸酐(CBLLys-NCA)；

(3)β-天冬氨酸苄酯的合成，反应机理及反应过程如下：

取500mL单口茄形瓶，浓硫酸10ml用100ml无水乙醚边加边搅拌稀释后，冷却至室温，加入100mL苯甲醇，充分搅拌，蒸掉乙醚；天冬氨酸L-aspartic acid共13.3g(0.1mol)分三批加入，室温下搅拌反应24h后，加入200mL 95％乙醇，强力搅拌下缓慢滴加吡啶50ml，逐渐有白色沉淀产生；将混合物低温(4℃)放置过夜，收集沉淀，用超纯水洗涤洗多次，再用无水乙醚洗涤两次，抽干，沉淀在水中重结晶两次，得到目标产物β-天冬氨酸苄酯(β-benzyl-L-aspartate)；

(4)β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA的合成，反应机理及反应过程如下：

25gβ-天冬氨酸苄酯加入到干燥的500mL三口瓶中，然后加入200mL新蒸的乙酸乙酯，升温到回流状态，搅拌下，缓慢滴加三光气(13.3g)的乙酸乙酯溶液(100ml)；滴加结束后，待反应液转透明后，再反应半个小时后，停止加热；将反应体系密封后，用冰盐浴冷却，冷却完全后，依次快速地用冷(4℃)的饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，加入大量新蒸石油醚沉淀，(4℃)冷冻过夜；将沉淀收集，乙酸乙酯/石油醚重结晶两次，干燥，得到目标产物β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA；

(5)Bu-PBLAsp_n的合成，反应机理及反应过程如下：

手套箱中，将约19μL新蒸的正丁胺，加至100mL干燥的反应烧瓶中，再加入50mL新蒸的CH₂Cl₂，充分搅拌；用小烧杯称取6.5g BLAsp-NCA，加入5mL DMF溶解；然后将DMF溶液滴加到CH₂Cl₂溶液中，充分摇匀，反应开始有大量小气泡生成；密封反应瓶，移出手套箱，置于35℃的油浴中加热搅拌反应72h；反应结束后，先蒸馏除去绝大部分CH₂Cl₂，将混合液滴入过量的乙醚(约500mL)中沉淀，-18℃低温冰箱冷冻过夜，经离心和无水乙醚的反复洗涤，真空干燥得到目标产物Bu-PBLAsp_n，其核磁谱图见图1A，凝胶渗透色谱图见图4A；

(6)PBLAsp_n-b-PCBLLys_m的合成，反应机理及反应过程如下：

Bu-PBLAsp_n 3.2g，用20mL DMF溶解；1.03g CBLLys-NCA溶解在10mL无水DMF中，并转移到上述体系中，N₂保护下，35℃反应72h；将反应混合物乙醚中沉淀，收集沉淀，得白色粉末，即为目标产物PBLAsp_n-b-PCBLLys_m，其核磁谱图见图1B，凝胶渗透色谱图见图4A，其红外谱图见图5c；

(7)PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m的合成，反应机理及反应过程如下：

PBLAsp_n-b-PCBLLys_m 1.61g，15mL DMSO溶解，加N，N-二异丙基乙二胺(DIP)8mL，于40℃搅拌下反应24h；将反应混合物在乙醚中沉淀，收集沉淀，得白色粉末，即为目标产物PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m，其核磁谱图见图2A，凝胶渗透色谱图见图4A，其红外谱图见图5b；

(8)PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m的合成，反应机理及反应过程如下：

1.85g(0.25mmol)PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m溶解到30mL冰醋酸中，加入5mL HBr的冰醋酸溶液(质量分数33％HBr)，室温下搅拌3h，然后加入过量的无水乙醚沉淀，收集沉淀，并用乙醚洗涤4次，蒸去乙醚，干燥；干燥后的聚合物用去离子水溶解，去离子水中透析5天，-50℃冻干，得白色粉末，即为目标产物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m，其核磁谱图见图2B，凝胶渗透色谱图见图4B，其红外谱图见图5a。PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m在不同pH下的核磁谱图见图3。

实施例2空白囊泡和载药囊泡PAL@DOX的制备

空白囊泡的制备：称取20mg实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m，用稀盐酸(1％，质量浓度)溶解，pH约为2.0，搅拌1h；20分钟内，用0.5M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至5.0；然后20分钟内，用0.05M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至6.4；最后，30分钟内，用0.001M的NaOH水溶液将pH值由6.4缓慢调至7.4，然后经过450nm的滤膜过滤，最终获得空白囊泡溶液。

载药囊泡(PAL@DOX)使用相同的方法制备：称取实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m 20mg和阿霉素盐酸盐2mg，用稀盐酸(1％，质量浓度)溶解，pH约为2.0，搅拌1h；20分钟内，用0.5M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至5.0；然后20分钟内，用0.05M的NaOH水溶液将pH值缓慢调至6.4；最后，30分钟内，用0.001M的NaOH水溶液将pH值由6.4缓慢调至7.4；通过透析除去游离的阿霉素，然后经过450nm的滤膜过滤以除去大的聚集体，最终得到负载阿霉素的载药囊泡(PAL@DOX)溶液。

空白囊泡药物负载前后粒径变化图见图6A，其中Drug-free为药物负载前，对应于空白囊泡；Drug-loaded为药物负载后，对应于载药囊泡PAL@DOX。由图6A可知：空白囊泡的平均粒径为189nm，负载DOX后囊泡平均粒径为198nm。

实施例3载药囊泡PAL@siRNA和联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)的制备

一定量siRNA(1μg，购自广州市锐博生物科技有限公司)加入到已知量的实施例2中的空白囊泡和载药囊泡(PAL@DOX)的溶液中，按照多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m中氨基与siRNA磷酸根的摩尔比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、8∶1比例混合。用去离子水补至实验所需体积，混匀后在摇床上振荡30min，静置10min，即得到一系列不同N/P的负载siRNA的载药囊泡PAL@siRNA溶液和联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)溶液。

以动态光散射仪(DLS)测定实施例2载药囊泡PAL@DOX和实施例3联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)的粒径和表面电位，不同氮磷比下的联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)的粒径和电位图见图6B。由图6B可知：通过DLS测定发现，负载siRNA后，高氮磷比下囊泡具有高的表面电位；随着氮磷比的增加，表面电位增加，平均粒径先降低后维持恒定。负载siRNA之前，PAL@DOX的表面电位为+45.9mV，平均粒径为198nm。氮磷比为2负载siRNA后表面电位下降到+31.9mV，粒径变为203nm。

不同氮磷比下的联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)的凝胶电泳图见图7，可知氮磷比为2时，可以达到siRNA完全负载。

实施例4酸碱滴定实验

实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m的缓冲能力通过酸碱滴定实验测定。方法如下：15mg实施例1中的多肽嵌段聚合物PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m溶解于5mL质量百分数1％的稀盐酸溶液，用1N氢氧化钠溶液滴定至溶液呈pH值为11，然后此溶液用1.5NHCl滴定至pH值为2，并用全自动电位滴定仪记录加酸的体积以及对应的pH值，酸碱滴定图见图8。由图8可知：多肽嵌段聚合物在pH 3.0到11.3之间表现出明显的质子缓冲能力，这种缓冲能力归因于多肽嵌段聚合物中共同存在的赖氨酸嵌段和叔氨基化的聚天冬氨酸嵌段。

实施例5载体结构的证明

以透射电子显微镜(TEM)表征实施例2中空白囊泡的形貌，以PhihPsCM120电子显微镜表征，激发电压为60KV。样品的制备方法如下：将10μL实施例2中的空白囊泡溶液滴于铜网上，静置1min后，以滤纸吸干；将铜网放在加有硅胶的干燥器中，6h后，以醋酸铀水溶液(质量浓度为2％)对样品进行染色，静置1min后，用滤纸吸干，将铜网置于干燥器继续室温干燥。TEM图见图9。由图9可知：多肽囊泡为空心球状结构。

实施例6阿霉素载药量的测定

定义DOX在载药囊泡PAL@DOX溶液中的重量百分比为药物负载量，用PE-Lambda750紫外-可见分光光度计检测。首先，将实施例2中的负载DOX的载药囊泡PAL@DOX溶液冻干，称取后溶于DMSO和氯仿(V∶V，1∶1)中，紫外可见分光光度计检测485nm处DOX的吸光度。然后，配制一系列浓度的DOX DMSO和氯仿(V∶V，1∶1)溶液，检测485nm处的吸光度，用浓度和吸光度作出DOX吸光度的标准曲线，根据这条标准曲线算出载药囊泡PAL@DOX中DOX的负载量为6.4％。

实施例7载药囊泡在不同pH值下的荧光变化

取实施例2中的负载DOX的载药囊泡PAL@DOX溶液两份，每份2mL，将一份用pH5.0的PBS调节pH为5.0。两份溶液定容至5mL，用荧光光谱仪(Perkin ElmerPE-LS55，USA)测定其荧光光谱，结果见图10A。荧光扫描的激发波长为485nm，发射波长为500-700nm，激发狭缝及发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度为500nm/min。由图10A可知：与pH 7.4条件下相比，pH 5.0条件下592nm的DOX的荧光强度显著增加，表明DOX的释放量更多，聚合物囊泡的药物释放性能具有pH敏感性。

实施例8载药囊泡中DOX的酸敏释放行为

用透析的方法来做DOX的体外释放实验，分别在pH 7.4的人体生理环境和pH 5.0的酸性环境下进行体外释放研究。取实施例2中的负载DOX的载药囊泡PAL@DOX溶液两份，一份维持其pH 7.4，将另一份调至5.0。再将每个pH值下的样品分成三份(平行实验)，转移至透析袋(MWCO＝14kDa)中，置于30mL的相同磷酸盐缓冲溶液(pH值7.4)中。接着整个释放实验在转速为75r/min，温度为37℃恒温空气浴摇床中进行。设定的时间点，收集透析袋外面的缓冲液进行紫外测量并更换补齐新鲜的缓冲液。用紫外可见分光光度计检测所取样品在波长485nm处的阿霉素的紫外吸收强度。然后，配制一系列浓度的DOX水溶液，检测485nm处的吸光度，用浓度和吸光度作出DOX吸光度的标准曲线。根据标准曲线计算所取样品溶液中DOX的浓度，进而计算出DOX的释放量，以时间对DOX累积释放量作图，结果见图10B，可知：pH5.0条件下，DOX释放更快，4h内释放了大约70％的药物，24h超过80％。然而，pH 7.4条件下，DOX的释放是非常缓慢，24h仅仅释放了36％的DOX。pH 5.0条件下，聚合物囊泡解体，快速释放所负载的药物。

实施例9激光共聚焦显微镜检测

将HepG2细胞以1×10⁴细胞每孔接种在24孔板上，加入400μLRPMI 1640培养基(包含质量百分数10％的胎牛血清FBS)，37℃下在5％CO₂培养箱中培养24h。将实施例3中的联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)溶液40μL用无血清RPMI 1640培养基稀释到400μL，加入到上述细胞培养液中孵育4h/8h。弃去旧培养基，将细胞用蓝色荧光染料DAPI染细胞核30min，再用pH 7.4的PBS洗三次。用激光共聚焦(CLSM)观察加入实施例3中的联合载药囊泡4h和8h绿色荧光标记的siRNA和DOX红色荧光在细胞内的分布情况。DOX、siRNA和DAPI的激发波长，分别为485，490和358nm，发射波长分别为595，525和455nm。联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)被细胞吸收后不同时间点的激光共聚焦图见图11。由图11可知：联合载药囊泡PAL@(DOX/siRNA)可以将负载的DOX和siRNA同步传输到同一个细胞中。相对于4h，孵育时间延长到8h，DOX的荧光在包括细胞核和细胞质在内的整个细胞内分布，而siRNA荧光仅仅还在细胞质中，DOX的释放表现出时间依赖性。这些结果表明，在酸性的溶酶体环境中，DOX能快速地从酸性敏感聚合物囊泡中释放并迁移到细胞核中。这些细胞内结果和体外释放结果相一致。

Claims

1.一种多肽嵌段聚合物，其特征在于分子式为：PLAsp(DIP)_n-b-PLLys_m，结构式为：

其中，m、n为正整数，且m：n＝1:5。

2.一种制备如权利要求1所述的多肽嵌段聚合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

S7.合成PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m：以PBLAsp_n-b-PCBLLys_m和N,N-二异丙基乙二胺为原料，DMSO为溶剂，于35～40℃反应；反应结束后，后处理得PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m；

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体步骤为：

S4.合成β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA：20～30gβ-天冬氨酸苄酯中加入150～250mL乙酸乙酯，升温到回流状态，搅拌下，滴加三光气12.1～14.5g的乙酸乙酯溶液100～150ml；滴加结束，待反应液变透明后，再反应0.2～1h，停止加热；密封反应体系，用冰盐浴冷却，冷却完全后，依次用0～6℃的饱和碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，加入石油醚沉淀，0～4℃静置，收集沉淀，乙酸乙酯/石油醚重结晶，干燥，得到目标产物β-天冬氨酸酸酐BLAsp-NCA；

S5.合成Bu-PBLAsp_n：15～25μL正丁胺中加入50～80mL CH₂Cl₂，充分搅拌；称取5～8gBLAsp-NCA，加入2～8mL DMF溶解，然后将DMF溶液滴加到CH₂Cl₂溶液中，摇匀；密封反应体系，35～40℃加热搅拌反应60～80h；反应结束后，先蒸馏除去CH₂Cl₂，再将反应液滴入乙醚中沉淀，-15～-20℃静置，乙醚反复离心洗涤沉淀，真空干燥得目标产物Bu-PBLAsp_n；

S7.合成PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m：称取1.6～2.0g PBLAsp_n-b-PCBLLys_m，用15～20mLDMSO溶解，加入8～10mL N,N-二异丙基乙二胺，于35～40℃搅拌下反应24～36h；将反应液滴入乙醚中沉淀，收集沉淀，得目标产物PLAsp(DIP)_n-b-PCBLLys_m；

4.如权利要求1所述的多肽嵌段聚合物作为药物传输载体的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述药物为化学药物和/或基因药物。

6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述药物传输载体是由多肽嵌段聚合物自组装得到的囊泡体系；自组装得到囊泡体系的过程为：多肽嵌段聚合物在酸性条件下溶解，然后用浓度逐渐减小的碱液调节溶液pH至7.2～7.6，然后经过滤膜过滤即可。