CN104458659A

CN104458659A - 一种表面等离子共振传感器及其制备与应用

Info

Publication number: CN104458659A
Application number: CN201410762442.XA
Authority: CN
Inventors: 丁世家; 丁小娟; 颜玉蓉; 程伟; 袁泰先; 李胜强; 张晔; 李丹丹
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: International Institute Of In Vitro Diagnostics Chongqing Medical University
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN104458659B

Abstract

本发明提供了一种检测miRNA-21的表面等离子共振传感器，包括工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片上固定针对miRNA-21的捕获探针所得。应用本发明的传感器对miRNA-21进行检测，校准曲线做四参数拟合，回归方程为Y = (A₁- A₂)/(1 + (X/X₀)^P) + A₂，A₁=-69.95 ± 7.34，A₂= 2890.50 ± 18.50，X₀= 5.27 ± 0.16，P = 0.47 ± 0.01，检测范围为0.01-1000 nM，相关系数为0.9978，最低检测限为0.009 nM。与现有技术比较，所述传感器无酶、免标记，能实时监测，并且灵敏度高、特异性好、成本低、操作简便，检测周期短，适用于实际样品的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器。

Description

一种表面等离子共振传感器及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种用于检测MiRNA-21的表面等离子共振传感器及其制备与应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类近年来发现的、高度保守的短链非编码小分子(18～25nt)单链RNA，研究发现其在细胞生长和发育过程中起多种调控作用，已成为肿瘤生物学研究的热点领域。miRNA在血浆和血清中非常稳定，能抵抗RNA裂解酶(RNases)的降解，在严酷环境下，其含量仍能保持相对稳定。因此，miRNA具有作为理想的生物标志物所需的一些特性，为其作为生物标志物用于临床诊断提供了可能。

传统的miRNA检测方法主要有Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等，但各种方法互有优劣，目前尚缺乏简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。Northern印迹是最早用于各种miRNA分析的技术，被认为是miRNA研究分析的金标准，该方法由于检测步骤复杂、耗时长、通量低、灵敏度低且需对大量的样品进行检测，不适于对日常miRNA进行分析。微阵列技术具有高通量检测能力并能对多种miRNAs进行分析，然而序列短及同源miRNA具有交叉杂交的可能性，导致该方法的灵敏度及特异性均降低，因而只适于一般的筛查分析，而不适于精确定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特异性和灵敏度而被广泛用于miRNAs的检测，但操作过程需要逆转录步骤和温度循环，且需设计引物及昂贵仪器，从而限制了该方法的使用。因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，发展快速、简便、高灵敏、高特异的可用于细胞、血液、体液及组织中miRNA检测的分析方法是当今生物传感研究领域一项亟待解决的课题，也是近年来研究热点之一。

表面等离子共振(SPR)生物传感器为近年来发展起来的光学传感技术，其原理为在传感芯片表面，当待测分子与配体结合时，会引起芯片表面介质的折射率发生改变，其变化与结合分子的量有关，SPR通过监测折射率的变化而达到检测某待测物质含量的目的。SPR生物传感器具备实时、快速、免标记、重现性好、灵敏度高、样品无需纯化等优点，是一种强有力的生物分子分析工具，已应用于蛋白质、核酸，以及小分子的检测分析。因此应用SPR传感器检测样品中miRNA具有非常重要的意义。但针对生物样品中miRNA的SPR传感器研究与应用尚不成熟。

为了弥补现有miRNA检测技术的不足，旨在建立一种新型表面等离子共振传感器用于miRNA的快速、灵敏检测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种检测miRNA-21的表面等离子共振传感器，包括用于检测miRNA-21工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针所得。

优选地，所述捕获探针为茎环结构，包含一段与miRNA-21完全互补的碱基序列，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.1～3所示，具体为：

CP1:5'-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.1)；

CP2:5'-TTTTTTTTTTGGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.2)；

CP3:5'-TTTTTTTTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCTCAGACTG-3’(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述捕获探针通过巯基共价链接固定在裸金芯片表面。

更优选地，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，其具体结构和序列为：

CP1:5'SH-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA AACATGATGACGGCC-3'；

CP2:5'SH-TTTTTTTTTTGGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'；

CP3:5'SH-TTTTTTTTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCTCAGACTG-3’。

优选地，每个所述工作芯片上，含有所述捕获探针的摩尔量为3.5×10^-2～14×10^-2nmol，更优选为7×10^-2nmol。

本发明的第二方面提供了前述表面等离子共振传感器中的工作芯片的制备方法，所述方法为先在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针，而后进行封闭芯片所得。

优选地，所述工作芯片按照以下步骤制备：

(1)裸金芯片表面处理：将裸金芯片表面进行处理，使其表面光洁；

(2)固定针对miRNA-21的捕获探针：将捕获探针溶于探针固定溶液配置捕获探针溶液，然后将捕获探针溶液流过处理干净的裸金芯片表面；

(3)封闭芯片：封闭非特异性吸附位点，即得工作芯片。

优选地，步骤(1)中，可采用食人鱼溶液对裸金芯片进行处理。

优选地，步骤(2)中，所述捕获探针溶液中捕获探针的浓度为500nM～2000nM，更优选为1000nM。

优选地，步骤(2)中，所述探针固定溶液选用KH₂PO₄溶液。更优选地，所述探针固定溶液是浓度为1M的KH₂PO₄溶液，PH为3.8。

优选地，步骤(3)中，采用6-巯基丙酸(MCH)封闭非特异性吸附位点。

本发明第三方面提供了一种用于检测miRNA-21的检测系统，包括本发明第一方面所述的表面等离子共振传感器。

进一步的，所述检测系统还包括辅助DNA探针1、辅助DNA探针和链霉亲和素。所述辅助DNA探针1与辅助DNA探针2能够能通过碱基互补杂交延伸形成DNA串联体，所述辅助DNA探针1的一端能与所述捕获探针的末端互补结合。若样本中不存在miRNA-21时，捕获探针保持稳定的茎环结构，DNA串联体不能通过碱基互补配对与捕获探针结合。当样本中存在miRNA-21时，捕获探针的折叠茎环结构会被打开，DNA串联体能通过碱基互补配对与捕获探针的末端结合，形成第一次信号放大。随后加入的链霉亲和素能够与辅助DNA探针1末端的生物素牢固结合，形成第二次信号放大。

优选地，所述辅助DNA探针1的序列如SEQ ID NO.4～6所示，具体为：

AP1-1:5'-TTTTGCACCTGGGGGAGGCCGTCATCAT-3'(SEQ ID NO.4)

AP1-2:5'-TAATGCACCTGGGGGAGGCCGTATCA-3'(SEQ ID NO.5)

AP1-3:5'-GCACCTCCCCCAGTAAAAAAAAGTGGCCGTCATCAT-3'(SEQ ID NO.6)

更优选地，所述辅助DNA探针1的5'端为Biotin修饰，其具体结构和序列为：

AP1-1:5'-BiotinTTTTGCACCTGGGGGAGGCCGTCATCAT-3'；

AP1-2:5'-BiotinTAATGCACCTGGGGGAGGCCGTATCA-3'；

AP1-3:5'-Biotin GCACCTCCCCCAGTAAAAAAAAGTGGCCGTCATCAT-3'。

优选地，所述辅助DNA探针2的序列如SEQ ID NO.7～9所示，具体为：

AP2-1:5'-TCCCCCAGGTGCATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.7)；

AP2-2:5’-CCCCCAGGTGCTGATACGGCCT-3'(SEQ ID NO.8)；

AP2-3:5'-TACTGGGGGAGGTGCAAAAAAATGATGACGGCCACT-3'(SEQ ID NO.9)。

优选地，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针2的摩尔比为3:1～1:3；更优为1:1。

优选地，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针2的摩尔浓度分别为250nM～2000nM，更优选为1000nM。

优选地，所述辅助探针1和辅助探针2可用于第一步放大反应体系，所述第一步放大反应体系中缓冲溶液可以采用常规的杂交液。更优选地，所述杂交液的组成和成分为450mMNaCl、30mM Na₃PO₄.12H₂O、3mM EDTA-2Na、0.25％Triton×100，PH 7.4。

进一步地，所述链霉亲和素的摩尔浓度为100nM～300nM，更优选为200nM。

优选地，链霉亲和素可用于第二步放大反应体系。

本发明第四方面提供了一种检测miRNA-21的方法，为采用前述的表面等离子共振传感器或检测系统对样品中的miRNA-21进行检测，所述方法具体包括以下步骤：

(a)加样品溶液至前述表面等离子共振传感器中，进行杂交反应；

(b)进样前述第一步放大反应体系(亦即，辅助DNA探针1和2混合溶液)至前述表面等离子共振传感器中，进行杂交反应；

(c)进样前述第二步放大反应体系(亦即，链霉亲和素溶液)至前述表面等离子共振传感器中；

(d)得到SPR响应传感图，根据校准曲线计算样品中miRNA-21的浓度。

优选地，步骤(a)中，所述表面等离子共振传感器，包括用于检测miRNA-21工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针所得。

CP1:5'-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.1)；

CP2:5'-TTTTTTTTTTGGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.2)；

CP3:5'-TTTTTTTTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCTCAGACTG-3’(SEQ ID NO.3)。

CP1:5'SH-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA AACATGATGACGGCC-3'；

CP2:5'SH-TTTTTTTTTTGGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'；

CP3:5'SH-TTTTTTTTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACTCTCAGACTG-3’。

优选地，步骤(a)中，杂交反应的温度为常温25℃；流速为2～7μL.min^-1，更优选为5μL.min^-1；进样体积为40～70μL，更优选为40μL。

优选地，步骤(b)中，优选地，所述辅助DNA探针1的序列如SEQ ID NO.4～6所示，具体为：

AP1-1:5'-TTTTGCACCTGGGGGAGGCCGTCATCAT-3'(SEQ ID NO.4)

AP1-2:5'-TAATGCACCTGGGGGAGGCCGTATCA-3'(SEQ ID NO.5)

AP1-3:5'-GCACCTCCCCCAGTAAAAAAAAGTGGCCGTCATCAT-3'(SEQ ID NO.6)

AP1-1:5'-BiotinTTTTGCACCTGGGGGAGGCCGTCATCAT-3'；

AP1-2:5'-BiotinTAATGCACCTGGGGGAGGCCGTATCA-3'；

AP1-3:5'-Biotin GCACCTCCCCCAGTAAAAAAAAGTGGCCGTCATCAT-3'。

AP2-1:5'-TCCCCCAGGTGCATGATGACGGCC-3'(SEQ ID NO.7)；

AP2-2:5’-CCCCCAGGTGCTGATACGGCCT-3'(SEQ ID NO.8)；

AP2-3:5'-TACTGGGGGAGGTGCAAAAAAATGATGACGGCCACT-3'(SEQ ID NO.9)。

优选地，步骤(b)中，杂交反应的温度为常温25℃，流速为2～7μL.min^-1，更优选为5μL.min^-1；进样体积为40～70μL，更优选为40μL。

优选地，步骤(c)中，链霉亲和素的摩尔浓度为100nM～300nM，更优选为200nM。

优选地，链霉亲和素可用于第二步放大反应体系。

优选地，步骤(c)中，反应的温度为常温25℃，流速为2～7μL.min^-1，更优选为5μL.min^-1，进样体积为40～70μL，更优选为40μL。

本发明第五方面提供了前述表面等离子共振传感器或检测体系在检测miRNA-21中的用途。

本发明的有益效果为：

(1)本发明研制了一种基于DNA串联体和链霉亲和素双重信号放大的表面等离子共振传感器，可以用于灵敏地检测miRNA-21。首先设计巯基标记的茎环结构的捕获探针，该探针含有一段能与miRNA-21完全互补的序列。再设计能通过碱基互补杂交延伸的的辅助DNA探针1(生物素标记)和2，辅助DNA探针1一端能与捕获探针的末端互补结合。若样本中不存在miRNA-21时，捕获探针保持稳定的茎环结构，DNA串联体不能通过碱基互补配对与捕获探针结合。当样本中存在miRNA-21时，捕获探针的折叠茎环结构会被打开，DNA串联体能通过碱基互补配对与捕获探针的末端结合，形成第一次信号放大，随后加入的链霉亲和素与辅助DNA探针1末端的生物素牢固结合，形成第二次信号放大。所述表面等离子共振传感器对miRNA-21进行检测，校准曲线做四参数拟合，回归方程为Y＝(A₁-A₂)/(1+(X/X₀)^P)+A₂,A₁＝-69.95±7.34,A₂＝2890.50±18.50,X₀＝5.27±0.16,P＝0.47±0.01,检测范围为0.01-1000nM，相关系数为0.9978，最低检测限为0.009nM。

(2)与此同时，信号放大是影响检测灵敏度的另一个重要因素。本发明采用了基于DNA串联体和链霉亲和素双重放大策略，极大地实现了信号放大，可对miRNA-21浓度进行准确的定量。

(3)综上所述，本发明成功构建了可用于检测miRNA-21的表面等离子共振传感器及检测体系。应用本发明的传感器，对miRNA-21的测定显示了灵敏度高、稳定、重现性好的能力。与现有技术比较，本发明的传感器无酶、免标记、可实时监测，并且成本低，操作简单方便，检测周期短，灵敏度高，特异性好，假阳性率和假阴性率低。适用于实际样品的测定等，有望成为具有实际应用价值的传感器。

附图说明

图1为本发明的在裸金芯片上固定巯基标记的捕获探针的SPR传感图。

图2为本发明的典型SPR流程传感图，分别为进样样本(T-miRNA)、DNA串联体(DNAConcatamers)、链霉亲和素(Streptavidin)和再生液(NaOH)。

图3为DNA串联体放大、DNA串联体和链霉亲和素放大、仅利用辅助DNA探针1放大的SPR传感信号对比图。

图4为考察不同捕获探针对表面等离子共振传感器的影响，所得传感信号图。

图5为三对辅助探针：AP1-1和AP2-1，AP1-2和AP2-2，AP1-3和AP2-3，，所得传感信号图。

图6为辅助DNA探针1和2能够形成DNA串联体的电泳验证图。

图7为不同浓度比例的辅助DNA探针1和2对使用所构建的表面等离子共振传感器响应信号结果。

图8为不同浓度的辅助DNA探针1和2对所构建的表面等离子共振检测传感器响应信号结果。

图9为不同浓度的亲和素对所构建的所构建的表面等离子共振检测传感器响应信号结果。

图10为未信号放大的八个不同浓度(1000nM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM)miRNA-21标准品溶液所得SPR响应信号图和四参数拟合校准S曲线。

图11为本发明的检测十个不同浓度(1000nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM)miRNA-21标准品溶液所得SPR响应信号图和四参数拟合校准S曲线。

图12为本发明制备的表面等离子共振检测传感器的特异性分析实验结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1构建用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器

1.材料与方法

1.1材料

miRNA-21购自大连Takara公司、辅助DNA探针1和辅助DNA探针2由上海生工生物工程有限公司合成、链霉亲和素购自美国Sigma-Aldrich公司，KH₂PO₄、NaCl、Na₃PO₄.12H₂O、EDTA-2Na等其他试剂均购自重庆茂业化学试剂有限公司，杂交液的组成和成分为：450mM NaCl、30mM Na₃PO₄.12H₂O、3mM EDTA-2Na、0.25％Triton×100，PH7.4。

1.2检测仪器

Biocore X型表面等离子共振仪为瑞典Biocore AB公司产品。

1.3检测原理

工作芯片为裸金芯片，通过金-硫键在裸金芯片上牢固固定巯基标记的捕获探针，再用MCH封闭非特异性吸附位点。捕获探针含有一段序列能与miRNA-21完全互补，若样本中不存在miRNA-21时，捕获探针保持稳定的茎环结构，当样本中存在miRNA-21时，捕获探针的折叠茎环结构会被打开。辅助DNA探针1(生物素标记)和2相互杂交延伸可长达数微米的DNA串联体，当捕获探针的折叠茎环结构被打开时，辅助DNA探针1一端能与捕获探针末端互补结合，因而DNA串联体形成第一次信号放大。链霉亲和素与辅助DNA探针1上的生物素结合形成第二次信号放大。根据标准miRNA-21反应产生的SPR响应信号绘制校准曲线和得到实测样品miRNA-21水平。

2.工作芯片的制备

(1)裸金芯片表面处理：用食人鱼溶液(H₂SO₄:H₂O₂7:3)处理裸金芯片表面，使其表面光洁；

(2)固定捕获探针：将工作芯片置于表面等离子共振仪内，进样捕获探针，捕获探针流过工作芯片表面，通过金-硫键固定于芯片表面；所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，其序列如SEQ ID NO.2所示，具体序为：5'SH-GGCCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAAACATGATGACGGCC-3'；

(3)封闭芯片：采用1mM MCH封闭芯片表面非特异性吸附位点，即得工作芯片。在使用之前，于4℃低温保存，该工作芯片可重复多次使用。

3.表面等离子共振检测传感器的使用

(1)将2中所制备的工作芯片置入表面等离子共振仪中，以杂交液为运行液，设置流速为5μL.min^-1，待基线稳定。

(2)加入样品，进样量为40μL。

(3)以杂交液作为稀释缓冲液，现配制浓度为1μM的辅助DNA探针1和2的混合液，进样40μL，辅助DNA探针1的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：5'-BiotinTTTTGCACCTGGGGGAGGCCGTCATCAT-3'，辅助DNA探针2的序列如SEQ IDNO.4所示，具体为：5'-TCCCCCAGGTGCATGATGACGGCC-3'。

(4)以杂交液作为稀释缓冲液，配制浓度为200nM的链霉亲和素，进样40μL。

(5)用50mM的NaOH溶液作为再生液，进样5μL。

(6)以三次进样的SPR响应信号总和作为对应样品的响应信号。

(7)工作芯片可重复多次使用，因而可重复操作(1)-(5)进行多个样品检测。

4.对比试验

在同一实验条件下，分别为样品miRNA-21；样品miRNA-21后仅加辅助DNA探针1；miRNA-21后加DNA串联体所对应的SPR响应信号水平。

实施例2用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器表征和检验

1.工作芯片固定捕获探针的表征

如图1显示，巯基标记的捕获探针能很好地固定在裸金芯片上。

2.分别加入miRNA-21、辅助DNA探针1和2、链霉亲和素和再生液NaOH的表征如图2所示，是每一步的加入miRNA-21、辅助DNA探针1和2、链霉亲和素和再生液NaOH的SPR响应信号：

△RU1为miRNA-21的SPR响应信号水平；

△RU2为辅助DNA探针1和2形成的DNA串联体的SPR响应信号水平；

△RU3为链霉亲和素与辅助DNA探针1标记的生物素结合后产生的SPR响应信号水平；

并可见再生液NaOH能够把结合上的物质完全再生下来。

3.对比实验：

如图3所示，分别为miRNA-21、miRNA-21后仅加辅助DNA探针1、miRNA-21后加DNA串联体、miRNA-21后加DNA串联体和链霉亲和素所对应的SPR响应信号水平。

实施例3用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器及其使用条件的优化

我们还对实验过程中几个重要的条件即不同序列的捕获探针、不同序列的辅助DNA探针1和2、辅助DNA探针1和2的比例、辅助DNA探针1和2的浓度、链霉亲和素的浓度这三个测定条件进行了进一步的优化。对每一个条件都由低浓度到高浓度分别选取五个点进行一系列实验。

1.考察不同捕获探针对表面等离子共振传感器的影响：

在同一张传感芯片上分别固定捕获探针CP1，CP2，CP3，用MCH封闭制得传感芯片。

加入100nM miRNA-2140μL，流速为5μL.min^-1，得到的传感信号如图4，可见捕获探针最佳选为CP1。

2.根据捕获探针CP1，分别设计了三对辅助探针：AP1-1和AP2-1，AP1-2和AP2-2，AP1-3和AP2-3，加入100nM miRNA-2140μL，流速为5μL.min^-1后再分别加入三对辅助探针进行信号放大，得到的放大部分传感图如图5，可见AP1-1和AP2-1为最佳选择。

3.为考察辅助DNA探针1和2的比例对表面等离子共振检测传感器使用的影响，本实验采用了不同比例的辅助DNA探针1和2(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)，结果表明，当辅助DNA探针1所占比例大于或等于辅助DNA探针2时，能结合的链霉亲和素更多，对应的SPR响应水平更高。如图7可见，辅助DNA探针1和2的比例为1:1时，为最佳。

4.为考察辅助DNA探针1和2的浓度大小对表面等离子共振检测传感器使用的影响，本实验采用了不同浓度的(250nM、500nM、1000nM、1500nM、2000nM)辅助DNA探针1和2。如图8可见，SPR响应水平随着辅助DNA探针1和2浓度的增加而增加，当辅助DNA探针1和2浓度达到1000nM的以后，再增大辅助DNA探针1和2的浓度，SPR响应信号增大不明显，说明1000nM已经达到辅助DNA探针1和2的最佳浓度。

5.同理，为考察链霉亲和素浓度大小对表面等离子共振检测传感器使用的影响，本实验采用了不同浓度的(100nM、150nM、200nM、250nM、300nM)链霉亲和素，然后进行SPR检测。如图9可见，链霉亲和素最佳浓度为200nM。

实施例4用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器的性能分析

为了评估本发明表面等离子共振检测传感器的性能，对以杂交液(pH7.4)配制的不同浓度的miRNA-21标准品进行分析。

具体的，(1)用杂交液(pH7.4)稀释miRNA-21到8个不同浓度的(1000nM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM)，进样40μL，用四参数拟合绘制校准S形曲线，校准曲线检测范围为0.50-1000nM，回归方程为Y＝(A₁-A₂)/(1+(X/X₀)^P)+A₂，其中A₁＝16.08±6.08，A₂＝421.69±6.55，X₀＝15.98±1.01，P＝0.79±0.06，相关系数为0.9996。将未添加miRNA的杂交液作为空白对照，并重复检测3次，计算平均值和标准差，根据空白信号平均值加上3倍标准差所对应的值估计最低检出限，计算得0.47nM，如图10。

(2)在最优实验条件下，用杂交液(pH7.4)稀释miRNA到11个不同浓度的(1000nM、100nM、50nM、10nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM)，进样40μL绘制校准S形曲线，校准曲线检测范围为0.010-1000nM，回归方程为Y＝(A₁-A₂)/(1+(X/X₀)^P)+A₂，其中A₁＝-69.95±7.34，A₂＝2890.50±18.50，X₀＝5.27±0.16，P＝0.47±0.01，相关系数为0.9978，将未添加miRNA的杂交液作为空白对照，并同样进行第一步和第二步信号放大，并重复检测3次，计算平均值和标准差，根据空白信号平均值加上3倍标准差所对应的值估计最低检出限，计算得0.009nM，如图11。

实施例5用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器的特异性分析

本发明的表面等离子共振检测传感器的特异性，在检测同源性miRNA时具有重要的作用，主要取决于工作芯片中捕获探针的特异性，我们所使用的茎环结构的捕获探针能很好地保证该传感器的特异性。为了评价本表面等离子共振检测传感器的特异性，我们对与靶miRNA-21相比的单碱基突变、双碱基突变、完全不互补序列和miRNA-222各1nM和10nM分别采用同实施例4所构建的表面等离子共振检测传感器进行测定。序列分别为：

单碱基错配(SM)：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUUA-3'

双碱基错配(DM)：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUUUUUA-3'

完全不互补(NC)：5'-AUUGAAUAUUCUUAUUAUAAUU-3'

miRNA-222：5'-AGCUACAUCUGGCUACUGGGUCUC-3'

结果如图12所示，相比同浓度的靶miRNA-21，单碱基和双碱基突变序列的SPR响应信号都有明显降低，完全不互补序列和miRNA-222都接近空白所对应的SPR响应信号。这些结果说明制备的表面等离子共振miRNA检测传感器，具有良好的特异性。

实施例6用于检测MicroRNA-21的表面等离子共振传感器的稳定性和重现性分析

工作芯片固定一次捕获探针，检测样品30次，SPR响应信号降低﹤15％，表明工作芯片重复多次使用也能保证性能。用工作芯片在最优实验条件下，对100pM和10nM miRNA-21进行检测，重复进行三次平行实验，变异系数分别为6.3％和7.6％。表明本发明制备的表面等离子共振检测传感器具有良好的稳定性和重现性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种检测miRNA-21的表面等离子共振传感器，包括用于检测miRNA-21工作芯片，所述工作芯片为在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针所得。

2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述捕获探针为茎环结构，包含一段与miRNA-21完全互补的碱基序列，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.1～3所示。

3.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，每个工作芯片上，含有所述捕获探针的摩尔量为3.5x10^-2～14x10^-2nmol。

4.一种如权利要求1～3任一权利要求所述表面等离子共振传感器中的工作芯片的制备方法，所述方法为先在裸金芯片表面固定针对miRNA-21的捕获探针，而后进行封闭芯片所得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

(3)封闭芯片：封闭非特异性吸附位点，即得工作芯片。

6.一种用于检测miRNA-21的检测系统，包括如权利要求1～3任一权利要求所述表面等离子共振传感器。

7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括辅助DNA探针1、辅助DNA探针2和链霉亲和素，所述辅助DNA探针1的序列如SEQ ID NO.4～6所示，所述辅助DNA探针2的序列如SEQ ID NO.7～9所示。

8.根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针2的摩尔比为3:1～1:3。

9.根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述辅助DNA探针1和辅助DNA探针2的摩尔浓度分别为250nM～2000nM。

10.根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述链霉亲和素的摩尔浓度为100nM～300nM。