TWI745704B - 氧化鎳晶片、其製備方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種氧化鎳晶片，其包含：基板；形成於基板上具有60%以上的透光度及奈米結構之氧化鎳薄膜；以及包含透過組氨酸或組氨酸標記蛋白修飾於氧化鎳薄膜上之複數個生物探針之生物探針層。

Description

氧化鎳晶片、其製備方法及用途
本發明係關於一種氧化鎳晶片、其製備方法及用途，特別係關於其上修飾有生物探針的一種氧化鎳晶片、其製備方法及用途。
多數的生物探針與待測物有特定的結合位點，故如何在表面上修飾具有位向性的生物探針，並同時保留其活性，是在開發生物晶片或生物檢測器時影響檢測靈敏度的重要關鍵之一，然而有效率並兼顧上述條件地修飾生物探針目前仍是一個挑戰。
近年，在眾多固定具位向性生物分子至生物晶片表面的方法中，自組裝單層膜技術被認為是一個相當具有潛力的修飾方式。自組裝單層膜技術主要是透過基板浸泡於其中溶有具有表面活性之有機及/或無機分子之溶液中，使溶液中之有機及/或無機分子自發性地與基板形成鍵結，自身化學吸附於基板表面形成單層。進一步地當基板表面為金屬表面時，分子能夠透過金屬螯合的方式與基板緊密結合，且組裝分子具有可控以及位向性，因而可廣泛地應用於各種領域。
有鑑於上述內容，本發明的目的在於提供一種具有高效能蛋白修飾率、高靈敏度、操作簡單、成本低廉，僅需少量生物探針及樣品便可進行高通量檢測分析，以及可應用於多種生物標靶檢測及/或光學檢測之氧化鎳晶片。
根據本發明之一目的，提出一種氧化鎳晶片，其包含：基板；形成於基板上並具有60%以上的透光度及奈米結構之氧化鎳薄膜；以及包含透過組氨酸或組氨酸標記蛋白修飾於氧化鎳薄膜上之複數個生物探針之生物探針層。
較佳者，氧化鎳薄膜的厚度在50nm至150nm的範圍內。
較佳者，組氨酸或組氨酸標記蛋白係透過自組裝修飾單層膜技術修飾於該氧化鎳薄膜上。
根據本發明之另一目的，提出一種氧化鎳晶片，其包含：基板；形成於基板上之氧化鎳薄膜；以及包含透過組氨酸或組氨酸標記蛋白修飾於氧化鎳薄膜上之複數個生物探針之生物探針層。氧化鎳薄膜係由以下步驟形成：形成鎳薄膜於基板上；以及以500℃以上鍛燒鎳薄膜一預定時間以形成氧化鎳薄膜。
較佳者，鎳薄膜的厚度在1nm至1000nm的範圍內。
較佳者，該預定時間小於1小時。
根據本發明之又一目的，提出一種氧化鎳晶片製備方法，其包含以下步驟：形成鎳薄膜於基板上；以退火溫度鍛燒鎳薄膜一預定時間以形成氧化鎳薄膜；以及透過組氨酸或組氨酸標記蛋白以自組裝單層膜技術將複數個生物探針修飾於氧化鎳薄膜上。
較佳者，退火溫度在500℃以上。
較佳者，該預定時間小於1小時。
根據本發明之另一目的，提出一種上述氧化鎳晶片用於生物檢測及/或光學檢測的用途。
10:氧化鎳晶片
100:基板
103:氧化鎳薄膜
105:生物探針層
1051、1052:組氨酸
1053、1504:組氨酸標記蛋白
1055:DNA探針
1056:抗體
S301~S305:步驟
結合附圖參照以下詳細說明將使本發明對於所述技術領域中具有通常知識者而言變得更加顯而易見，其中：第1圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片的圖；第2圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片的生物探針層之結構的示例的圖；第3圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片製備方法的流程圖；第4圖係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片中的氧化鎳薄膜與比較例的氧化鎳薄膜之SEM圖；第5圖係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片中的氧化鎳薄膜與比較例的氧化鎳薄膜之透光度比較圖表；第6圖係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片中的氧化鎳薄膜與比較例的氧化鎳薄膜之蛋白負載率比較圖；第7圖係為以不同之熱處理時間製得之氧化鎳薄膜之比較圖；第8圖係為根據本發明實施例之組氨酸標記綠色螢光蛋白之氧化鎳晶片在不同pH值的溶液中的螢光強度圖； 第9圖係為以共軛焦顯微鏡檢驗根據本發明實施例之氧化鎳晶片的圖；第10圖(a)部分係為以根據本發明實施例之氧化鎳晶片檢測HER2蛋白濃度的結果圖而第10圖(b)部分係為以酵素免疫分析法檢測HER2蛋白濃度之結果圖；以及第11圖係為以根據本發明實施例之氧化鎳晶片檢測HER2蛋白專一性之結果圖。
本發明旨在開發一製程簡單、成本低廉，但訊號靈敏、具有大量生產潛力之用於生物檢測的氧化鎳晶片、其製備方法及用途。
第1圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片的圖。參見第1圖，本發明實施例之氧化鎳晶片10具有基板100、氧化鎳薄膜103以及生物探針層105。在一實施例中，氧化鎳薄膜103可具有透光度及奈米結構。在另一實施例中，氧化鎳薄膜103可為經退火溫度鍛燒鎳薄膜一預定時間後所形成之氧化鎳薄膜。在一實施例中，鎳薄膜可具有1nm至1000nm範圍內之厚度，較佳地為1nm至100nm的厚度。氧化鎳薄膜103可具有50nm至150nm範圍內之厚度。
生物探針層105包含以自組裝修飾單層膜技術透過組氨酸或組氨酸標記蛋白修飾於該氧化鎳薄膜上之複數個生物探針，其具體結構如第2圖所示。第2圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片10的生物探針層105之結構的示例的圖。參見第2圖(a)部分，生物探針層105包含透過帶有組氨酸1051之組氨酸標記蛋白1053修飾於氧化鎳薄膜103上之複數個DNA探針1055，在此示例 中，組氨酸標記蛋白1053可為單鏈霉親和素，透過利用單體鏈霉親和素與生物素之高親和特性，DNA探針1055可有位向性地固定至氧化鎳薄膜表面，將具有正確位向生物探針固定至晶片表面且可進一步減少非專一性吸附的產生，使氧化鎳薄膜表面之有效DNA探針1055的數量大幅增加。進一步參見第2圖(b)部分，生物探針層105包含透過帶有組氨酸1052之組氨酸標記蛋白1054修飾於氧化鎳薄膜103上之複數個抗體1056，在此示例中，組氨酸標記蛋白1054可為G蛋白，透過G蛋白與抗體Fc端之高親和特性，所需的抗體1056可有位向性地固定至氧化鎳薄膜表面，將具有正確位向生物探針固定至晶片表面，改善傳統以物理性吸附具有非專一性吸附產生的缺點，使氧化鎳薄膜表面之有效抗體1056的數量大幅增加。
第3圖係為描繪根據本發明實施例之氧化鎳晶片製備方法的流程圖。參照第1圖，根據本發明實施例之氧化鎳晶片製備方法包含：形成鎳薄膜於基板上之步驟S301；以退火溫度鍛燒鎳薄膜一預定時間以形成氧化鎳薄膜之步驟S303；以及透過組氨酸或組氨酸標記蛋白以自組裝單層膜技術將複數個生物探針修飾於該氧化鎳薄膜上之步驟S305。
在步驟S301中，可採用任何適合的方法來將鎳薄膜形成於基板上。基板的實例可包含但不限於玻璃基板、石英基板及矽基板。基板的厚度無特別限制。在一實施例中，在步驟S301之前，可進一步包含清洗基板的步驟，以清除基板表面的雜質。鎳薄膜在基板表面的雜質清除乾淨之後形成於基板上，其中適合用於形成鎳薄膜方法，但不限於熱蒸鍍、濺鍍、脈衝雷射沉積、化學氣相沉積(CVD)、電漿輔助化學氣相沉積、網版印刷法、電鍍法、噴霧裂解 法、自旋塗佈法、液相沉積等。在一較佳實施例中，採用化學氣相沉積來將鎳薄膜形成於基板上。鎳薄膜的厚度可在約1nm至1000nm的範圍內。
在完成步驟S301之後，清潔所形成之鎳薄膜，接著以退火溫度鍛燒一預定時間以形成氧化鎳薄膜(步驟S303)。退火溫度的範圍可在約500℃以上、可在約600℃以上、可在約700℃以上、可在約800℃以上、可在約900℃以上、可在約1000℃以上、可在約1100℃以上。較佳地為在約800℃以上，更佳地為在約1100℃以上。當以500℃以上之退火溫度鍛燒鎳薄膜時，所述之鎳薄膜會變成具有60%以上的透光度的氧化鎳薄膜，而進一步以800℃以上之退火溫度鍛燒時，所述之鎳薄膜會進一步形成具有奈米結構的氧化鎳，其可提升表面積/體積比，增加可固定之組氨酸蛋白的表面積，進而達到最終生物探針的修飾量上升之目標，當退火溫度為1100℃以上時，氧化鎳薄膜的透光度可被進一步地提升。根據本發明實施例之氧化鎳晶片製備方法進行鍛燒的時間通常可在約1小時以下。較佳地，可在約30至150秒的範圍內、可在約60至150秒的範圍內、或可在約60至120秒的範圍內，更佳地，為約120秒。相較於鎳膜薄，鍛燒過後的氧化鎳薄膜可具有較大的厚度。在一實施例中，當鎳膜薄的厚度為約50nm時，鍛燒過後的氧化鎳薄膜可具有約150nm的厚度。
接著在氧化鎳薄膜上進行步驟S305，利用氧化鎳和組氨酸蛋白之間的高親和特性，透過組氨酸或組氨酸標記蛋白以自組裝單層膜技術將複數個生物探針修飾於氧化鎳薄膜上。在此步驟中，組氨酸標記蛋白無具體限制，其可為其上標記有組氨酸之任何蛋白。組氨酸標記蛋白的實例包含但不限於帶有組氨酸標記之單鏈霉親和素、帶有組氨酸標記之G蛋白或帶有組氨酸標記之抗體。所用之生物探針可視需要地選擇DNA探針、抗體或其組合。以下提供具體 實例以進一步說明本發明之氧化鎳晶片的氧化鎳薄膜具有提高之蛋白負載率、透光度等優點，從而可進一步提升氧化鎳晶片的靈敏度以及其他特性。
氧化鎳薄膜之製備
實例1
1.將玻璃基板利用75%酒精沖洗，氮氣槍吹乾，再放入氧電漿機中清除玻璃基板表面的雜質。氧電漿設定的參數為1毫巴(0.5升/小時)，60W，120秒。
2.利用CVD的方式將50nm鎳薄膜鍍在已清洗乾淨之玻璃基板表面上，並將其上鍍有鎳薄膜之玻璃基板用去離子水及75%酒精沖洗，再用氮氣槍把表面水分吹乾。
3.以800℃的退火溫度鍛燒鎳薄膜120秒以獲得氧化鎳薄膜1。
實例2
除了以1100℃的退火溫度對鎳薄膜進行鍛燒，以與實例1相同之方式製備氧化鎳薄膜2。
比較例1
除了以300℃的退火溫度對鎳薄膜進行鍛燒，以與實例1相同之方式製備氧化鎳薄膜。
比較例2
除了以400℃的退火溫度對鎳薄膜進行鍛燒，以與實例1相同之方式製備氧化鎳薄膜。
比較例3
直接取0.08mm的鎳箔，以800℃的退火溫度鍛燒鎳薄膜1小時以獲得比較氧化鎳薄膜。
氧化鎳薄膜之表面形貌
以掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察氧化鎳薄膜之表面形貌，所得之結果如的4圖所示。第4圖(a)部分為實例1及2以及比較例1及2之氧化鎳薄膜之SEM圖，而第4圖(b)部分為比較例3之氧化鎳薄膜之SEM圖。由第4圖可以看出實例1及2及比較例1至3所形成之氧化鎳薄膜具有不同之形貌，且僅有實例1及2的氧化鎳薄膜具有奈米結構，據此，本發明實施例之氧化鎳薄膜可以奈米結構之物理優勢提升表面生物探針的修飾率，從而增強最終檢測訊號。
氧化鎳薄膜之蛋白負載率評估
以鎳薄膜作為對照，對實例1及2以及比較例1及2之氧化鎳薄膜進行蛋白負載率評估，所得之結果如第5圖所示。第5圖係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片中的氧化鎳薄膜與比較例的氧化鎳薄膜之蛋白負載率比較圖。由第5圖可以看出，相較於比較例，實例1及2的氧化鎳薄膜具有較高的蛋白負載率，且退火溫度為1100℃時所製成之氧化鎳晶片2的蛋白負載率高於退火溫度為800℃時所製成之氧化鎳晶片1。也就是說，相較於比較例，本發明的氧化鎳薄膜可提高每單位面積的生物探針數量，從而提高本發明的氧化鎳晶片的偵測靈敏度。
氧化鎳薄膜之透光度評估
以玻璃作為對照，對實例1及2以及比較例1及2之氧化鎳薄膜進行透光度評估，所得之結果如第6圖所示。第6圖係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片中的氧化鎳薄膜與比較例的氧化鎳薄膜之透光度比較圖表。由第6圖(a)部分可以看出，相較於比較例，實例1及2的氧化鎳薄膜具有60%以上的透光度，且 由第6圖(b)部分可以看出，退火溫度為1100℃時所製成之氧化鎳晶片2的透光度大於退火溫度為800℃時所製成之氧化鎳薄膜1。
由以上對於特性之評估可以看出退火溫度大於1100℃時效果較佳。接著以退火溫度為1100℃，對進行熱處理溫度的時間進行比較，比較之結果如第7圖所示。第7圖係為以不同之熱處理時間製得之氧化鎳薄膜之比較圖。由第7圖可以看出晶粒大小會隨著溫度上升而越來越大，同時珊瑚狀的奈米結構也越來越清晰。成長後的珊瑚狀奈米結構具有更佳的比表面積，提供更多的表面積讓組氨酸標記蛋白修飾，因而可以達到最終檢測訊號的增訊效果。
以下將以包含氧化鎳薄膜2之氧化鎳晶片作為示例進一步解釋本發明的優點。
pH值穩定度
將其上具有氧化鎳薄膜2的玻璃基板浸泡於pH 5-9之溶液中整夜後，隔天以去離子水洗淨玻璃基板表面，接著浸泡於組氨酸標記綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)溶液中，待組氨酸標記綠色螢光蛋白(His6-GFP)固定於氧化鎳薄膜2上之後，測量其螢光強度以判定其穩定度，所得之結果示於第8圖。第8圖係為根據本發明實施例之組氨酸標記綠色螢光蛋白之氧化鎳晶片在不同pH值的溶液中的螢光強度圖。由第8圖可以看出，根據本發明實施例之氧化鎳晶片在pH值範圍為5至9的範圍內具有良好的穩定度。
光學檢測應用的可行性
以類似上述之方法，將過量表現(OE)及剔除表現(KO)SMU290膜蛋白的兩種肺炎鏈球菌固定於其上具有氧化鎳薄膜2的玻璃基板，接著以帶有m-cherry紅色螢光且與SMU290膜蛋白有專一性的胜肽(peptide)做培育，完成之 氧化鎳晶片的結構如第9圖(a)部分所示。第9圖(a)部分為根據本發明實施例之氧化鎳晶片的結構示意圖。將上述之氧化鎳晶片以共軛焦顯微鏡拍攝，所得之結果如第9圖(b)部分所示，第9圖(b)部分係為根據本發明實施例之氧化鎳晶片的結構示意圖為以共軛焦顯微鏡檢驗根據本發明實施例之氧化鎳晶片的圖。從第9圖可觀察出不論是白光下菌落的型態，藍光下以DAPI表示菌的DNA位置，抑或是紅光下以胜肽標示SMU290膜蛋白的結果都十分清晰，顯現氧化鎳晶片對於發展成其他光學檢測應用的可行性。
生物檢測應用的可行性
將其上具有氧化鎳薄膜2的玻璃基板浸泡於其上具有抗體Herceptin之組氨酸標記γGB1蛋白(His6-γGB1)，以形成用於驗證氧化鎳晶片對於人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)之檢測，其結果如第10圖及第11圖所示，第10圖(a)部分係為以根據本發明實施例之氧化鎳晶片檢測HER2蛋白濃度的結果圖而第10圖(b)部分係為以酵素免疫分析法檢測HER2蛋白濃度之結果圖，第11圖係為以根據本發明實施例之氧化鎳晶片檢測HER2蛋白專一性之結果圖。由第10圖可以看出，根據本發明實施例之氧化鎳晶片的檢測靈敏度涵蓋臨床需求的範圍(>15ng/mL)，且決定係數(coefficient of determination,R2)達0.96，與以酵素免疫分析法檢測之結果相匹配，但具有僅需少量抗體及樣品即可達到高靈敏度檢測之優勢，而由第11圖可以看出，根據本發明實施例之氧化鎳晶片對於檢測HER2蛋白具有高度專一性。
以上對本發明實施例之氧化鎳晶片的各種評估與檢測證實本發明實施例之氧化鎳晶片可藉由自組裝單層膜之機制，有位向性地修飾氧化鎳晶片表面，改善以物理性吸附固定蛋白之無法具有位向性、可能造成蛋白質變性， 需要多種化學修飾之步驟繁雜、對於蛋白質需要化學性預處理等缺點，並且只要是組胺酸蛋白，抑或是帶有組胺酸標記的任何蛋白質，都可以以上述方式，有位向性地固定於氧化鎳晶片表面，故操作人員無須經專業訓練，也可因時因地地根據所需快速修飾蛋白質，也因固定方式為金屬螯合的形式，可以在不需任何化學預處理的前提下，完整保持蛋白質構型以維持其活性，使得最終固定於晶片表面的有效生物探針可以提升。再者，本發明實施例之氧化鎳晶片具有奈米結構，從而可以其物理性優勢提升蛋白負載率，具有高效能之蛋白修飾率，從而可進一步增強最終的檢測訊號，以達到少量樣品即可進行高通量檢測分析之優勢。進一步地，相較於過去產生生物探針位向性之方法，本發明案具有成本低廉、操作及製程簡單等特點。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
10:氧化鎳晶片
100:基板
103:氧化鎳薄膜
105:生物探針層

Claims (9)

  1. 一種氧化鎳晶片製備方法，該方法包含以下步驟：形成一鎳薄膜於一基板上；以一退火溫度與一預定時間鍛燒該鎳薄膜以形成一氧化鎳薄膜，其中該退火溫度在500℃以上，且該預定時間為小於1小時；以及透過組氨酸或組氨酸標記蛋白，以自組裝單層膜技術將複數個生物探針修飾於該氧化鎳薄膜上。
  2. 如請求項1所述之製備方法，其中在形成該鎳薄膜於該基板上之前，更包含清除該基板表面的雜質。
  3. 如請求項1所述之製備方法，其中形成該鎳薄膜於該基板上之方法包含熱蒸鍍、濺鍍、脈衝雷射沉積、化學氣相沉積(CVD)、電漿輔助化學氣相沉積、網版印刷法、電鍍法、噴霧裂解法、自旋塗佈法或液相沉積。
  4. 如請求項1所述之製備方法，其中該鎳薄膜的厚度在1nm至1000nm的範圍內。
  5. 一種使用請求項1-4任一項之方法所製備的氧化鎳晶片，該氧化鎳晶片包含：一基板；一氧化鎳薄膜，形成於該基板上並具有60%以上的透光度及奈米結構；以及一生物探針層，包含透過組氨酸或組氨酸標記蛋白修飾位於該氧化鎳薄膜上之複數個生物探針。
  6. 如請求項5所述之氧化鎳晶片，其中該基板包含玻璃基板、石英基板或矽基板。
  7. 如請求項5所述之氧化鎳晶片，其中該氧化鎳薄膜的厚度在50nm至150nm的範圍內。
  8. 如請求項5所述之氧化鎳晶片，其中組氨酸或組氨酸標記蛋白係透過自組裝修飾單層膜技術修飾於該氧化鎳薄膜上。
  9. 一種如請求項5所述之氧化鎳晶片用於生物檢測及/或光學檢測的用途。
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