CN113913453A - 植物细胞转基因纳米载体的制备和应用 - Google Patents

植物细胞转基因纳米载体的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用，属于纳米载体技术领域，本发明制备了两种尺寸的介孔硅纳米颗粒，氨基修饰后对其进行表征，并负载含smGFP基因的质粒DNA对拟南芥原生质体进行细胞转导。结果表明：Am‑MSN‑20呈类球形，花形结构的Am‑MSN‑50直径约50nm，两者均带正电荷。Am‑MSN‑50结合DNA的能力高于Am‑MSN‑20，两种纳米载体都表现出了良好的稳定性，能够保护负载的质粒DNA不被细胞核酸酶降解，并且对原生质体没有毒害作用。与Am‑MSN‑20相比较，Am‑MSN‑50具备更高的转导效率。本发明表明，氨基修饰的MSNs有望成为一种安全高效的新型植物基因载体。

Description

植物细胞转基因纳米载体的制备和应用
技术领域
本发明涉及纳米载体技术领域，特别是涉及一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用。
背景技术
遗传转化是植物分子育种和功能基因组研究的重点工作之一。研发稳定、高效的遗传转化新方法，是遗传育种、分子生物学和基因工程等领域长期关注的焦点问题。目前，基因枪轰击、农杆菌侵染和病毒侵染等是常用的传统植物遗传转化方法。但是，这些方法存在一些不足之处。例如基因枪轰击法具有成本高；容易形成嵌合体，造成转基因的失活或沉默；所需外源DNA量大以及植物组织损伤大等缺点。农杆菌介导转化受体物种有限，并且易产生随机插入造成非目标基因功能失活。对于大多数木本植物或顽拗型基因型的植物来说，仍存在遗传转化技术难题。利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高，但其安全性受到质疑，目前该方法主要用于动物的基因转移。
近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料作为基因载体在植物遗传转化、动物细胞和医学治疗等领域得到了广泛的应用。纳米材料具备独特的理化性质，表面能大大增加，易与其他原子结合变稳定，粒子上的官能团密度和选择性吸附能力变大，可以通过表面修饰精准地调控其与生物分子(如DNA、RNA以及蛋白)的相互作用。另外，零维和一维的纳米材料可以不借助外力穿透细胞膜，容易进入到植物细胞的内部，使得它成为重要生物分子极佳的传送载体。利用不同化学基团对纳米颗粒表面进行功能化修饰，通过物理或化学亲和作用装载或者吸附靶向外源DNA等核酸分子，构建成纳米核酸复合物。然后，通过静电吸附或化学键作用与细胞受体结合，利用细胞胞吞作用将纳米复合物导入植物细胞，释放外源目的基因，最终实现纳米载体介导的植物遗传转化，是一种具有高效性创新的植物转基因技术。与传统方法相比较，纳米载体不仅能够对蛋白、DNA和RNA等多种生物分子进行有效保护，还可以方便、快捷、高效地把靶标分子导入植物愈伤、胚乳等不同组织，对单子叶植物和双子叶植物都能转导，并且能够进行多基因同时转化。
在众多的转基因纳米材料中，介孔硅纳米粒(mesoporous silicananoparticles，MSNs)因具有颗粒大小均匀、比表面积大、高装载量、易于修饰的内外表面、高稳定性以及良好的生物相容性等特点，正被逐渐用于植物转基因载体材料。2007年，Torney等利用MSNs装载绿色荧光蛋白(GFP)基因，用金纳米粒子进行封堵，利用基因枪将纳米复合物导入烟草叶片细胞，首次实现了MSNs介导基因在植物细胞的转化。此外，Martin-Ortigosa等利用MSNs装载Cre酶蛋白，在借助基因枪外力作用下，将靶基因导入玉米胚中，并且实现了目的基因的表达。MSNs表面进行聚乙烯亚胺修饰后用于装载GUS基因，然后与烟草悬浮细胞混合培养，并且通过超声波处理，目的基因被导入到烟草细胞中并得到了成功表达。不少研究也表明，外源生物分子在无机械无外力辅助下也可通过纳米材料透过细胞壁实现细胞内化。例如，Chang等将mCherry蛋白和GFP蛋白基因装载于MSNs，在不借助外力的情况下，纳米复合物穿透拟南芥根部而进入到植株细胞内。利用激光共聚焦显微镜检查发现，目的基因在根系的表皮层以及更深层次的皮质和内胚层根组织都实现了表达。
然而，MSNs具有较高的表面自由能，大量活性羟基导致其亲水性强，极易发生集聚现象，以至于在有机相中的MSNs分散不均，从而影响材料的结构与性能。另外，MSNs表面带有大量负电荷，不利于装载和吸附同样带负电荷的核酸分子。因此，有必要通过一定的技术手段对MSNs表面进行化学或物理修饰。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
本发明采用软模板法，以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，合成了两种直接分别为20nm和50nm介孔硅纳米粒(MSNs)。利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对MSNs表面进行修饰，对其进行形态、红外光谱和电位表征。通过凝胶阻滞实验测试两种氨基化的介孔硅纳米粒对靶标基因的装载性能和保护性能；作为递送绿色荧光蛋白(GFP)标记的质粒DNA的载体，对拟南芥原生质体进行细胞转导，在荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白基因的瞬时表达情况，综合评估两种不同MSNs作为基因载体的效率。以期为纳米基因载体在植物转基因中的研究与应用提供新的材料和理论依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种植物细胞转基因纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于超纯水中，调节pH，升温剧烈搅拌后，冷却；逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌反应，保温，得反应液；
(2)将所述反应液过滤，固体产物分散于含有氯化氢的酒精中，搅拌条件下水浴，之后离心，固体产物洗涤，干燥，得到介孔硅纳米粒；
(3)将所述介孔硅纳米粒分散在乙醇中，超声均匀后，剧烈搅拌，然后逐滴加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应，之后加超纯水，剧烈搅拌继续反应，离心，洗涤，干燥，得到氨基化硅纳米粒，即为植物细胞转基因纳米载体。
进一步地，在步骤(1)中，所述调节pH具体为采用氨水调节pH至10；所述升温剧烈搅拌具体为80℃剧烈搅拌30min；所述冷却为冷却至30℃。
进一步地，在步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24h；所述保温为80℃烘箱中保温24h。
进一步地，在步骤(2)中，所述过滤采用硝酸纤维素膜过滤，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.1μm；所述含有氯化氢的酒精的配制方法为将1mL氯化氢溶液加入到100mL酒精中，所述氯化氢溶液的质量浓度为32％。
进一步地，在步骤(2)中，所述水浴的温度为60℃；所述离心为9000rpm离心10min；所述干燥为真空干燥12h。
进一步地，在步骤(1)中，剧烈搅拌过程中，还加入1,3,5-三甲苯。
本发明还提供一种上述的植物细胞转基因纳米载体的制备方法制备得到的植物细胞转基因纳米载体。
本发明还提供一种上述的植物细胞转基因纳米载体作为植物基因载体的应用。
进一步地，所述植物细胞转基因纳米载体用于负载质粒DNA对原生质体进行细胞转导。
进一步地，所述原生质体为拟南芥原生质体。
为了使纳米颗粒具有生物活性，需要通过引入某些特殊官能团，使MSNs粒子表面的硅羟基和不饱和键与所需基团发生反应，接枝有机分子链段，减少其表面的硅羟基含量，增加其与聚合物之间的相容性，降低表面极性以提高其水溶性和分散性。本发明采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对MSNs进行表面修饰，枝接大量氨基基团，从而携带高密度的正电荷。作为载体的氨基修饰后的MSNs可以将带负电荷的DNA分子压缩、吸附和缠绕在载体的介孔缝隙内以及纳米颗粒表面，同时对靶标基因也起到有效地保护作用。通过电镜可以观察到纳米基因复合物呈环状的拓扑结构，说明纳米载体在与DNA复合过程中发生了结构上的压缩和变形。
纳米材料的制备方法决定了其与靶标基因的结合方式。一步法是在纳米基因载体制备过程中加入靶标DNA，使其以物理包裹的方式与纳米材料相结合。而两步法则是先合成纳米载体，然后通过共价键或者静电吸引使其与靶标核酸相结合。纳米材料对靶标基因的负载能力是衡量其作为介导载体性能的一个重要指标。本发明中凝胶阻滞实验结果表明，两种Am-MSNs显示出与质粒DNA很强的结合能力，Am-MSNs/pDNA复合物被凝胶阻滞，且20nm和50nm两种材料与pDNA最佳质量比分别是40:1和20:1。结果同时显示，50nm Am-MSNs对pDNA有更好的结合能力。这归结于大颗粒的MSNs具有更大的比表面积、更多的介孔空间和数量更多的正电荷，这些因素使得其吸附pDNA的能力更强。理论上，纳米材料颗粒和介孔越大，能够装载的生物分子越多。但纳米材料会影响细胞内的一些生物学过程，如细胞分裂、DNA复制和细胞内信号转导通路等。MSNs颗粒大小是决定其对植物细胞毒害性强弱的重要因素，直径小于20nm或大于2500nm的MSNs对细胞的伤害性更强。本发明中两种未经修饰的MSNs在超纯水中的Zeta电位为负，而氨基修饰后都带上了较强的正电荷，有利于DNA分子装载和吸附带负电荷的核酸分子。
在复杂的植物细胞胞内和胞外环境中，存在着大量的核酸酶，如果载体不能提供有效保护，DNA就会在进入细胞核表达之前被降解，导致基因转染效率的下降。因此，对于有效的基因输送来说，载体不仅需要具备高效的DNA负载能力，更要具备良好的DNA保护能力，确保DNA能够顺利到达细胞并进行目的基因的表达。以淀粉纳米颗粒为载体，结合DNA后，可以发挥纳米颗粒的表面效应、小尺寸效应，改变DNA的空间构型，阻碍酶与DNA链上的酶切位点靠近与结合，使DNA免受酶的消化降解。由于纳米颗粒的表面体积效应等作用，引起酶分子形状的变化，有可能使活性中心不能再与底物结合，从而抑制酶的反应。另外，氨基修饰的MSNs带的正电荷可以排斥酶促降解所需镁离子靠近DNA，减少降解的发生。本发明中凝胶电泳表明了两种Am-MSNs能有效的保护质粒DNA不被DNase I酶解，证明Am-MSNs可以成为基因传递的载体。
植物细胞通过噬菌、细胞胞饮或者内吞作用摄取纳米基因复合物，形成内体、溶酶体，然后由细胞质扩散到核膜。复合物通过核膜孔或在核定位信号的帮助下进入细胞核或在细胞分裂期，直接整合到细胞基因组。研究表明，转染效率受原生质体细胞浓度和活力、靶标核酸浓度高以及基因载体类型等因素影响。本发明实验表明，Am-MSNs可以携带DNA进入拟南芥原生质体中，并有绿色荧光蛋白的瞬时表达。大颗粒Am-MSNs-50的转化效率显著高于小颗粒Am-MSNs-20，这是因为同样质量的前提下，Am-MSNs-50具有更大的尺寸、介孔容量和正电荷量，因此能负载更多的DNA。作为PEG介导的遗传转化率达到62.3％，明显高于两种Am-MSNs介导的表达效率，GFP蛋白表达的荧光强度也数倍高于Am-MSNs。但是，在本发明实验中必须看到Am-MSNs介导的较高的转化率是在装载1μg pDNA与106/mL拟南芥原生质体浓度条件下获得的，是相同条件下PEG(20μg pDNA，104/mL拟南芥原生质体)介导的遗传转化率的2000倍，这个结果表明基于高遗传转化效率Am-MSNs的基因传递系统可以应用于植物细胞中。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用软模板法，加入扩孔剂合成了两种尺寸的MSNs。通过表面修饰后形成的Am-MSNs，带有较高的正电荷，可以通过静电吸附结合并保护DNA，对拟南芥原生质体没有毒性。利用Am-MSNs作为基因载体可以传送DNA进入拟南芥原生质体，出现GFP瞬时表达，其中大尺寸的Am-MSNs-50介导的转化效率高于小尺寸的Am-MSNs-20。本发明展示了不同尺寸的基于硅纳米粒的基因载体的遗传转化效率，这将为纳米基因载体在植物转基因中提高转化效率提供了新的研究基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为制备的两种尺寸的硅纳米粒和相应的氨基化硅纳米粒的TEM图；A:直径为20nm MSNs；B:氨基修饰的直径为20nm的MSNs；C:直径为50nm MSNs；D:氨基修饰的直径为50nm的MSNs；
图2为不同纳米材料的红外光谱图；A:直径为20nm MSNs；B:氨基修饰的直径为20nm的MSNs；C:直径为50nm MSNs；D:氨基修饰的直径为50nm的MSNs；
图3为不同纳米材料的zeta电位；
图4为两种Am-MSNs与DNA结合的凝胶阻滞实验结果；A：Am-MSN-20/pDNA；B：Am-MSN-50/pDNA；其中泳道1是纯pDNA(阳性对照)，泳道2为氨基化硅纳米粒(阴性对照)，泳道3-8分别代表Am-MSNs与pDNA的质量比为5:1，10:1，20:1，30:1，40:1和50:1时的DNA结合情况；
图5为氨基化硅纳米粒对pDNA的酶切保护；其中，泳道1，pDNA；泳道2，pDNA+DNaseI；泳道3，Am-MSN-20/pDNA；泳道4，Am-MSN-20/pDNA+DNase I；泳道5，Am-MSN-50/pDNA；泳道6，Am-MSN-50/pDNA+DNase I；
图6为氨基化硅纳米粒对拟南芥原生质体的细胞毒性评价；A:氨基修饰的直径为20nm的MSNs；B:氨基修饰的直径为50nm的MSNs；
图7为氨基化硅纳米粒介导的smGFP质粒在拟南芥原生质体中的瞬时表达；A:质粒DNA；B:氨基修饰的MSNs；C:质粒DNA与PEG混合；D:氨基修饰直径20nm MSNs与质粒DNA混合；E:氨基修饰直径20nm MSNs与质粒DNA混合；比例尺＝5μm；
图8为转化48h后smGFP在拟南芥原生质体中的基因表达评价；A：转化效率；B：相对荧光强度；图中误差线表示标准偏差；小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0种子和smGFP标记的大肠杆菌来自本实验室。质粒提取试剂盒购自Bioline公司；DNase I购自Thermo Fisher公司；纤维素酶和离析酶购自Yakult公司；正硅酸乙酯(98％)、十六烷基三甲基溴化铵(99％)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷和1,3,5-三甲苯购自Sigma-Aldrich公司；其它均为分析纯，购自北京索莱宝科技有限公司。JEM-2100透射电镜(日本电子株式会社)；UV1700型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；傅里叶变换红外光谱仪Vertex 70(德国Bruker公司)，zeta电位仪(英国Malven公司)，激光共聚焦显微镜TCS5SP5(德国Leica公司)，
Figure BDA0003319714580000071
IQ7003超纯水仪(德国Merck公司)，集热式恒温加热磁力搅拌器(杭州大力科教仪器有限公司)。
1.2方法
1.2.1介孔硅纳米粒的制备
制备采用软模板法。称取2.968g十六烷基三甲基溴化铵溶解于100mL Milli-Q水中(用氨水调节pH值到至10.0)，80℃剧烈搅拌30min后，冷却至30℃。逐滴加入1.86mL正硅酸乙酯，混合液继续搅拌反应24h，然后在密闭条件下，置于80℃烘箱中24h。接着用0.1μm孔径的硝酸纤维素膜过滤反应液，将所得的白色产物分散在含有1mL HCl(32％)的100mL酒精里，60℃水浴搅拌过夜。得到的白色物质于9000rpm离心10min，并用酒精洗涤三次，最终产品真空干燥24h，得到小尺寸的介孔硅纳米粒(MSN-20)。
大尺寸的介孔硅纳米粒的合成同上。不同之处为2.968g十六烷基三甲基溴化铵溶解于100mL Milli-Q水中(用氨水调节pH值到至10.0)，加热至80℃剧烈搅拌15min后，加入1,3,5-三甲苯8.91mL，继续剧烈搅拌15min，冷却至30℃，后续步骤相同。最后所得产物是大尺寸的介孔硅纳米粒(MSN-50)。
1.2.2氨基修饰的硅纳米粒(Am-MSNs)制备
将两种不同尺寸的介孔硅纳米粒100mg分别分散在100mL纯乙醇，超声均匀后，剧烈搅拌，然后分别逐滴加入5mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。反应1h后，加入5.0mL Milli-Q水，继续在室温下剧烈搅拌反应24h。最后将反应液离心，用乙醇洗涤3次，真空干燥，即得到两种不同尺寸的氨基化硅纳米粒(Am-MSN-20和Am-MSN-50)。
1.2.3材料表征
利用透射电子显微镜观察材料形态特征，采用傅里叶变换红外光谱仪对材料进行红外光谱测试，使用zeta电位仪测量样品电位。
1.2.4质粒DNA(pDNA)的扩增与纯化
将含有smGFP质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB固体培养基(含1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠5g，1.5％琼脂和50μg/mL氨苄青霉素)，于37℃下培养24h复活。挑取复活平板上的单菌落接种于新平板上重新，37℃下培养8h，然后用灭菌的枪头将新鲜的单菌落转移进LB液体培养基(同固体培养基，不加琼脂)，37℃下165rpm摇床中培养过夜。按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光度计鉴定质粒纯度、大小和浓度，选取OD260/OD280≈1.8的pDNA于-20℃保存备用。
1.2.5Am-MSNs与pDNA的结合和保护性试验
将1μg pDNA与两种尺寸的Am-MSNs按照不同质量比例进行混合，室温下振荡结合2h，形成的Am-MSNs/pDNA复合物进行琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。
Am-MSNs对pDNA的保护通过添加DNase I进行评价。将1μg pDNA分别与40μg的两种尺寸硅纳米粒混合于W5溶液(含0.1％葡萄糖，0.08％KCl，0.9％NaCl，1.84％CaCl2和2mMMES-KOH，pH7.5)，室温下放置2h。加入1U DNaseI,于37℃下对Am-MSNs/pDNA复合物进行酶解消化1h后，加入1μL乙二胺四乙酸停止反应。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测纳米载体对pDNA的保护情况，同时设置阳性和阴性对照。
1.2.6拟南芥原生质体的提取
从生长在MS培养基上14d的拟南芥幼苗叶片中提取原生质体。具体来说，将拟南芥幼苗叶片，切成1mm的长条，放入酶解液中[含0.5M蔗糖，10mM MES-KOH(pH 7.5)，20mMCaCl2，40mM KCL，2％纤维素酶和0.4％离析酶]，室温黑暗条件下过夜。然后将释放出的原生质体用Miracloth过滤入50mL离心管，100g离心2min，并用预冷的W5溶液洗涤2次。最后纯化的原生质体重新悬浮于W5溶液，置于冰上30min后备用。
1.2.7Am-MSNs对原生质体的毒性试验
提前将Am-MSNs置于超净工作台下进行紫外消毒，然后用W5溶液洗涤3次备用。将新鲜制备的原生质体与不同质量浓度(0，1，10，100mg/L)的氨基化的硅纳米粒混合置于6孔培养板中，每孔含有2mL W5溶液，在室温黑暗条件下振荡培养(35rpm)，每天每孔加入0.1mLW5溶液。原生质体活力用FDA染色法进行检测，每个处理重复3次，每个重复观察3个视野。
1.2.8Am-MSNs/pDNA的植物细胞转化
经预实验筛选，选取质量比为40:1的Am-MSN-20/pDNA和质量比为20:1的Am-MSN-50/pDNA复合物，其中pDNA用量为1μg。分别吸取100μL拟南芥原生质体(106个/mL)分别与复合物充分混匀，然后将混合液转移至预先用5％小牛血清处理过的12孔培养板中，室温下35rpm摇床上暗箱培养。同时以PEG介导的原生质体转化作为阳性对照，用20μg pDNA和100μL拟南芥原生质体(104个/mL)共培养。并将20μg pDNA加入100μL原生质体(106个/mL)培养作为阴性对照。培养一段时间后，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。每个处理重复3次，每个重复观察3个视野。
2结果
2.1硅纳米粒的形态表征
图1为制备的两种尺寸的硅纳米粒和相应的氨基化硅纳米粒的TEM图。从图中可以看出，小尺寸的MSN-20(图1A)和Am-MSN-20(图1B)呈现大小均匀，分散性高的类球形。其中MSN-20具有清晰的介孔结构，粒径约为20nm左右，并且氨基修饰后的纳米粒直径变化不大。本试验中，通过加入扩孔剂1,3,5-三甲苯，合成了MSN-50(图1C)和Am-MSN-50(图1D)呈现出单分散的花状结构，其尺寸和介孔都有显著增加，直径约为50nm。
2.2硅纳米粒的红外光谱分析
采用红外光谱分析比较硅纳米粒在氨基修饰前后表面基团的变化，从而确定官能团是否连接成功。从图2的红外光谱可以看出，所有材料呈现出了二氧化硅骨架的典型特征峰：Si-O-Si对称伸缩振动峰(υ＝801cm-1)、Si-O伸缩振动峰(υ＝965cm-1)和Si-O-Si不对称伸缩振动峰(υ＝1090cm-1)。氨基修饰后，两种硅纳米粒在1559cm-1处出C-N基团特征伸缩振动峰，证明氨基基团成功地接枝到材料表面，为后续装载DNA做好准备。
2.3硅纳米粒的Zeta电位
用3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰硅纳米粒后，将材料分别分散于双蒸水中，用Zeta电位仪测定其Zeta电位值。由图3可以看出，两种未修饰的硅纳米粒的表面均带负电荷，其中MSN-20的zeta电位较低(-16.0mV)。然而，氨基修饰的两种硅纳米粒的表面均带正电荷，这是因为氨基化的硅纳米粒的表面含有大量的氨基，氨基修饰前后硅纳米粒的zeta电位的变化也进一步表明氨基成功修饰到两种纳米粒上。其中大尺寸的Am-MSN-50的zeta电位较高(9.1mV)，表明Am-MSN-50表面比Am-MSN-20枝接了更多的氨基基团。
2.4Am-MSNs与pDNA的结合分析
从图4凝胶阻滞实验结果来看，阳性对照纯pDNA在电场的作用下迁移，因而在泳道上呈现明显的荧光条带，阴性对照的两种Am-MSNs的泳道中都没有荧光。而与Am-MSNs结合的DNA滞留在点样孔中，因此点样孔发出明显的荧光。不同质量比条件下，Am-MSN-20与DNA的结合程度不同。由图4A所示，当Am-MSN-20与pDNA质量比为5:1,10:1,20:1,30:1时，泳道中有DNA条带，点样孔中也有不同程度的荧光，表明Am-MSN-20未能有效结合pDNA，有不同程度多余的DNA在泳道中迁移。但当Am-MSN-20与pDNA质量比大于40:1时，纳米粒已与DNA完全结合，滞留在点样孔，泳道中没有任何条带。同样从图4B可以看出，当Am-MSN-50与pDNA质量比大于20:1时，DNA被纳米粒完全吸附，滞留在孔中，发出荧光。结果表明Am-MSN-20/pDNA和Am-MSN-50/pDNA最佳质量比分别是40:1和20:1。因为Am-MSN-50的zeta电位高于Am-MSN-20，所以相同质量的Am-MSN-50比Am-MSN-20可能负载更多的DNA。
2.5Am-MSNs对pDNA的酶切保护
由图5所示，作为对照的裸露pDNA在凝胶泳道中迁移(泳道1)，添加DNase I后，DNA分子被完全消化，泳道中没有任何条带(泳道2)。泳道3和5中的Am-MSNs/pDNA复合物滞留在点样孔中，用DNase I消化后，在凝胶的点样孔中仍可见明显的复合物滞留条带(泳道4和6)，说明pDNA与Am-MSNs结合后，纳米基因载体能保护其不受DNase I的降解。
2.6Am-MSNs对原生质体的细胞毒性实验
本实验应用FDA染色法检测不同浓度Am-MSNs对拟南芥原生质体的细胞毒性，以确定其应用于基因转导的可行性及剂量。从图6可以看出，与未处理的对照原生质体相比，不同浓度的两Am-MSNs对拟南芥原生质体均无显著的细胞毒性，即使是浓度高达100mg/L。另外，在不同的培养时间点，两种Am-MSNs没有显著降低原生质体的存活率。
2.8Am-MSNs/pDNA拟南芥原生质体的转化
选取质量比为40:1的Am-MSN-20/pDNA和质量比为20:1的Am-MSN-50/pDNA两种纳米粒转化拟南芥原生质体,培养36h后置于激光共聚焦显微镜下观察，两组纳米粒均可以成功的将含有smGFP的pDNA转入拟南芥原生质体瞬时表达(图7D和图7E)。阳性对照PEG也能介导pDNA进入原生质体，产生绿色荧光蛋白表达(图7C)，而阴性对照裸露pDNA(图7A)和Am-MSNs(图7B)处理的原生质体里均无绿色荧光蛋白的表达。培养48h后，Am-MSN-50/pDNA的转化效率较高，能达到13.1％，显著高于Am-MSN-20/pDNA的转化效率5.0％(图8A)。同时阳性对照PEG介导的转化效率62.3％(图8A)，分别是Am-MSN-50/pDNA和Am-MSN-20/pDNA转化效率的4.7倍和12.4倍。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种植物细胞转基因纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将十六烷基三甲基溴化铵溶于超纯水中，调节pH，升温剧烈搅拌后，冷却；逐滴加入正硅酸乙酯，搅拌反应，保温，得反应液；
(2)将所述反应液过滤，固体产物分散于含有氯化氢的酒精中，搅拌条件下水浴，之后离心，固体产物洗涤，干燥，得到介孔硅纳米粒；
(3)将所述介孔硅纳米粒分散在乙醇中，超声均匀后，剧烈搅拌，然后逐滴加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应，之后加超纯水，剧烈搅拌继续反应，离心，洗涤，干燥，得到氨基化硅纳米粒，即为植物细胞转基因纳米载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述调节pH具体为采用氨水调节pH至10；所述升温剧烈搅拌具体为80℃剧烈搅拌30min；所述冷却为冷却至30℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24h；所述保温为80℃烘箱中保温24h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述过滤采用硝酸纤维素膜过滤，所述硝酸纤维素膜的孔径为0.1μm；所述含有氯化氢的酒精的配制方法为将1mL氯化氢溶液加入到100mL酒精中，所述氯化氢溶液的质量浓度为32％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述水浴的温度为60℃；所述离心为9000rpm离心10min；所述干燥为真空干燥12h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，剧烈搅拌过程中，还加入1,3,5-三甲苯。
7.一种权利要求1-6任一项所述的植物细胞转基因纳米载体的制备方法制备得到的植物细胞转基因纳米载体。
8.一种权利要求7所述的植物细胞转基因纳米载体作为植物基因载体的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物细胞转基因纳米载体用于负载质粒DNA对原生质体进行细胞转导。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述原生质体为拟南芥原生质体。
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TORNEY，F.等: "Mesoporous silica nanoparticles deliver DNA and chemicals into plants", 《NAT NANOTECHNOL》 *
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