CN105758918B - 一种基于电还原氧化石墨烯和纳米金修饰电极的dna传感器的制备及应用方法 - Google Patents

一种基于电还原氧化石墨烯和纳米金修饰电极的dna传感器的制备及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用电化学方法制备纳米金和部分还原氧化石墨烯(p‑RGO)修饰的离子液体碳糊电极(CILE)，以此为平台构建了一种新的电化学DNA传感器，并将其成功应用于李斯特氏菌特征基因序列检测的方法。使用1‑己基吡啶六氟磷酸盐作为修饰剂制得基体电极CILE，在表面电沉积纳米金颗粒后通过控制电化学还原条件来制备p‑RGO，利用p‑RGO表面剩余的羧基，将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键共价键合法固定在电极表面构成ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE。与目标序列杂交后以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测杂交反应的进行，使用差分脉冲伏安法(DPV)对李斯特氏菌特征基因片段进行了检测。

Description

一种基于电还原氧化石墨烯和纳米金修饰电极的DNA传感器 的制备及应用方法
技术领域
本发明涉及一种新型纳米复合材料修饰电极的电化学DNA传感器的制备及应用的方法
背景技术
脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)是遗传信息的载体，具有传递和储存信息的功能。DNA存在于任何生物体、病毒、病原菌内，对于检测和诊断各种疾病有着重要的意义。由于DNA在医学诊断、环境监测、法医鉴定及食品卫生检验等方面具有重要的作用，因此如何快速准确的检测特定DNA序列具有重要的意义。电化学DNA传感器具有一系列的优点如检测快速、简单、灵敏，选择性高，操作简单，成本低等，在很多领域都有着广泛的应用前景。
电化学DNA传感器是以电极作为换能器，在一定的条件下将单链DNA探针(probessDNA)通过一定的方法固定在工作电极表面，在适宜的条件(如温度、酸度、离子强度等)下，利用DNA链之间的碱基互补配对原理作用，与溶液中的互补ssDNA序列进行杂交形成双链DNA(dsDNA)，然后利用电化学方法来检测杂交前后的电化学信号的变化，达到对特定目标基因序列的定性检测，同时利用电化学信号与目标ssDNA的浓度之间存在的线性关系，可以实现对特定DNA序列的定量检测。电化学ssDNA传感器制备的主要步骤如下：(1)将探针ssDNA固定在电极表面；(2)与目标ssDNA序列进行杂交；(3)杂交反应的指示；(4)杂交信号的电化学检测。其中最为关键的是探针ssDNA的固定和杂交反应的电化学检测，探针ssDNA在电极表面的固定量和杂交反应的检测方法会影响电化学传感器的灵敏度。
碳糊电极是利用导电性的石墨粉与憎水性的粘合剂混制成糊状物，然后填充在电极管中而制成的一类碳电极。它具有制备简单、价格便宜、选择性好、灵敏度高、电位适用范围宽及表面易于更新等优点，室温离子液体是指在室温及邻近温度下完全由阴阳离子组成的液体物质，它具有电化学窗口宽、导电率高、热稳定性和化学稳定性好等优点。离子液体可以作为粘合剂与石墨粉混合制备离子液体修饰碳糊电极(CILE)，离子液体的存在能够有效地改变电极的性能，既可以增加碳糊电极的稳定性，又可以增加导电效率。
金纳米粒子由于具有生物相容性好、合成简单、导电性好及稳定性好等优点被广泛应用于电化学DNA传感器。修饰在电极表面的纳米金可以提高电极的有效面积、加快电化学催化过程中的电子传递以及提高电化学DNA传感器中探针ssDNA的固定量。
石墨烯(graphene，GR)是以sp2杂化连接的单层二维纳米晶体，具有电化学窗口宽、稳定性高、比表面积大、电催化活性高、导电性优良等特点，已被广泛应用于电化学传感器领域，其大的比表面还能够负载更多的生物分子。石墨烯的制备方法主要有物理方法，机械剥离法，化学气相沉积法，热膨胀剥离法，电化学法，氧化还原法等，其中电化学还原氧化石墨烯法具有简单、高效、可控、低成本和无污染等优点。
部分电化学还原氧化石墨烯(partial reduction graphene oxide，p-RGO)是通过控制电化学还原条件来还原氧化石墨烯(GO)表面的含氧基团，能够在一定程度上恢复GR的sp2杂化结构，增大GO的导电性，同时利用部分还原GO后表面剩余的含氧基团可作进一步修饰或应用。
电化学沉积法是在含有要沉积的离子的溶液中，通过改变电化学条件，如改变电位或者沉积时间将要沉积离子均匀的沉积在阴极或者阳极模板上。电化学沉积法有以下优点如：通常情况，常温下就可以发生反应，反应温度低；通过监控转移的电荷数可以控制沉积薄膜的厚度；其组成和缺陷可以控制；可以在各种复杂形状的基底上沉积薄膜；可以进行非平衡相的沉积；驱动力可以进行精确的控制；耗费小等优点。电化学沉积法根据沉积电压和电流方式的不同，可以分为恒流电沉积法，恒压电沉积法，脉冲电沉积法，循环伏安法等；根据不同的复合手段又可以分为喷射电沉积，复合电沉积，模板法电沉积等。
本实验首先制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE)，再对电极表面进行抛光处理，通过电化学沉 积的方法在CILE表面先沉积金纳米颗粒，然后采用控制电化学还原法在其表面修饰p-RGO膜，利用p-RGO表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，制备出一种电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合材料修饰电极的电化学DNA传感器，进一步以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测其与目标序列的杂交反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA快速准确的电化学检测方法，具体方法是将金纳米颗粒通过电化学沉积的方法沉积在离子液体修饰碳糊电极表面，然后采用控制电化学还原法在其表面修饰p-RGO膜，利用电极表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，制备一种新型的电化学DNA传感器，以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测与目标序列的杂交反应。
一种制备DNA传感器的方法，以离子液体修饰碳糊电极为基底层，利用恒电位沉积法在基底层上沉积出金纳米颗粒层，再用电化学还原法在金纳米颗粒层表面修饰p-RGO膜，利用电极表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，其具体的制备步骤如下：
(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)按2：1的质量比例混合放入玛瑙研钵中，研磨混合均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将上述修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，即可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)，使用前在洁净的抛光纸上打磨成镜面。
(2)将氯金酸(HAuCl4)和硝酸钠(NaNO3)以一定比例混合后为电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗得到AuNPs/CILE，真空干燥备用。
(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，取出用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p-RGO/AuNPs/CILE。
(4)将p-RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS溶液中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针序列的电极(ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE)。
(5)将含有目标序列的PBS缓冲溶液直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极为dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE。
步骤1中所陈述的石墨粉与正己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)离子液体的质量分别为(0.8g)和(1.6g)；步骤1中所陈述的优选研磨时间为1.5h～3h，优选时间为2h；步骤1中所陈述的玻璃管内径为3mm～5mm，优选玻璃管内径为4mm，玻璃管的两端用砂纸(80#～1200#)打磨光滑。
步骤2与步骤3中所陈述的蒸馏水均为二次蒸馏水；步骤2中所陈述的混合溶液中氯金酸(HAuCl4)的浓度为3.0mmol/L，硝酸钠(NaNO3)的浓度为0.1mol/L，混合溶液超声时间为0.5h～1h；步骤2中所陈述的沉积电位为-0.2V(vs.SCE)，沉积时间为30s。
步骤3中所陈述的GO分散液的浓度为1.0mg/mL，滴涂量为10.0μL；步骤3中所陈述的恒电位还原的PBS(pH＝8.0)缓冲液浓度为0.2mol/L，还原电位为-1.3V，时间为150s。
步骤4中所陈述的PBS溶液含EDC浓度为5.0mmol/L和NHS浓度为8.0mmol/L，沉浸时间为30min；步骤4中所陈述的在电极表面滴涂的含有1.0×10-6mol/L氨基修饰的探针序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)的滴涂量为10.0μL。
步骤5中所陈述的含有目标序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)的滴涂量为10.0μL。
步骤5中所陈述的21碱基探针序列和目标序列如下：
探针序列：5'-NH2-TGG CGG CAC ATT TGT CAC TGCA-3'；
目标序列：5'-TGCAGT GACAAATGT GCC GCCA-3'；
本发明的有益效果是：本发明提供一种特定序列DNA快速准确的电化学检测新方法。离子液体修饰碳糊电极具有制备简单，价格便宜，选择性好，电位窗口宽，表面易于更新，使用方便，导电性能良 好等优点。在离子液体修饰碳糊电极表面利用电化学的方法可以方便快捷的沉积金纳米颗粒材料，然后采用控制电化学还原法在其表面修饰p-RGO膜，然后利用共价键合法固定探针ssDNA序列得到一种新型电化学DNA传感器可以快速测试DNA。本发明选用在金纳米颗粒表面部分电化学还原氧化石墨烯，充分利用金纳米颗粒比表面积大，导电性能好的优点，以及部分还原氧化石墨烯即能够在一定程度上恢复GR的sp2杂化结构，保持GR良好的导电性，又能利用部分还原GO后表面剩余的含氧基团可作进一步修饰或应用的优点，制备一种新型的电化学DNA传感器，实验结果表明p-RGO/AuNPs复合材料是一种理想的用于DNA传感器的电极材料。
附图说明
图1不同的还原时间后p-RGO/AuNPs/CILE在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/LKCl溶液中的循环伏安图，从a到d还原时间分别为0s，50s，150s，250s。
图2(A)不同电极在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl溶液中的循环伏安图，扫描速率100mV/s；(B)不同电极在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/L KCl溶液中的电化学交流阻抗图，频率为104～0.1Hz(a：GO/AuNPs/CILE，b：CILE，c：AuNPS/CILE，d：dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE，e：p-RGO/CILE，f：ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE，g：p-RGO/AuNPs/CILE)。
图3MB在不同修饰电极上的示差脉冲伏安图(a：ssDNA/GO/CILE，b：ssDNA/GO/AuNPs/CILE，c：dsDNA/GO/AuNPs/CILE，d：ssDNA/p-RGO/CILE，e：ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE，f：dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE)。
图4MB在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE与不同序列杂交后电极上的示差脉冲伏安图(a：杂交前，b：与非互补序列杂交后，c：与三碱基错配序列杂交后，d：与单碱基错配序列杂交后，e：与目标序列杂交后)。
图5ssDNA/p-RGO/CILE与不同浓度的目标序列杂交后MB的差分脉冲伏安图
(a到i的目标序列浓度依次为0，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7和1.0×10-6mol/L)插图：浓度的对数与峰电流的线性关系曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1DNA传感器的制备方法
(1)用电子天平准确称取1.6g石墨粉和0.8gHPPF6，将称量好的石墨粉和HPPF6放入玛瑙研钵中研磨均匀，得到离子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊慢慢填入长为6cm，内径为4mm的玻璃管中压实，内插一根细铜线作为导线，得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)，使用前在洁净的抛光纸上打磨成镜面。
(2)用电子天平准确称取一定质量的HAuCl4与NaNO3，溶于50ml二次蒸馏水中，超声分散均匀，即得3.0mmol/L HAuCl4和0.1mol/L NaNO3混合溶液。以CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积的方法在CILE电极表面得到金纳米颗粒，沉积电位为-0.2V(vs.SCE)，沉积时间为30s，可以在CILE表面沉积一层均匀的金纳米颗粒(AuNPs)，取出后用蒸馏水清洗得到AuNPs/CILE，真空干燥备用。
(3)用电子天平准确称取10mg GO溶解于10ml二次蒸馏水中，超声分散均匀，即得1.0mg/mL GO分散液，电极上滴涂10.0μL 1.0mg/mL GO分散液，自然晾干后得到GO修饰的AuNPs/CILE。通过恒电位法控制还原时间部分还原氧化石墨烯，得到p-RGO/AuNPs/CILE。
(4)将p-RGO/AuNPs/CILE浸入含5.0mmol/L EDC和8.0mmol/L NHS的PBS溶液中30min，以活化修饰电极表面p-RGO上的羧基，然后在电极表面均匀滴涂10.0μL含有1.0×10-6mol/L氨基修饰的探针序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)，羧基可以和氨基发生共价键合反应生成酰胺键，形成一层稳定的探针ssDNA修饰层。自然晾干后分别使用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针序列的电极(ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE)。
对实施例1进行实验条件优化。将0.2mol/L的PBS(pH＝8.0)缓冲溶液通入氮气，通氮速率为20ml/min～50ml/min，通氮时间为30min～40min，以GO/AuNPs/CILE为工作电极，铂片为辅助电极， 饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位还原氧化石墨粉的方法在GO/AuNPs/CILE电极表面得到部分还原氧化石墨烯(p-RGO)，还原电位为-1.3V(vs.SCE)，沉积时间为50s，100s，150s，200s，250s，将不同的还原时间后的修饰电极在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl溶液中进行电化学表征，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，工作电极分别为p-RGO/AuNPs/CILE，从图1可知，电化学还原时间为150s时，得到的p-RGO效果最佳。
实施例2DNA传感器的电化学表征
采用循环伏安法和交流阻抗法对不同修饰电极表面进行表征，结果如图2所示。将10.0μL含有目标序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极记为dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE。
循环伏安法测试结果见图2A，电解液为1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl的混合溶液，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别以不同修饰电极(GO/AuNPs/CILE，CILE，AuNPs/CILE，dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE，p-RGO/CILE，ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE和p-RGO/AuNPs/CILE)为工作电极，电位窗口-0.3～0.7V，扫描速度为0.1V/s。
交流阻抗测试结果见图2B，电解液为10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/L KCl的混合溶液，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，工作电极分别为(GO/AuNPs/CILE，CILE，AuNPs/CILE，dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE，p-RGO/CILE，ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE和p-RGO/AuNPs/CILE)，频率范围为0.1～104Hz。在CILE；AuNPS/CILE；GO/AuNPs/CILE；p-RGO/AuNPs/CILE；ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE和dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE上电极电荷转移电阻分别为87.05Ω；57.397Ω；109.740Ω；0Ω；20.65Ω和35.017Ω。
实施例3MB在不同修饰电极上电化学行为的检测
对不同修饰电极进行示差脉冲伏安法测试，结果如图3所示。按照实例1制备不同修饰电极，然后在2.0×10-5mol/L浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡8min，取出后依次用0.5％的SDS溶液和二次水充分洗涤，用示差脉冲伏安法检测传感器的电流。电解液为50.0mmol/LTris-HCl缓冲溶液，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别以不同修饰电极(ssDNA/GO/CILE；ssDNA/GO/AuNPs/CILE；dsDNA/GO/AuNPs/CILE；ssDNA/p-RGO/CILE；ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE和dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE)为工作电极，电位窗口为-0.7～0.2V。从图3可知，MB在dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE和ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE上电流的区别很大，结果说明MB能够有效的区分电极表面的单双链DNA。同时随着纳米材料的逐层加入，电化学信号也有很大区别，说明纳米材料在电极界面的存在发挥着重大作用。
实施例4传感器选择性的检测
在制备好的传感器上，将10.0μL分别含有非互补序列(5'-CAT GTACGT TGCGCCAAG TAGT-3')；三碱基错配序列(5'-TGTAGT GACAGATGT GCC GCAA-3')；单碱基错配序列(5'-TGCAGT GAC AGATGT GCC GCCA-3')和目标序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，然后在2.0×10-5mol/L浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡8min，取出后依次用0.5％的SDS溶液和二次水充分洗涤，用示差脉冲伏安法检测传感器的电流，结果见图4。电解液为50.0mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别以不同修饰电极(a杂交前；b与非互补序列杂交后；c与三碱基错配序列杂交后；d与单碱基错配序列杂交后；e与目标序列杂交后)为工作电极，电位窗口为-0.7～0.2V。从图4可知，构建的DNA传感器对不同的序列具有良好的选择性，能够区分不同碱基的错配序列。
实施例5传感器灵敏度的检测
在制备好的传感器上，将10.0μL含有不同浓度目标序列的PBS缓冲溶液(50.0mmol/L，pH＝7.0)直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，然后在2.0×10-5mol/L浓度的亚甲基蓝溶液中浸泡8min，取出后依次用0.5％的SDS溶液和二次水充分洗涤，用示差脉冲伏安法检测传感器的电流，结果见图5。电解液为50.0mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，分别以滴加不同浓度目标序列(a到i的目标序列浓度依次为0，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7和1.0×10-6mol/L) 的修饰电极为工作电极，电位窗口为-0.7～0.2V。从图5可知，MB的还原峰电流值随着目标序列浓度的增加而增大，且在1.0×10-13～1.0×10-6mol/L的浓度范围内与目标序列浓度的对数值呈良好的线性关系，其线性回归方程为ΔI(μA)＝3.61log[c/(mol/L)]+50.91(n＝8，γ＝0.997)(其中c是目标序列的浓度，mol/L；ΔI是杂交前后MB的峰电流差值，μA)，检测限为3.33×10-14mol/L(3σ，σ为空白溶液的标准偏差)。

Claims (1)

1.一种基于电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合修饰电极的电化学DNA传感器测试李斯特氏菌特征基因片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐以2：1的质量比混合研磨均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)；
(2)将氯金酸和硝酸钠以一定比例混合制备电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥备用；
(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，一定时间后取出电极用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p-RGO/AuNPs/CILE；
(4)将p-RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用0.5％的十二烷基磺酸钠溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针序列的电极ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE；
(5)将含有目标序列的PBS直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极记为dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE；
(6)将杂交后的电极浸入亚甲基蓝(MB)溶液中吸附一定时间，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法测定MB在Tris-HCl缓冲溶液中的电化学行为，循环伏安在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl混合溶液中进行，扫速100mV/s；电化学交流阻抗在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/L KCl混合溶液中进行，频率范围104～0.1Hz；
步骤(1)中所述研磨的时间为1.5h～3h；所述玻璃电极管的内径为3mm～5mm，两端用砂纸80#～1200#打磨光滑；
步骤(2)中所述的混合制备电解液中氯金酸的浓度为3.0mmol/L，硝酸钠的浓度为0.1mol/L；所述恒电位沉积法的沉积电位为-0.2V(vs.SCE)，沉积时间为30s；
步骤(3)中所述的氧化石墨烯分散液的浓度为1.0mg/mL，滴涂量为10.0μL，PBS浓度为0.2mol/L，pH为8.0，恒电位还原的电位为-1.3V，时间为150s；
步骤(4)中所述的PBS溶液含EDC浓度为5.0mmol/L和NHS浓度为8.0mmol/L，浸入时间为30min，在电极表面滴涂的含有1.0×10-6mol/L氨基修饰的探针ssDNA序列的PBS缓冲溶液，pH为7.0，滴涂量为10.0μL；所述探针序列为：5'-NH2-TGG CGG CAC ATT TGT CAC TGCA-3'；
步骤(5)中所述的含有目标ssDNA序列的PBS的浓度为50.0mmol/L，pH为7.0，滴涂量为10.0μL；所述目标序列为：5'-TGCAGT GACAAATGT GCC GCCA-3'；
步骤(6)中所述MB溶液的浓度为2.0×10-5mol/L，吸附时间为8min，含有MB的Tris-HCl缓冲溶液的pH为7.0，浓度为50.0mmol/L，示差脉冲伏安法测定仪器条件为电位增量0.008V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。
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