CN104726559A - 一种检测生物分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测生物分子的方法，首先使目的生物分子与磁珠探针结合，实现目的生物分子的初步富集，然后选择DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液，使目的生物分子与磁珠探针分离，再将目的生物分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，使目的生物分子液滴自然蒸发形成直径为45?400um的斑点，使目标分子的最终浓度较初始浓度提高103?105倍，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行灵敏度检测，显著提高检测灵敏度。该方法不仅适用于DNA、RNA等核酸分子的检测，而且适用于抗原-抗体免疫检测及酶-底物反应等相关检测，操作简便，易于广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种方法，该方法可以检测在生物材料中的生物分子，属于生物分子检测技术领域。
背景技术
生物分子，更具体地来自少量的生物材料的蛋白和/或肽的特异性检测，是用于研究和医疗诊断的重要要求。
作为生命活动的基本分子和遗传信息的载体，生物分子的检测一直是人们关注的重要课题之一，如何实现生物分子简单、快速、高灵敏度和特异性检测，对于疾病的诊断与治疗、环境监测、公共安全甚至防恐等都具有非常重要的意义。
就核酸分子而言，按其检测原理一般可以分为两类：一类是基于聚合酶链式反应（PCR)的各种指数扩增技术；另一类则是基于核酸分子杂交互补原理，通过杂交反应固定靶分子进行检测。PCR技术能对靶序列进行扩增，提高检测灵敏度，但由于酶的储存运输要求严格，并且通常需要专业人员操作，操作繁琐，耗时较长，价格相对昂贵，自动化存在困难；如果采用杂交的方法，由于对靶序列没有前期的扩增，相对的检测灵敏度远不如PCR的检测方法，但操作比较简单，易于满足复杂场地的检测需要。而蛋白质分子与核酸分子不同，它不能通过扩增技术使目的蛋白分子数目增加，只能采用酶联免疫吸附法（ELISA)等方法直接测定，因此，检测灵敏度受到极大限制，且检测过程繁琐，检测时间较长。
微浓缩技术是使液滴在一疏水表面自然蒸发，通过液滴收缩作用，提高液滴中溶质分子检测灵敏度的方法。Nordhoff等（Ana
Chem,2000,72,3436-3442)通过微加工技术在疏水性聚四氟乙烯表面制备直径200pm、间隔2.25mm的纳米金亲水阵列，然后将待测样品溶液滴在表面上，随着溶剂的蒸发，溶质生物分子将自动浓缩于亲水性纳米金位点，形成直径为200um的液斑，用免疫沉淀及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，可显著提高检测灵敏度，对于MALDI-MS而言，一般情况下，对80bp的DNA分子，其检测灵敏度约为50fM,而经过微浓缩后其检测灵敏度可提尚到5fM左右。
但是目前使用的方法在检测的时候存在灵敏度不高的缺陷，因此急需提供一种新的检测生物分子的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种检测生物分子的方法，可以有效提高检测的灵敏度。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种检测生物分子的方法，首先使目的生物分子与磁珠探针结合，实现目的生物分子的初步富集，然后选择DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液，使目的生物分子与磁珠探针分离，再将目的生物分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，使目的生物分子液滴自然蒸发形成直径为45〜400um的斑点，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行检测，具体包括以下步骤：
A.先使磁珠与探针生物分子结合，形成磁珠探针；将一端共价结合有荧光分子的生物分子溶液与磁珠探针混合，使目的生物分子与磁珠探针结合；
B.分离磁珠，梯度洗涤，磁分离，加DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液使目的生物分子与磁珠探针分离；
C.用磁分离器处理步骤2)得到的目的生物分子溶液，取上清液1〜8uL滴于疏水表面上进行浓缩，使液滴自然蒸发，蒸干后浓缩斑点直径在45〜400um之间；
D.采用荧光显微镜或芯片扫描仪对浓缩斑点进行检测。
优选的，所述磁珠探针是指通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、戊二醛、二硫键或链霉亲和素-生物素将探针生物分子与磁珠共价结合，形成可与目的生物分子结合的磁珠探针；所述磁珠颗粒直径在0.4〜8um，磁珠表面有羧基、氨基、羟基、巯基、甲苯磺酰基、链霉亲和素或生物素包被。
更优选的，所述疏水表面是指经十七氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、碳氟聚合物或聚四氟乙烯修饰的玻片、硅片、石英。
进一步的，所述生物分子是经过修饰的。
更进一步的，所述生物分子为DNA、RNA、酶、抗原或抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：
⑴本发明通过磁珠富集和微浓缩效应使检测灵敏度提高到1.6〜160aM(而通常情况下荧光分析的检测灵敏度为1〜10fM),大大提高了检测灵敏度；
⑵适用范围广，不仅适用于DNA、RNA等核酸分子的检测，而且还适用于抗原-抗体免疫检测及酶-底物反应等相关检测；
⑶磁珠探针和疏水表面制备简单，易于存储，且可批量制备，使检测成本显著降低；检测迅速，整个检测过程可在1小时内完成；
⑷该检测方法简单易行，操作简便，特异性和灵敏度高，且易于自动化，应用前景好。
具体实施方式
本发明提供一种用于检测生物分子（DNA、RNA、酶、抗原及抗体等)的方法，首先使磁珠与探针生物分子（单链DNA、酶、抗原或抗体等）结合，形成磁珠探针，再与溶液中标记有荧光基团的目的生物分子进行杂交，利用磁珠实现目的分子的初步富集；然后通过DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液使磁珠探针与目的分子分离，再将目的分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，目的生物分子溶液蒸发形成直径45〜400pm的斑点，使目标分子的最终浓度较初始浓度提高103〜105倍，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行检测，显著提高检测灵敏度。
具体的工艺过程是：①先通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC)、戊二醛、二硫键或链霉亲和素-生物素等将探针生物分子与磁珠共价结合，形成可与目的生物分子特异结合的磁珠探针；磁珠颗粒直径在0.5〜1.5um，磁珠表面有竣基、氣基、轻基、疏基、链霉未和素或生物素等包被；将一端共价结合有荧光分子的生物分子溶液与磁珠探针混合，使目的生物分子与磁珠探针结合；②分离磁珠，梯度洗涤，应尽可能除去与磁珠探针不能结合的生物分子，并减少磁珠探针与目的生物分子发生分离，以提高检测的特异性；为保证随后的微浓缩过程浓缩斑点足够小，选择适宜浓度的DNA、RNA变性溶液或免疫分离溶液使目的生物分子与磁珠探针分离；③用磁分离器处理上述得到的目的生物分子溶液，取经磁分离器处理的含目的生物分子上清液1〜8pL滴于疏水表面上进行浓缩，疏水表面是指经十七氟癸基三甲氧基硅烷（FAS)、十八烷基三甲氧基硅烷、碳氟聚合物（FCP)或聚四氟乙烯（PTFE)等修饰的玻片、硅片、石英或聚合物膜等；继而使液滴自然蒸发，蒸干后浓缩斑点直径在45〜400pm之间；④采用荧光显微镜或芯片扫描仪对浓缩斑点进行检测。
实施例1
微浓缩技术用于人类巨细胞病毒PP150蛋白分子高灵敏度检测：
磁珠探针的制备，将待测溶液与磁珠探针混合，使目的蛋白分子与磁珠探针结合；
取30uL的甲苯磺酰基修饰的磁珠（直径10pm，4X108个/mL)置于微量离心管中，用磁分离器处理8分钟，弃去上清液，再用100pL包被缓冲液（0.1mol/L磷酸，pH为9.5)清洗3次，加入10pL
1mg/mL的PP150-8MAPs抗原肽混合均匀，37℃振荡孵育24h，用磁分离器处理5分钟，弃去反应液。4℃用缓冲液A(2g/LBSA的PBS，pH7.4)洗涤磁珠3次，并用1mL缓冲液A悬浮磁珠。
将用PP150-8MAPS免疫的Balb/c小鼠抗血清用考马斯亮蓝染色后，用缓冲液A稀释105倍，取lmL与8uL的磁珠溶液混合，室温轻轻振 荡60min,用磁分离器处理5分钟，弃去反应液，用缓冲液A洗涤3次。
分离磁珠，加免疫分离溶液使目的蛋白分子与磁珠探针分离；
用磁体富集上述结合有目的DNA的磁珠，弃去上清液，用15uLMilli-Q水悬浮磁珠，37℃静置10min使目的分子与磁珠探针分离。
疏水表面的制备；
将玻片置于表面皿中，用丙酮浸泡清洗30分钟，用乙醇清洗2次，用Milli-Q水冲洗干净；玻片浸入浓度比为1:1的HC1:C2H50H溶液中，清洗30分钟，用Milli-Q水冲洗干净；玻片浸入浓度比为3:1的H2S04:30%H202溶液约30分钟，用Milli-Q水冲洗干净，用氮气吹干；
将玻片浸入2%十八烷基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中反应2小时，用Milli-Q水清洗干净，用氮气吹干。
用磁分离器处理步骤2)中的含目的蛋白的溶液，取上清液10pL滴于步骤3)制得的疏水表面上，使液滴自然蒸发实现微浓缩过程。
采用荧光显微镜对浓缩斑点进行检测，浓缩斑点直径约为400|am，检测灵敏度约为160aM。
综上所述，本发明通过磁珠富集和微浓缩效应使检测灵敏度提高到1.6〜160aM(103〜105个分子/mL)，显著提高了检测灵敏度；适用范围广，不仅适用于DNA、RNA等核酸分子的检测，而且适用于抗原-抗体免疫检测及酶-底物反应等相关检测；磁珠探针和疏水表面制备简单，易于存储，且可批量制备，使检测成本显著降低；检测迅速，整个检测过程可在1小时内完成；与现有技术相比，该检测方法简单易行，操作简便，特异性和
灵敏度高，且易于自动化，有广泛的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种检测生物分子的方法，其特征在于，首先使目的生物分子与磁珠探针结合，实现目的生物分子的初步富集，然后选择DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液，使目的生物分子与磁珠探针分离，再将目的生物分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，使目的生物分子液滴自然蒸发形成直径为45〜400um的斑点，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行检测，具体包括以下步骤：
A.先使磁珠与探针生物分子结合，形成磁珠探针；将一端共价结合有荧光分子的生物分子溶液与磁珠探针混合，使目的生物分子与磁珠探针结合；
B.分离磁珠，梯度洗涤，磁分离，加DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液使目的生物分子与磁珠探针分离；
C.用磁分离器处理步骤2)得到的目的生物分子溶液，取上清液1〜8uL滴于疏水表面上进行浓缩，使液滴自然蒸发，蒸干后浓缩斑点直径在45〜400um之间；
D.采用荧光显微镜或芯片扫描仪对浓缩斑点进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测生物分子的方法，其特征在于，所述磁珠探针是指通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、戊二醛、二硫键或链霉亲和素-生物素将探针生物分子与磁珠共价结合，形成可与目的生物分子结合的磁珠探针；所述磁珠颗粒直径在0.4〜8um，磁珠表面有羧基、氨基、羟基、巯基、甲苯磺酰基、链霉亲和素或生物素包被。
3.根据权利要求1所述的一种检测生物分子的方法，其特征在于，所述疏水表面是指经十七氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、碳氟聚合物或聚四氟乙烯修饰的玻片、硅片、石英。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种检测生物分子的方法，其特征在于，所述生物分子是经过修饰的。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的一种检测生物分子的方法，其特征在于，所述生物分子为DNA、RNA、酶、抗原或抗体。
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