KR101126845B1

KR101126845B1 - 선택 결합성 물질 고정화 담체

Info

Publication number: KR101126845B1
Application number: KR1020057021996A
Authority: KR
Inventors: 구니히사 나기노; 후미오 나까무라; 히또시 노부마사
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2003-05-19
Filing date: 2004-05-18
Publication date: 2012-03-28
Also published as: US7795006B2; EP1626276A1; EP1626276A4; US20110028347A1; US20070009958A1; US9358518B2; WO2004102194A9; ES2727785T3; KR20060003112A; WO2004102194A1; DK1626276T3; CA2525938A1; EP1626276B1; JP4380631B2; CA2525938C; JPWO2004102194A1; CN1839317A; US9333478B2; PL1626276T3; US20110015097A1

Abstract

담체의 표면에 선택 결합성 물질을 고정화한 선택 결합성 물질 고정화 담체이며, 담체의 표면이, 하기 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 전체 단량체 단위의 10 ％ 이상 함유하고 있는 중합체를 가지고, 선택 결합성 물질은 담체의 표면에 생성된 카르복실기와의 공유 결합으로써 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체이다.

<화학식 1>

(화학식 1 중 R¹, R², R³은 알킬기, 아릴기 또는 수소 원자를 나타낸다.)

선택 결합성 물질, 선택 결합성 물질 고정화 담체, 카르복실기와의 공유 결합

Description

선택 결합성 물질 고정화 담체 {SUPPORT HAVING SELECTIVELY BONDING SUBSTANCE FIXED THERETO}

본 발명은 피검 물질과 선택적으로 결합하는 물질(본 명세서에 있어서 「선택 결합성 물질」) 을 고정화한 담체에 관한 것이다.

각종 생물의 유전 정보 해석의 연구가 시작되고 있고, 인간 유전자를 비롯하여 다수의 유전자와 그의 염기 서열, 또한 유전자 서열에 코딩되는 단백질 및 이들 단백질로부터 이차적으로 만들어지는 당쇄(糖鎖)에 관한 정보가 급속히 밝혀져 가고 있다. 서열이 명확해진 유전자, 단백질, 당쇄 등의 고분자체의 기능에 대해서는, 각종 방법으로 조사할 수 있다. 주된 것으로서는, 핵산에 대해서는 노던 하이브리다이제이션 또는 서던 하이브리다이제이션과 같은, 각종 핵산/핵산 사이의 상보성을 이용하여 각종 유전자와 그의 생체 기능 발현과의 관계를 조사할 수 있다. 단백질에 대해서는, 웨스턴 하이브리다이제이션으로 대표되는 것과 같은, 단백질/단백질 사이의 반응을 이용하여 단백질의 기능 및 발현에 대하여 조사할 수 있다.

최근, 다수의 유전자 발현을 한번에 해석하는 수법으로서 DNA 마이크로어레이법(DNA 칩법)이라 불리는 새로운 분석법 내지 방법론이 개발되어 주목을 모으고 있다. 이들 방법은 모두 핵산/핵산 사이 하이브리다이제이션 반응에 기초하는 핵 산 검출ㆍ정량법인 점에서 원리적으로는 종래의 방법과 동일하고, 단백질/단백질 사이 또는 당쇄/당쇄 사이나 당쇄/단백질 사이의 것에 기초하는 단백질이나 당쇄 검출ㆍ정량에도 응용이 가능하다. 이들 기술은, 마이크로어레이 또는 칩이라고 불리는 유리 평면 기판상에, 다수의 DNA 단편이나 단백질, 당쇄가 고밀도로 정렬 고정화된 것이 이용되고 있는 점에 큰 특징이 있다. 마이크로어레이법의 구체적 사용법으로서는, 예를 들면 연구 대상 세포의 발현 유전자 등을 형광 색소 등으로 표지한 샘플을 평면 기판상에서 하이브리다이제이션시켜, 상호 상보적인 핵산(DNA 또는 RNA)끼리 결합시키고, 그 개소를 고해상도 해석 장치에서 고속으로 판독하는 방법이나, 전기 화학 반응에 기초하는 전류값 등의 응답을 검출하는 방법을 들 수 있다. 이렇게 하여, 샘플 중의 각각의 유전자량을 신속하게 추정할 수 있다.

예를 들면, 일본 특허 공표 (평)10-503841호 공보(특허 청구의 범위)에는, 핵산을 기판상에 고정화하기 위한 기술로서, 슬라이드 유리 등의 평탄한 기판상에 폴리-L-리신, 아미노실란 등을 코팅하고, 스폿터라고 불리는 점착(点着) 장치를 이용하여, 각 핵산을 고정화하는 방법 등이 개시되어 있다.

또한, 예를 들면 일본 특허 공개 제2001-108683호 공보(특허 청구의 범위 및 실시예)에는, DNA 칩에 이용되는 핵산 프로브(기판상에 고정화된 핵산)는, 종래의 수백 내지 수천 염기 길이의 cDNA 및 그의 단편으로부터, 검출시의 에러를 줄이고, 합성기에서 쉽게 합성할 수 있다는 이유 때문에, 핵산 프로브로서 올리고 DNA(올리고 DNA란 염기수가 10 내지 100 염기까지인 것을 말함)를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 이 때, 올리고 DNA와 유리 기판을 공유 결합으로써 결합시키고 있다.

그 밖에, DNA 칩에 이용되는 유리 이외의 기판의 재료로서는, 수지제 기판에 대하여 몇몇 제안이 있다. 예를 들면, 일본 특허 공개 제2001-337089호 공보(제17 단락)에는 기판으로서, 폴리메틸메타크릴레이트를 포함하는 중합체에 대한 기술이 있다. 그러나, 일본 특허 공개 제2001-337089호 공보에는 구체적인 DNA의 고정화 방법에 대해서는 아무런 기재가 없다. 또한, 일본 특허 공개 제2003-130874호 공보(제12 단락)에도 동일한 기술이 있지만, 구체적인 DNA의 고정화 방법에 대해서는 아무런 기술이 없다. 일본 특허 공개 제2002-71693호 공보(제7 단락)에는 아크릴섬유 등의 니트릴기를 갖는 섬유를 알칼리 처리에 의해서 카르복실기를 갖는 섬유로 유도하고, 이 카르복실기와 DNA 등을 결합하여 고정화하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 알칼리 섬유는 폴리아크릴로니트릴이 주성분이기 때문에, 재료 자체의 자가 형광이 커서 기판으로서는 부적당하다는 문제점이 있다. 또한, 일본 특허 공개 제2002-71693호 공보(제7 단락)에는, 폴리메타크릴레이트를 아크릴산, 메타크릴산과의 공중합에 의해서 카르복실기를 갖는 섬유로 유도하고, 이 카르복실기와 DNA를 결합하는 방법이 개시되어 있지만, 이 방법에서는 기판(담체) 표면의 카르복실기의 양이 적어, 고정할 수 있는 DNA의 양이 적어지고, 결과적으로 하이브리다이제이션을 나타내는 시그널을 충분히 얻을 수 없다는 문제점이 있었다.

<발명의 개시>

본 발명이 해결하려고 하는 과제는 다음과 같은 것이다. 우선, 평탄한 유리 기판에 올리고 DNA를 고정화한 경우, 이하와 같은 문제점이 있었다. 즉, 1) 하이브리다이제이션을 행하였을 때, 유리가 친수적이기 때문에, 프로브 DNA를 고정한 스폿 이외의 부분에도 비특이적으로 검체 DNA가 흡착하기 쉽고, 스캐너라고 불리는 장치에서 형광 검출을 행할 때, 이 비특이적으로 흡착된 검체도 검출하여 노이즈가 커진다는 문제점과, 2) 유리가 강체이기 때문에, 이것에 공유 결합한 올리고 DNA의 공간적인 자유도가 방해받는다는 추정 이유로부터, 검체 DNA와의 하이브리다이제이션 효율이 낮기 때문에, 시그널 강도가 작고, 결과적으로 S/N비가 충분하지 않다는 문제가 있었다.

본 발명이 해결하려고 하는 과제는, 수지제 기판에 강고하면서, 또한 하이브리다이제이션 효율이 양호한 상태로 DNA를 고정화한 담체를 제공하는 것이다. 또한, 상기와 같은 S/N의 악화를 막고, 검출 감도가 높은 선택 결합성 물질이 고정화된 담체를 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은, 선택 결합성 물질이 고정화된 담체이고, 상기 담체의 표면이 저자가(低自家) 형광 수지를 포함하며, 알칼리 또는 산으로 이 중합체의 표면을 처리하여, 카르복실기를 생성하고 나서 선택 결합성 물질을 고정화한 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체이다.

또한, 본 발명은 담체의 표면에 선택 결합성 물질을 고정화한 선택 결합성 물질 고정화 담체이며, 담체의 표면이, 하기 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 함유하고 있는 중합체를 가지고, 알칼리 또는 산으로 이 중합체의 표면을 처리하고 나서 선택 결합성 물질을 고정화한 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체이다.

본 발명에 의해, 비특이적인 검체의 흡착이 적으면서, 하이브리다이제이션 효율이 양호하고, 결과적으로 S/N비가 양호한 선택 결합 물질이 고정화된 담체를 제공할 수 있다.

도 1은 PMMA 표면에 선택 결합성 물질을 고정화할 때의 반응식을 나타내기 위한 도면,

도 2는 본 발명의 담체의 모식도,

도 3은 본 발명의 담체의 단면 모식도,

도 4는 마이크로어레이 부딪힘용 치구(治具)의 예를 나타내는 도면,

도 5는 담체 요철부의 단면도,

도 6은 지지체층과 선택 결합성 물질 고정화층을 갖는 담체의 개념도,

도 7은 유리 표면에 선택 결합성 물질을 고정화할 때의 반응 구성을 나타내기 위한 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명의 선택 결합성 물질의 고정화 담체에 대하여 설명한다.

본 발명의 선택 결합성 물질의 고정화 담체는, 선택 결합성 물질을 고정화하기 위해서, 담체의 표면이 저자가 형광 수지를 포함하고, 또한 알칼리 또는 산으로 표면을 처리하여 카르복실기를 생성하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 저자가 형광 수지란, 액손 인스트루먼츠(Axon Instruments)사의 제네픽스(GenePix) 4000B를 이용하여, 두께 1 mm의 청정한 평판을, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 설정 게인 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 측정하였을 때, 형광 강도가 1000 이하인 것을 말한다. 이것을 만족시키지 않는 수지는, 검출시의 S/N이 악화되기 때문에 바람직하지 않다. 이러한 수지로서는, 예를 들면 하기 화학식 1로 표시되는 중합체를 들 수 있다.

<화학식 1>

또한, 본 발명의 선택 결합성 물질의 고정화 담체는, 선택 결합성 물질을 고정화하기 위한 담체의 표면이, 하기 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 함유하고 있는 중합체를 갖는 고체이다.

<화학식 1>

상기 중합체로서는, 단독 중합체 또는 공중합체가 이용된다. 상기 중합체는, 하나 이상의 유형의 단량체를 원료로 이용하고 있고, 그 단량체는, 중합에 관여할 수 있는 이중 결합 및 중축합에 관여할 수 있는 관능기, 및 케톤 또는 카르복실산 또는 이들의 유도체의 형태로 존재한다. 또한, 상기 중합체는, 화학식 1의 구조를 갖는 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기 중합체가 공중합체인 경우, 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 전체 단량체 단위의 10 ％ 이상 함유하고 있는 것이 바람직하다. 화학식 1로 표시되는 구조 단위의 함유량이 10 ％ 이상이면, 후에 설명하는 것과 같은 단계로 표면에 많은 카르복실기를 생성할 수 있어, 프로브 핵산을 많이 고정화할 수 있기 때문에, 결과적으로 S/N비가 보다 향상된다.

본 발명에서 중합체란, 수평균 중합도가 50 이상인 것을 말한다. 이 중합체의 수평균 중합도의 바람직한 범위는 100 내지 1만이다. 특히 바람직하게는 200 이상 5000 이하이다. 또한, 수평균 중합도는 GPC(겔 투과 크로마토그래피)를 이용하여 정해진 방법에 의해 중합체의 분자량을 측정함으로써 쉽게 측정할 수 있다.

화학식 1에 있어서, R¹ 및 R²는 알킬기, 아릴기 또는 수소 원자를 나타내고, 각각 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 알킬기는 직쇄상일 수도 또는 분지상일 수도 있고, 바람직하게는 1 내지 20의 탄소수를 갖는다. 상기 아릴기는 바람직하게는 6 내지 18, 더욱 바람직하게는 6 내지 12의 탄소수를 갖는다. 관능기 X는 O, NR³ 또는 CH₂ 중에서 임의로 선택된다. R³은 상기 R¹ 및 R²와 동일하게 정의되는 관능기이다.

상기 각종의 관능기를 포함하는 중합체에서, 바람직한 것으로서는, 예를 들면 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸메타크릴레이트(PEMA) 또는 폴리프로필메타크릴레이트의 폴리메타크릴산알킬(PAMA) 등이 있다. 이들 중에서 가장 바람직한 것은, 사출 성형이나 핫 엠보스법으로 성형이 용이하며, 비교적 유리 전이 온도가 높은 점에서 폴리메틸메타크릴레이트이다. 또한, 폴리아세트산비닐, 폴리메타크릴산 시클로헥실 또는 폴리메타크릴산페닐 등도 사용할 수 있다. 또한, 상기 중합체의 구성 요소를 조합하거나, 또는 상기 중합체의 구성 요소에 다른 1종 또는 복수종의 중합체의 구성 요소를 첨가한 구조의 공중합체도 사용할 수 있다. 상기 다른 중합체로서는, 폴리스티렌 등이 있다.

공중합체의 경우, 각 구성 요소비의 범위는, 카르보닐기를 포함하는 단량체, 예를 들면 메타크릴산알킬의 비율은, 10 몰％ 이상이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 표면에 많은 카르복실산을 생성할 수 있어 프로브 핵산을 많이 고정화할 수 있기 때문에, 결과적으로 S/N비가 보다 향상되기 때문이다. 중합체의 구조 단위 중, 보다 바람직한 상기 단량체의 비율은 50 몰％ 이상이다.

또한, 본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 1개 이상 갖는 중합체를 갖는 담체에 선택 결합성 물질을 고정화하기 위해서, 이것에 알칼리 또는 산으로 전처리를 실시하는 것이 필요하다. 이렇게 함으로써, 담체의 표면에 카르복실기를 형성시킬 수 있다. 담체의 표면에 카르복실기를 생성하는 수단으로서는, 알칼리, 산 등으로 처리하는 방법을 단독으로 이용할 뿐만 아니라, 따뜻한 중에서의 초음파 처리, 산소 플라즈마, 아르곤 플라즈마, 방사선에 담체를 노출되는 방법등과 조합할 수도 있다. 이들 방법 중에서도, 담체의 손상이 적으며, 용이하게 실시할 수 있다는 점에서 온도를 올린 알칼리 또는 산에 담체를 침지하여 표면에 카르복실기를 생성시키는 것이 바람직하다. 구체적인 예로서는, 수산화나트륨이나 황산 수용액(바람직한 농도는 1 N 내지 20 N)에 담체를 침지하고, 바람직하게는 30 ℃ 내지 80 ℃의 온도에서 1 시간 내지 100 시간의 사이를 유지할 수 있다.

상기 방법에서, 카르복실기가 담체의 표면에 생성되었는지 어떤지는, XPS(X 선 광전자 분광법)으로써 확인할 수 있다. 구체적으로는, 불소를 포함하는 표지화 시약(예를 들면 트리플루오로에탄올)을 이용하여 카르복실기를 불소로 표지화한다. 또한, 표지화 후의 시료에서의 C1s, F1s 피크 면적 강도에 반응률을 고려하여 관능기량을 추정하는 것이 가능하다. 또한, 정밀도를 올리기 위해서는, 트리플루오로에탄올로 표지화된 시료 표면의 불소 분포를 TOF-SIMS(비행 시간형 이차 이온 질량 분석법)으로 관찰함으로써, 카르복실기가 담체의 표면에 생성되어 있는지 어떤지를 확인할 수 있다.

이와 같이 카르복실기를 담체의 표면에 생성하면, 이것을 발판으로 담체측을 비오틴 또는 아비딘 수식하고, 선택 결합성 물질을 아비딘 또는 비오틴 수식하여, 아비딘ㆍ비오틴 상호 작용으로써 선택 결합성 물질을 담체에 고정화하는 방법이나, 담체측을 에틸렌 디아민 등의 링커와 반응시키고, 또한 이 링커와 선택 결합성 물질을 반응시켜 고정화하는 것도 생각된다. 그러나, 이들 방법에서는, 2 단계의 반응을 행하기 때문에, 반응 수율의 관계로부터, 담체에 고정화할 수 있는 선택 결합성 물질이 적어지는 경향이 있다. 따라서, 담체의 카르복실기와 선택 결합성 물질과의 관능기를 직접 반응시켜, 선택 결합성 물질을 고정화하는 것이 바람직하다. 즉, 담체 표면의 카르복실기와 선택 결합성 물질의 아미노기나 수산기를 공유 결합에 의해 고정화하는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 이들 결합의 반응을 조장하기 위해서, 디시클로헥실카르보디이미드, N-에틸-5-페닐이소옥사졸륨-3'-술포네이트 등의 다양한 축합제가 이용되고 있다. 이들 중에서도, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)는 독성이 적고, 반응계에서의 제거가 비교적 용이하기 때문에, 선택 결합성 물질과 담체 표면의 카르복실기와의 축합 반응에는 가장 효과적인 축합제 중 하나이다. 그 밖에, 유망한 축합제로서는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸-모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)가 있다. 이들 EDC 등의 축합제는, 선택 결합성 물질의 용액와 함께 사용할 수도 있고, 카르복실기가 표면에 생성된 담체를 미리 EDC의 용액에 침지해 두어, 표면의 카르복실기를 활성화시켜 둘 수도 있다.

이러한 축합제를 이용하여, 담체 표면의 카르복실기와 선택 결합성 물질의 아미노기를 반응시킨 경우에는, 아미드 결합에 의해 담체 표면과 선택 결합성 물질이 고정화되고, 담체 표면의 카르복실기와 선택 결합성 물질의 수산기를 반응시킨 경우에는, 에스테르 결합에 의해 담체 표면과 선택 결합성 물질이 고정화된다. 선택 결합성 물질을 포함하는 시료를 담체에 작용시킬 때의 온도는, 5 ℃ 내지 95 ℃가 바람직하고, 15 ℃ 내지 65 ℃가 더욱 바람직하다. 처리 시간은 통상 5 분 내지 24 시간이고, 1 시간 이상이 바람직하다. 또한, 선택 결합성 물질을 고정화하기 위한 구성을 도 1에 나타낸다. (도 1 중의 1은 PMMA 기판을 나타내고, 2는 선택 결합성 물질(DNA)를 나타낸다.)

상술한 방법에 의해, 중합체 표면에 선택 결합성 물질을 고정화함으로써, 스폿 부분 이외에는, 전하가 마이너스인 카르복실기가 존재하고 있기 때문에, 검체(대표적인 DNA)의 비특이적인 흡착을 억제하고, 또한 공유 결합으로 강고하면서, 또한 고밀도로 선택 결합성 물질을 고정화할 수 있으며, 유리에 비해, 고정화된 선택 결합성 물질의 공간적인 자유도가 높다는 추정 이유 때문에, 검체와의 하이브리다이제이션 효율이 높은 담체를 얻을 수 있다. 공간적인 자유도가 높은 이점은, 특히 고정화되어 있는 선택 결합성 물질이 올리고 DNA라고 불리는 염기 길이가 10 염기 내지 100 염기인 DNA와 타겟인 경우에, 검체와의 하이브리다이제이션 효율이 매우 향상된다는 우수한 특성을 제공한다.

그런데, 화학식 1로 나타내지는 것과 같은 구조 단위를 포함하는 중합체로 담체를 제조하는 경우, 유리, 세라믹, 금속 등과 비교하여, 사출 성형 방법이나 핫 엠보스법 등을 이용함으로써, 미세한 형상을 설치한 담체를 보다 간단하게 대량 생 산하는 것이 가능하다. 따라서, 선택 결합성 물질이 고정화되는 담체의 형상에 대하여 서술한다. 본 발명의 선택 결합성 물질이 고정화되는 담체에는 요철부가 있고, 볼록부 상면에 선택성 적합 물질이 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 구조를 취함으로써, 검출시, 후술하는 바와 같이 비특이적으로 흡착된 검체를 검출하지 않기 때문에, 노이즈가 작고, 결과적으로 보다 S/N이 양호한 선택 결합성 물질이 고정화된 담체를 제공할 수 있다. 또한, 요철부의 복수의 볼록부의 높이에 대해서는, 볼록부 상면의 높이가 거의 동일한 것이 바람직하다. 여기서, 높이가 거의 동일하다는 것은, 다소 높이가 다른 볼록부의 표면에 선택 결합성 물질을 고정화하고, 이것과 형광 표지한 피검체를 반응시키며, 또한 스캐너로 스캔하였을 때, 그 신호 수준의 강도차가 문제가 되지 않는 높이를 말한다. 구체적으로 높이가 거의 동일하다는 것은, 높이의 차가 100 ㎛보다 작은 것을 말한다. 또한, 본 발명의 담체에는, 평탄부가 설치되어 있는 것이 바람직하다. 구체예를 도 2, 도 3에 나타낸다. 11이 평탄부이고, 12로 나타내지는 요철부의 볼록부 상면에 선택 결합성 물질(예를 들면 핵산)이 고정화되어 있다. 또한, 상기 요철부의 볼록 부분의 상면이 실질적으로 평탄한 것이 바람직하다. 여기서 볼록부 상면이 실질적으로 평탄하다는 것은, 50 ㎛ 이상의 요철이 없는 것을 의미한다. 또한, 요철부의 볼록부의 상면 높이와 평탄 부분의 높이가 거의 동일하다. 여기서, 평탄부와 요철부와의 높이가 거의 동일하다는 것은, 스캐너로 스캔하였을 때, 그 신호 수준의 저하 상태가 문제되지 않는 높이를 말한다. 구체적으로 높이의 차가 거의 동일하다는 것은, 요철부 볼록부 상면의 높이와 평탄부의 높이차가 100 ㎛보다 작은 것을 말한다.

즉, 일반적으로 마이크로어레이는, 형광 표지화된 검체와 담체에 고정화된 선택 결합성 물질을 반응시키고, 스캐너라고 불리는 장치에서 형광을 판독하는 것이 일반적이다. 스캐너는 여기광인 레이저광을 대물 렌즈로 모아서 레이저광을 집광한다. 이 집광된 빛을 마이크로어레이의 표면에 조사하여, 레이저광의 촛점을 마이크로어레이 표면에 맞춘다. 또한, 이 조건 그대로 대물 렌즈 또는 마이크로어레이 자체를 주사함으로써 마이크로어레이로부터 발생하는 형광을 판독하는 것과 같은 구조로 되어 있다.

이렇게, 스캐너를 이용하여 본 발명의 볼록부 상면에 선택 결합성 물질을 고정화한 담체를 스캔하면, 요철부의 오목부에 비특이적으로 흡착된 검체 DNA의 형광(노이즈)를 검출하기 어렵다는 효과를 발휘한다. 이 이유는, 볼록부 상면에 레이저광의 촛점이 맞혀져 있기 때문에, 오목부에서는 레이저광이 디포커스되기 때문이다. 반대로 말하면, 선택 결합성 물질이 고정화된 복수의 볼록부 중, 가장 높은 볼록부 상면의 높이와, 가장 낮은 볼록부 상면의 높이차가 50 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 왜냐하면, 볼록부 상면의 높이에 이 이상의 변동이 있으면, 스캐너의 촛점 심도의 관계로 정확한 형광 강도를 측정할 수 없는 경우가 발생할 수 있기 때문이다.

또한, 선택 결합성 물질이 고정화된 복수의 볼록부 중, 가장 높은 볼록부 상면의 높이와 가장 낮은 볼록부 상면의 높이차는 50 ㎛ 이하이면 좋지만, 30 ㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 높이가 동일하면 더욱 바람직하다. 또한, 본원에서 말하는 동일한 높이란, 생산 등에서 발생하는 변동에 의한 오차도 포함하는 것으로 한다.

또한, 선택 결합성 물질이 고정화된 복수의 볼록부란, 데이터로서 필요한 선택 결합성 물질(예를 들면 핵산)이 고정화된 부분을 말하는 것이고, 단지 단순하게 더미(dummy)의 선택 결합성 물질을 고정화한 부분은 제외한다.

또한, 일반적으로 스캐너의 촛점을 조정하는 방법은 이하와 같다. 즉, 스캐너가 마이크로어레이의 표면에 여기광의 촛점을 맞출 때는, 마이크로어레이의 코너에서 여기광의 촛점을 맞추거나, 도 4에 나타낸 바와 같이, 치구에 마이크로어레이를 부딪히게 하여, 레이저광의 촛점을 마이크로어레이 표면에 맞춘다. 또한, 그 조건 그대로 마이크로어레이 전체를 스캔한다. (도 4 중의 13은 마이크로어레이, 14는 대물 렌즈, 15는 여기광, 16은 마이크로어레이를 치구에 부딪히게 하기 위한 스프링을 나타냄). 따라서, 본 발명의 담체에는, 특히 요철부와 평탄부가 설치되어 있는 것이 바람직하다. 구체예를 도 2, 도 3에 나타낸다. 11이 평탄부이고, 12로 나타내지는 요철부의 볼록부 상면에 선택 결합성 물질(예를 들면 핵산)이 고정화되어 있다. 또한, 요철부의 볼록부 상면의 높이와 평탄 부분의 높이차가 50 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 두면, 선택 결합성 물질이 고정화된 담체를 스캔하는 경우에는, 일단 평탄부의 상면에서 여기광의 촛점을 맞추거나, 평탄부를 치구에 부딪히게 하는 것이 가능하다. 즉, 스캐너의 촛점 맞추기가 용이해진다. 이와 같이 하여, 평탄부에서 여기광의 촛점을 맞추기 때문에, 선택 결합성 물질이 고정화된 볼록부의 상면은 평탄하며, 볼록부 상면의 높이와 평탄부의 높이차가 50 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.

볼록부 상면의 높이와 평탄부의 높이차가 50 ㎛보다 크면, 이하와 같은 문제점이 생기는 경우가 있다. 즉, 여기광의 촛점은 평탄부의 상면에서 조정되기 때문에, 볼록부 상면의 높이가 다르면, 볼록부 상면에서의 여기광의 촛점이 희미해지고, 최악의 경우, 선택 결합성 물질과 검체가 반응한 것에 의한 형광이 전혀 검출되지 않는 경우가 발생할 수 있다. 동일한 것은, 볼록부 상면과 높이가 동일한 평탄부가 설치되어 있지 않는 경우에도 발생할 수 있다.

또한, 볼록부의 상면이 평탄하지 않은 경우, 볼록부 상면에서의 여기광의 촛점 크기에 변동이 생겨, 결과적으로 1개의 볼록부 상면 내에서 검출된 형광의 강도에 불균일이 발생한다. 이렇게 되면, 후의 해석이 곤란해진다. 본원의 경우에는, 상기와 같은 문제는 일어나지 않아, 양호한 시그널(형광)을 얻는 것이 가능하다.

또한, 볼록부 상면의 높이와 평탄 부분의 높이차는 50 ㎛ 이하이면 좋지만, 30 ㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 볼록부 상면의 높이와 평탄 부분의 높이가 동일하면 더욱 바람직하다. 또한, 본원에서 말하는 동일한 높이란, 생산 등에서 발생하는 변동에 의한 오차도 포함하는 것으로 한다.

또한, 본 발명에서는, 평면상의 담체에 선택 결합성 물질을 점착하는 것이 아니라, 요철 부분의 볼록부 상면에만 선택 결합성 물질을 고정화하고 있다. 따라서, 볼록부 상면 이외의 부분에 비특이적으로 검체 시료가 흡착되어도, 볼록부 상면 이외의 부분에서는, 여기광의 촛점이 희미해지기 때문에, 바라지 않는 비특이적인 흡착을 한 검체 시료로부터의 형광을 검출하는 경우가 없다. 이 때문에, 노이즈가 작아져, 결과적으로 S/N이 양호해진다는 효과를 발휘한다.

이러한 형상의 담체를 제조하기 위해서는, 사출 성형법을 이용하는 것이 생산성을 감안하면 바람직하다. 상기와 같은 형상의 담체를 사출 성형법에 의해 제조하기 위해서는, 형(型)이 필요한데, 이 형의 제조 방법으로서는, LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung) 공정으로 형을 제조하면, 성형 후의 담체의 이형이 용이한 형 제조가 가능하기 때문에 바람직하다.

또한, 볼록부의 상면의 면적은 거의 동일한 것이 바람직하다. 이와 같이 함으로써, 다종의 선택 결합성 물질이 고정화되는 부분의 면적을 동일하게 할 수 있기 때문에, 후의 해석에 유리하다. 여기서, 볼록부 상부의 면적이 거의 동일하다는 것은, 볼록부 중에서 가장 큰 상면 면적을, 가장 작은 상면 면적으로 나눈 값이 1.2 이하인 말한다.

볼록부의 상면 면적은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 선택 결합성 물질의 양을 적게 할 수 있는 점과 취급성이 용이한 점에서, 4 mm² 이하 10 ㎛² 이상이 바람직하다.

요철부에서의 볼록부의 높이로서는, 0.01 mm 이상 1 mm 이하가 바람직하다. 볼록부의 높이가 이보다 낮으면, 스폿 이외의 부분의 비특이적으로 흡착된 검체 시료를 검출하는 경우가 있고, 결과적으로 S/N이 나빠지는 경우가 있다. 또한, 볼록부의 높이가 1 mm 이상이면, 볼록부가 꺾여 파손되기 쉬운 등의 문제가 생기는 경우가 있다.

또한, 적어도 볼록부의 측면에 도전성 재료가 설치되어 있는 것이 바람직하 다. 이렇게 하면, 예를 들면 대항 전극을 설치하고, 대항 전극과 이 도전성 재료 사이에 전류, 전압을 인가함으로써 핵산의 경우이면 하이브리다이제이션의 고속화가 가능해진다. 도전성 재료가 코팅되는 바람직한 영역으로서는, 오목부의 전부, 볼록부의 측면 전부이다. 그 예를 도 5에 나타낸다. (도 5 중의 21은 볼록부 상면, 22는 도전성 막, 23은 절연막을 나타냄). 인가하는 전압의 범위로서는, 전류가 흐르는 경우에는, 0.01 V 이상 2 V 이하의 범위가 바람직하다. 특히 바람직한 범위는 0.1 V 이상 1.5 V 이하이다. 이보다 큰 전압을 인가하면 물이 전기 분해를 일으켜, 표면의 선택 결합성 물질에 악영향을 미치는 경우가 있다. 도전성 재료의 재질로서는 특별히 한정되지 않지만, 탄소, 마그네슘, 알루미늄, 실리콘, 티탄, 바나듐, 크롬, 망간, 철, 코발트, 니켈, 구리, 주석, 지르코늄, 니오븀, 몰리브덴, 팔라듐, 은, 하프늄, 탄탈, 텅스텐, 백금, 금, 스테인레스나 이들 혼합물, 또는 도전성 중합체를 들 수 있다. 이 중에서도, 백금, 금, 티탄이 특히 바람직하게 이용된다. 이들 도전성 재료의 막 제조 방법으로서는, 증착, 스퍼터링, CVD, 도금 등을 들 수 있다.

상기와 같이 볼록부에 도전성 재료를 코팅한 경우에는, 볼록부의 상면 이외에는 절연 재료층을 더 설치하는 것이 바람직하다. 절연 재료층이 있으면, 전류를 흘린 경우 볼록부의 상면으로만 피검체를 가까이 당기는 것이 가능하다. 절연 재료의 재료로서는, 금속의 산화물(예를 들면, Al-O, SiO₂, TiO₂, VO, SnO, Cr -O, Zn-O, GeO₂, Ta₂O₅, ZrO₂, Nb-O, Y₂O₃ 등), 질화물(Al-N, Si₃N₄, TiN, Ta-N, Ge-N, Zr-N, NbN 등), 황화물(ZnS, PbS, SnS, CuS), 절연성 중합체를 들 수 있다.

상술한 방법에 의해 얻어진 선택 결합성 물질 고정화 담체는 선택 결합성 물질을 고정한 후, 적당한 처리를 할 수 있다. 예를 들면, 열 처리, 알칼리 처리, 계면 활성제 처리 등을 행함으로써, 고정된 선택 결합성 물질을 변성시킬 수도 있다.

또한, 선택 결합성 물질 고정화 담체는, 형광 표지화된 검체와 담체에 고정화된 선택 결합성 물질을 하이브리다이제이션 반응시켜, 스캐너라고 불리는 장치에서 형광을 판독하는 것이 일반적이다. 스캐너는 여기광인 레이저광을 대물 렌즈로 모아 레이저광을 집광한다. 그러나, 담체의 표면으로부터 자가 형광이 생기는 경우, 그 발광이 노이즈가 되어 검출 정밀도의 저하로 연결되는 경우가 있다. 이것을 막기 위해서 화학식 1의 구조 단위를 갖는 중합체에 흑색을 나타내며, 레이저 조사에 의해 발광을 일으키지 않는 물질을 함유시켜 표면을 흑색으로 만듦으로써, 담체 자체로부터의 자가 형광을 저감시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 이러한 담체를 이용함으로써, 검출시, 담체로부터의 자가 형광을 저감시킬 수 있기 때문에 보다 노이즈가 작고, 결과적으로 S/N비가 양호한 선택 결합성 물질이 고정화된 담체를 제공할 수 있다.

여기서, 담체가 흑색이라는 것은, 가시광(파장이 400 nm 내지 800 nm) 범위에서 담체의 흑색 부분의 분광 반사율이 특정 스펙트럼 패턴(특정 피크 등)을 갖지 않으며 한결같이 낮은 값이고, 담체의 흑색 부분의 분광 투과율도 특정 스펙트럼 패턴을 갖지 않으며 한결같이 낮은 값인 것을 말한다.

이 분광 반사율, 분광 투과율의 값으로서는, 가시광(파장이 400 nm 내지 800 nm) 범위의 분광 반사율이 7 ％ 이하이고, 동파장 범위에서의 분광 투과율이 2 ％ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 여기서 말하는 분광 반사율은 JIS Z 8722 조건 C에 적합한, 조명ㆍ수광 광학계에서 담체로부터의 정(正)반사광을 수신한 경우의 분광 반사율을 말한다.

흑색으로 만드는 수단으로서는, 담체에 흑색 물질을 함유시킴으로써 달성할 수 있지만, 이 흑색 물질의 바람직한 것을 들면, 카본 블랙, 흑연, 티탄 블랙, 아닐린 블랙, Ru, Mn, Ni, Cr, Fe, Co 및 Cu의 산화물, Si, Ti, Ta, Zr 및 Cr의 탄화물 등의 흑색 물질을 사용할 수 있다.

이들 흑색 물질은 단독으로 함유시킬 뿐 아니라, 2종류 이상을 혼합하여 함유시킬 수도 있다. 이 중의 흑색 물질 중에서도, 카본 블랙, 흑연, 티탄 블랙을 바람직하게 함유시킬 수 있고, 중합체에 한결같이 분산되기 쉽기 때문에 특히 카본 블랙을 바람직하게 사용할 수 있다.

또한, 담체의 형상으로서 유리, 금속 등의 열 변형되기 어려운 재료를 포함하는 지지체층 위에, 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 1개 이상 갖는 중합체를 포함하는 선택 결합성 물질 고정화층을 설치하면, 열이나 외력에 의한 담체의 형상 변화를 막을 수 있기 때문에 바람직하다. 그 밖의 지지체층으로서는, 폴리카르보네이트, 폴리이미드, 폴리아미드 등의 비교적 고온에 견딜 수 있는 수지 등을 사용할 수도 있다. 이 개념도를 도 6에 나타낸다. (2는 선택 결합성 물질(DNA), 3은 지지체층(유리), 4는 선택 결합성 물질 고정화층(PMMA)을 나타냄) 지지체층으로서 는, 유리나, 철, 크롬, 니켈, 티탄, 스테인레스 등의 금속이 바람직하다. 또한, 이 지지체층과 선택 결합성 물질 고정화층과의 밀착성을 양호하게 하기 위해서, 지지체층의 표면을, 아르곤, 산소, 질소 가스에 의한 플라즈마 처리나 실란 커플링제에 의한 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 실란 커플링제로서는 3-아미노프로필트리에톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필디에톡시메틸실란, 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란, 3-(2-아미노에틸아미노프로필)디메톡시메틸실란, 3-머캅토프로필트리메톡시실란, 디메톡시-3-머캅토프로필메틸실란 등을 들 수 있다. 지지체층 위에 선택 결합성 물질 고정화층을 설치하는 수단으로서는, 중합체를 유기 용매에 용해시키고, 스핀 코팅이나 디핑 등의 공지된 수단을 사용할 수 있다. 보다 간단하게는, 지지체층에 접착제로 접착할 수도 있다.

여기서, 「선택 결합성 물질」이란, 피검 물질과 직접적 또는 간접적으로, 선택적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하고, 대표적인 예로서, 핵산, 단백질, 당류 및 다른 항원성 화합물을 들 수 있다. 핵산은 DNA나 RNA일 수도 PNA일 수도 있다. 특정 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산은, 상기 염기 서열 또는 그의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산과 선택적으로 하이브리다이징하여 결합하기 때문에, 본 발명에서 말하는 「선택 결합성 물질」에 해당한다. 또한, 단백질로서는, 항체 및 Fab 프래그먼트나 F(ab')2 프래그먼트와 같은, 항체의 항원 결합성 단편, 및 각종 항원을 들 수 있다. 항체나 그의 항원 결합성 단편은, 대응하는 항원과 선택적으로 결합하고, 항원은 대응하는 항체와 선택적으로 결합하기 때문에, 「 선택 결합성 물질」에 해당한다. 당류로서는, 다당류가 바람직하고, 각종 항원을 들 수 있다. 또한, 단백질이나 당류 이외의 항원성을 갖는 물질을 고정화할 수도 있다. 본 발명에서 사용되는 선택 결합성 물질은 시판되는 것일 수도 있고, 또한 생세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 「선택 결합성 물질」로서, 특히 바람직한 것은 핵산이다. 이 핵산 중에서도, 올리고 핵산이라고 불리는, 길이가 10 염기 내지 100 염기까지인 핵산은, 합성기에서 쉽게 인공적으로 합성이 가능하고, 또한 핵산 말단의 아미노기 수식이 용이하기 때문에, 담체의 표면에의 고정화가 용이해지므로 바람직하다. 또한, 20 염기 미만이면 하이브리다이제이션의 안정성이 낮다는 관점에서 20 내지 100 염기가 보다 바람직하다. 하이브리다이제이션의 안정성을 유지하기 위해서, 특히 바람직하게는 40 내지 100 염기의 범위이다.

본 발명의 담체를 이용한 측정 방법에 사용되는 피검 물질로서는, 측정해야할 핵산, 예를 들면 병원균이나 바이러스 등의 유전자나, 유전병의 원인 유전자 등 및 그의 일부분, 항원성을 갖는 각종 생체 성분, 병원균이나 바이러스 등에 대한 항체 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 이들 피검 물질을 포함하는 검체로서는, 혈액, 혈청, 혈장, 오줌, 변, 수액, 타액, 각종 조직액 등의 체액이나, 각종 음식물 및 이들의 희석물 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 또한, 피검 물질이 되는 핵산은, 혈액이나 세포로부터 통상법에 의해 추출한 핵산을 표지할 수도 있고, 상기 핵산을 주형으로 하여, PCR 등의 핵산 증폭법에 의해서 증폭시킨 것일 수도 있다. 후자의 경우에는, 측정 감도를 대폭 향상시키는 것이 가능하다. 핵산 증폭 산물을 피검 물질로 하는 경우에는, 형광 물질 등으로 표지한 뉴클레오티드 삼인산의 존재하에서 증폭을 행함으로써, 증폭 핵산을 표지하는 것이 가능하다. 또한, 피검 물질이 항원 또는 항체인 경우에는, 피검 물질인 항원이나 항체를 통상법에 의해 직접 표지할 수도 있고, 피검 물질인 항원 또는 항체를 선택 결합성 물질과 결합시킨 후, 담체를 세정하고, 상기 항원 또는 항체와 항원 항체 반응하는 표지한 항체 또는 항원을 반응시켜, 담체에 결합한 표지를 측정할 수도 있다.

고정화 물질과 피검 물질을 상호 작용시키는 공정은, 종래와 완전히 동일하게 행할 수 있다. 반응 온도 및 시간은, 하이브리다이징시키는 핵산의 쇄 길이나, 면역 반응에 관여하는 항원 및(또는) 항체의 종류 등에 따라서 적절하게 선택되지만, 핵산의 하이브리다이제이션의 경우, 통상 50 ℃ 내지 70 ℃ 정도에서 1 분간 내지 수십 시간, 면역 반응의 경우에는, 통상 실온 내지 40 ℃ 정도에서 1 분간 내지 수 시간 정도이다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예로 한정되지 않는다.

참고예 1

투명한 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 판((주)쿠라레 제조; 코모글래스 압출 판, 두께 1 mm, 평균 분자량 15만, 즉 수평균 중합도 1500)을 에탄올과 순수한 물로 충분히 세정한 후, 10 N의 수산화나트륨 수용액에 70 ℃에서 12 시간 침지하였다. 다음으로, 순수한 물, 0.1 N HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하였다. 이 알칼리 처리를 실시한 판과, 알칼리 처리를 실시하지 않은 판을 시료로 하고, 불소를 포함하는 표지화 시약(트리플루오로에탄올)을 이용하여 기상 상태에서 시료 표면의 카르복실기를 표지화하였다. 또한, 단색화된 Al Kα1, 2선(1486.6 eV)을 이용하여, X선 직경 1 mm, 광전자 탈출각 90°의 조건에서 XPS 측정을 행하고, C1s, F1s 피크 면적 강도에 반응률을 고려하여 카르복실기를 추정하였다. 그 결과, 카르복실기량은, 알칼리 미처리 시료의 경우 0.0013(전체 탄소량 중의 카르복실기 탄소의 비율), 알칼리 처리를 행한 시료의 경우 0.0015이며, 표면의 카르복실기량이 많아진 것이 확인되었다.

또한, 상기 2개의 트리플루오로에탄올에 의해 표면의 카르복실기를 표지화한 시료 표면의 불소량과 분포를 TOF-SIMS(비행 시간형 2차 이온 질량 분석)에 의해서 측정한 바, 이하의 결과가 얻어졌다. 즉, 2개의 시료에서 비교하면, 수산화나트륨 처리품에서는 미처리품보다 ¹⁹F^-또는 ⁶⁹CF³ ^-이 강하고, 수산화나트륨 처리품에서는 미처리품보다 카르복실기가 많은 것이 확인되었다. 구체적으로는, 미처리품에서는, F^-에 상당하는 질량수 19의 이온의 카운트수는 8000이었지만, 수산화나트륨 처리품에서는 25000였다. 또한, CF³ ^-에 대응하는 질량수 69의 이온의 카운트수는, 미처리품에서는 1200이었지만, 수산화나트륨 처리품에서는 7000이었다. 또한, TOF-SIMS에 의해 두 시료 표면의 불소 분포를 2차원적으로 측정한 바, 수산화나트륨 처리품에서는 ¹⁹F^-의 이온상으로 국재한 분포를 볼 수 있었다(30 ㎛ 내지 40 ㎛φ의 원형이나, 30 ㎛ 내지 40 ㎛폭의 근상(筋狀)으로 이온 강도가 약한 영역을 볼 수 있었음). 상기 결과로부터, 알칼리 처리를 행한 샘플에서는, 표면의 카르복실기가 국재한 분포를 갖는 것이 추정된다. 한편, 미처리품에 있어서는, ¹⁹F^-의 이온상으로 특별히 국재한 분포는 확인되지 않았다. 한편, 메톡시기에 의한 것으로 생각되는 ³¹CH₃O^-의 이온상으로는 2개의 시료 모두 국재한 분포는 특별히 확인되지 않았다.

실시예 1

(DNA 고정화 담체의 제조)

투명한 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 판((주)쿠라레 제조; 코모글래스 압출 판, 두께 1 mm, 평균 분자량 15만, 즉 수평균 중합도 1500)을 10 N의 수산화나트륨 수용액에 65 ℃에서 12 시간 침지하였다. 다음으로, 순수한 물, 0.1 N HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하였다. 이와 같이 하여, 판 표면의 PMMA의 측쇄를 가수 분해하여 카르복실기를 생성하였다. 또한, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 측정하였을 때, 이 판(알칼리 무처리)의 자가 형광 강도는 650이었다.

(프로브 DNA의 고정화)

서열 1(70 염기, 5' 말단 아미노화), 서열 2(60 염기, 5' 말단 아미노화), 서열 3(40 염기, 5' 말단 아미노화), 서열 4(20 염기, 5' 말단 아미노화)의 DNA를 합성하였다. 이들 서열 1 내지 4의 DNA는 5' 말단이 아미노화되어 있다.

이들 DNA를 순수한 물에 0.27 nmo/㎕의 농도로 용해시켜 스톡 솔루션으로 하였다. 기판에 점착할 때는, PBS(NaCl를 8 g, Na₂HPO₄ㆍ12H₂O를 2.9 g, KCl를 0.2 g, KH₂PO₄를 0.2 g 순수한 물에 용해시켜 1 ℓ로 메스업한 것에 pH 조정용 염산을 첨가한 것, pH 5.5)로 프로브의 종료 농도를 0.027 nmol/㎕로 하고, 또한 담체 표면의 카르복실기와 프로브 DNA 말단의 아미노기를 축합시키기 위해서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 첨가하여, 이 종료 농도를 50 mg/㎖로 하였다. 또한, 이들 혼합 용액을 약 200 nl 취하여, 이것을 기판에 점착하였다. 즉, 4종류의 프로브를 PMMA 기판상에 각각 1 개소 점착하였다. 다음으로, 기판을 밀폐된 플라스틱 용기에 넣고, 37 ℃, 습도 100 ％의 조건에서 20 시간 정도 인큐베이션하여 순수한 물로 세정하였다. 이 반응 구성을 도 1에 나타내었다.

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서, 상기 DNA 고정화 기판과 하이브리다이징 가능한 염기 서열을 갖는 서열 8의 DNA(968 염기)를 이용하였다. 제조 방법을 이하에 나타내었다.

서열 5와 서열 6의 DNA를 합성하였다. 이것을 순수한 물에 용해시켜 농도를 100 μM로 하였다. 다음으로, pKF3 플라스미드 DNA (다카라 바이오(주) 제품 번호; 3100)(서열 7: 2264 염기)를 준비하여, 이것을 템플릿으로 하고, 서열 5 및 서열 6의 DNA를 프라이머로 하여, PCR 반응(Polymerase Chain Reaction)에 의해 증폭시켰다.

PCR의 조건은 이하와 같았다. 즉, ExTaq 2 ㎕, 10×ExBuffer 40 ㎕, dNTP Mix 32 ㎕(이상은 다카라 바이오(주) 제조 제품 번호 RR001A에 부속), 서열 5의 용액을 2 ㎕, 서열 6의 용액을 2 ㎕, 템플릿(서열 7)을 0.2 ㎕ 첨가하고, 순수한 물에 의해 총 400 ㎕로 메스업하였다. 이들 혼합액을 4개의 마이크로튜브에 나누고, 서멀 사이클러를 이용하여 PCR 반응을 행하였다. 이것을 에탄올 침전에 의해 정제하고, 40 ㎕의 순수한 물에 용해시켰다. PCR 반응 후의 용액의 일부를 취하여 전기 영동으로 확인한 바, 증폭된 DNA의 염기 길이는 약 960 염기이며 서열8(968염기)이 증폭된 것을 확인하였다.

계속해서, 9 염기의 랜덤 프라이머(다카라 바이오(주) 제조; 제품 번호 3802)를 6 mg/㎖의 농도에 용해시키고, 상기 PCR 반응 후 정제한 DNA 용액에 2 ㎕ 첨가하였다. 이 용액을 100 ℃로 가열한 후, 얼음 위에서 급냉시켰다. 이들에 클레노우(Klenow) 프래그먼트(다카라 바이오(주) 제조; 제품 번호 2140AK) 부속의 완충액을 5 ㎕, dNTP 혼합물(dATP, dTTP, dGTP의 농도는 각각 2.5 mM, dCTP의 농도는 400 μM)을 2.5 ㎕ 첨가하였다. 또한, Cy3-dCTP (아마샴 파마시아 바이오텍 제조; 제품 번호 PA53021) 를 2 ㎕ 첨가하였다. 이 용액에 10 U의 클레노우 프래그먼트를 첨가하고, 37 ℃에서 20 시간 인큐베이션하여 Cy3로 표지된 검체 DNA를 얻었다. 또한, 표지시에 랜덤 프라이머를 이용하였기 때문에 검체 DNA의 길이에는, 변동이 있다. 가장 긴 검체 DNA는 서열 8(968 염기)이 된다. 또한, 검체 DNA의 용액을 취하여 전기 영동으로 확인한 바, 960 염기에 상당하는 부근에 가장 강한 밴드가 나타났고, 그보다 짧은 염기 길이에 대응하는 영역에 얇게 스미어(smear)된 상태였다. 또한, 이것을 에탄올 침전에 의해 정제하여 건조시켰다.

이 표지화된 검체 DNA를, 1 중량 체적％ BSA(소혈청 알부민), 5×SSC(5×SSC란 NaCl를 43.8 g, 시트르산 삼나트륨 수화물 22.1 g을 순수한 물에 용해시키고, 1 ℓ로 메스업한 것. 또한 NaCl를 43.8 g, 시트르산 삼나트륨 수화물 22.1 g을 순수한 물에 용해시키고, 5 l로 메스업한 것을 1×SSC라 표기하며, 이것의 10배 농축액을 10×SSC, 5배 희석액을 0.2×SSC라 표기함), 0.1 중량 체적％ SDS (도데실 황산나트륨), 0.01 중량 체적％ 연어 정자 DNA의 용액(각 농도는 모두 종료 농도), 400 ㎕에 용해시켜 하이브리다이제이션용 용액으로 하였다.

(하이브리다이제이션)

상기에서 얻어진 프로브 DNA를 고정화한 기판에 상기 검체 DNA를 하이브리다이제이션시켰다. 구체적으로는, 먼저 준비한 프로브 핵산이 고정화되어 있는 담체에 하이브리다이제이션용 용액을 10 ㎕ 적하하고, 그 위에 커버 유리를 덮었다. 또한, 커버 유리의 주위를 페이퍼 본드로 밀봉하여 하이브리다이제이션 용액이 건조되지 않도록 하였다. 이것을 플라스틱 용기 중에 넣고, 65 ℃, 습도 100 ％의 조건에서 10 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 커버 유리를 떼어낸 후에 세정, 건조시켰다.

(측정)

하이브리다이제이션의 유무를 검출하기 위해서, 하이브리다이제이션 후의 기판상의 형광을 형광 현미경(올림푸스 광학)에 의해 관찰하였다. 모든 프로브 부분에서 하이브리다이제이션을 나타내는 형광 발광이 관찰되었다. 또한, 염기수가 40, 60, 70으로 증가함에 따라서 스폿상의 형광과 백그라운드의 차가 커졌다. 즉, 프로브의 염기수가 길어짐에 따라서, S/N비가 향상되었다.

계속해서, 정량적인 논의을 행하기 위해서, DNA 칩용의 스캐너(액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B)에 상기 처리 후의 담체를 셋팅하고, 레이저 출력 33 ％, 포토멀티플레이어의 게인을 500으로 한 상태에서 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 여기서, 형광 강도란 스폿 내의 형광 강도의 평균값이고, 노이즈란 스폿 주위(DNA가 점착되어 있지 않은 부분)의 형광 강도의 평균값으로 하였다.

비교예 1

실시예 1과 같은 기판이 PMMA가 아니라, 유리인 경우의 실험을 행하였다.

슬라이드 유리를 10 N NaOH 수용액에 1 시간 침지한 후, 순수한 물로 충분히 세정하였다. 이어서, APS(3-아미노프로필 트리에톡시실란; 신에츠 가가꾸 고교(주) 제조)를 2 중량 체적％의 비율로 순수한 물에 용해시킨 후, 상기 슬라이드 유리를 1 시간 침지시키고, 이 용액으로부터 꺼낸 후에 110 ℃에서 10 분간 건조시켰다. 이와 같이 하여, 유리 표면에 아미노기를 도입하였다.

이어서, 5.5 g의 무수 숙신산을 1-메틸-2-피롤리돈 335 ㎖에 용해시켰다. 1 M의 50 ㎖의 붕산나트륨(붕산 3.09 g과 pH 조정용 수산화나트륨을 첨가하고, 순수한 물로 50 ㎖로 메스업한 것. pH 8.0)에 상기 숙신산 용액에 첨가하였다. 이 혼합액에 상기 유리 기판을 20 분간 침지하였다. 침지 후, 순수한 물로 세정 및 건조시켰다. 이와 같이 하여, 유리 기판의 표면의 아미노기와 무수 숙신산을 반응시켜, 유리 표면에 카르복실기를 도입하였다. 이것을 DNA 고정화용 기판으로서 이용하였다. 또한, 염기 서열 1 내지 4의 DNA를 실시예 1과 동일한 순서로 상기 유리 기판에 고정화하였다. 이 반응 구성을 도 7에 나타내었다(도 7 중, 2는 선택 결합성 물질(DNA), 5는 유리 기판을 나타냄). 또한, 실시예 1과 동일한 순서로 하이브리다이제이션을 행하였다. 이것을, 실시예 1과 동일한 조건에서 형광 현미경으로 관찰하였다.

형광 현미경으로 관찰한 바, 유리 기판에 있어서도 프로브 부분이 40 염기 이상일 때에 발광이 관찰되었다. 그러나, 기판이 PMMA인 경우와 비교하여 비교예의 3개의 유리 기판에서는 형광 강도는 분명히 미약한 것이 관찰되었다. 또한, 정량적인 논의를 행하기 위해서 이들 기판에 있어서의 발광 강도를 스캐너에 의해 측정하였다. 그 결과를 실시예 1과 함께 표 1에 나타내었다. 표 1의 결과로부터 유리 기판에서는 형광이 미약하고, 노이즈도 크며 S/N비가 뒤떨어져 있음을 알 수 있었다.

또한, 그 밖의 시판되는 아미노기가 도입된 슬라이드 유리를 이용하여, 상기와 동일한 구성으로 DNA의 고정화, 하이브리다이제이션까지 행하였다. 이용한 슬라이드 유리는, DNA 마이크로어레이용 코트 슬라이드 유리 고밀도 아미노기 도입 유형(마쯔나미 글래스 고교(주) 제조; 제품 번호 SD00011)과 MAS 코트 슬라이드 유리(마쯔나미 글래스 고교(주) 제조; 제품 번호 S081110)를 이용하였다. 동일하게 측정한 결과, 이들 슬라이드 유리를 이용하여도 기판을 PMMA로 한 경우보다 S/N비가 뒤떨어졌다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

비교예 2

(슬라이드 유리의 제조)

비교예 1과 동일하게, 3-아미노프로필트리에톡시실란을 이용하여 슬라이드 유리의 표면에 아미노기를 도입하였다. 또한, 비교예 1과 동일하게 무수 숙신산을 이용하여, 슬라이드 유리의 표면에 카르복실기를 도입한 후, 아세토니트릴로 세정하고, 1 시간 감압하에서 건조시켰다. 건조 후의, 말단에 카르복실기가 도입된 유리 기판을, EDC(955 mg) 및 N-히드록시숙신이미드(575 mg)의 아세토니트릴(50 ㎖)용액에 2 시간 침지하고, 아세토니트릴로 세정하여 1 시간 감압하에서 건조시켜, N-히드록시숙신이미드가 에스테르 결합으로 표면에 도입되어 있는 유리 기판을 얻었다.

(DNA의 고정화)

실시예 1과 동일한 5' 말단이 아미노화된 DNA를 이용하고, 0.1 M 탄산 완충액(pH 9.3)에 분산시켜 제조된 수성액(DNA의 농도는 0.027 nmol/㎕) 200 nl를 상기에서 얻은 유리 기판에 점착하였다. 즉시, 고정화 후의 유리 기판을 25 ℃, 습도 90 ％에서 1 시간 방치한 후, 이 유리 기판을 0.1 중량 체적％ SDS와 2×SSC와의 혼합 용액으로 2회, 0.2×SSC 수용액으로 1회 차례로 세정하였다. 다음으로, 상기 세정 후의 유리 기판을 0.1 M 글리신 수용액(pH 10) 중에 1 시간 30 분 침지한 후, 증류수로 세정하여 DNA 단편이 고정된 유리 기판을 얻었다.

(검출)

실시예 1의 하이브리다이제이션 실험과 동일한 순서, 및 검체 DNA에서 하이브리다이제이션을 행하였다. 결과를 표 2에 나타내었다. 실시예 1의 기판이 PMMA인 경우와 비교하여 S/N비는 충분하지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2

(DNA 고정화 담체의 제조)

평균 분자량이 15만인 PMMA 중에 3 중량％의 비율로 카본 블랙을 혼합하고, 캐스트법에 의해 두께 1 mm의 흑색 기판을 제조하였다. 이 흑색 PMMA 기판을 10 N의 수산화나트륨 수용액에 65 ℃에서 12 시간 침지하였다. 이것을 순수한 물, 0.1 N의 HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하였다. 또한, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 측정하였을 때, 이 판(알칼리 무처리)의 자가 형광 강도는 250이었다. 실시예 1과 동일한 프로브 DNA를 4종류 이용하여, 동일한 조작 순서로 흑색화된 DNA 고정화 담체를 제조하였다.

별도로 동일한 기판을 제조하고, 이 흑색 기판의 분광 반사율과 분광 투과율을 측정한 바, 분광 반사율은 가시광 영역(파장이 400 nm 내지 800 nm)의 어느 파장에서도 5 ％ 이하이며, 동일한 범위의 파장에서 투과율은 0.5 ％ 이하였다. 분광 반사율, 분광 투과율 모두, 가시광 영역에서 특정한 스펙트럼 패턴(피크 등)은 없고, 스펙트럼은 한결같이 편평하였다. 또한, 분광 반사율은 JIS Z 8722의 조건 C에 적합한 조명ㆍ수광 광학계를 탑재한 장치(미놀타 카메라 제조, CM-2002)를 이용하여, 담체로부터의 정반사광을 수신한 경우의 분광 반사율을 측정하였다.

(검체 DNA의 제조 및 하이브리다이제이션)

실시예 1과 동일한 검체 DNA 제조법 및 하이브리다이제이션법에 의해 행하였다.

(측정)

실시예 1과 동일한 조건에서 스캐너에 의해 형광을 측정하였다. 표 3에 스캐너에 의해 관찰한 결과를 나타내었다. 실시예 1과 동일하게 염기수가 증가함에 따라서 형광 강도가 증가하였다. 또한, 실시예 1의 결과와 비교하여 백그라운드가 감소하였다. 이로부터, 기판을 흑색으로 하면 노이즈가 저감하여, S/N비가 한층 더 향상된 것이 확인되었다.

실시예 3

3-아미노프로필 트리에톡시실란이 표면에 도입된 슬라이드 유리를 비교예 1의 순서로 제조하였다. 이것에, 클로로포름에 용해시킨 PMMA를 스핀 코팅하여 100 ℃에서 15 분간, 115 ℃에서 1 시간 유지하고, 지지체층(유리)/선택 결합성 물질 고정화층(PMMA)을 포함하는 담체를 제조하였다. 또한, 스핀 코팅된 PMMA의 두께는 약 20 ㎛였다.

계속해서, 이 담체를 10 N의 NaOH에 10 시간 침지하고, PMMA의 표면에 카르복실기를 생성하였다. 실시예 1과 동일하게, 프로브 DNA의 고정화, 검체 DNA 제조, 하이브리다이제이션, 형광 강도를 측정하였다. 이 때, 실시예 1과 동일한 결과가 얻어졌다. 또한, 실시예 1에서는, 약간 기판이 휘었지만, 본 실시예의 담체에는, 휘어짐이 보이지 않았다.

또한, 실시예 2에서 이용한, 카본 블랙이 분산된 PMMA를 동일하게 스핀 코팅하여도, 실시예 2와 동일한 형광 강도와 노이즈가 얻어졌고, 이 경우에도 담체의 휘어짐은 보이지 않았다.

실시예 4

PMMA 표면의 카르복실기 생성시, 10 N의 NaOH 수용액을 이용하는 대신에, 10 N의 황산을 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 실험을 행하였다. 그 결과, 실시예 1과 동일한 결과가 얻어졌다.

실시예 5

스티렌과 MMA(메타크릴산메틸)의 공중합체 중합체를 제조하였다. 제조한 중합체 조성은, MMA가 10 몰％, 스티렌이 90 몰％였다. 이 공중합체의 구체적인 제조 방법은, MMA와 스티렌을 1:9(몰비)의 비율로 탈수 톨루엔에 용해시킨 후, AIBN(아조비스이소부틸니트릴)을 MMA와 스티렌을 합한 몰수의 1/1000의 비율로 첨가하고, 질소 분위기하에 60 ℃에서 1 시간, 65 ℃에서 3 시간, 90 ℃에서 20 시간 유지하였다. 또한, 에탄올 침전, 여과에 의해 정제하였다.

정제한 중합체의 조성은 NMR(nuclear magnetic resonance)로써 확인하였다. 또한, 이 중합체의 분자량을 GPC에서 측정하여 수평균 중합도를 산출한 바, 1100이었다.

이어서, 정제한 중합체를 캐스트법으로써, 두께 1 mm 정도의 판상으로 만들었다. 고정화하는 DNA를 서열 2만으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 실험을 행하였다. 또한, 실시예 1과 동일한 조건에서, 스캐너에 의해 형광 측정을 행하였다. 그 결과, 형광 강도는 5200, 노이즈는 150이며, MMA의 함유량이 10 ％이어도, 비교예 1, 비교예 2와 비교하여 S/N비를 향상시킬 수 있었다. 또한, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 알칼리 처리를 미실시한 평판을 측정하였을 때, 이 판의 자가 형광 강도는 750이었다.

비교예 3

폴리스티렌의 단독 중합체를 제조하여, 이것을 캐스트법으로 두께 1 mm 정도의 판상으로 만들었다. 이 판을 이용하여, 실시예 1과 동일하게 실험하였지만, 프로브 DNA와 검체 DNA와의 하이브리다이제이션을 나타내는 형광은 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 6

(DNA 고정화 담체의 제조)

공지된 방법인 LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung) 공정을 이용하여, 사출 성형용의 형을 제조하고, 사출 성형법에 의해 후술하는 것과 같은 형상을 갖는 PMMA제 기판을 얻었다. 또한, 이 실시예에서 이용한 PMMA의 평균 분자량은 15만이고, PMMA 중에는 1 중량％의 비율로 카본 블랙(미츠비시 가가꾸 제조 #3050B)를 함유시켰고, 기판은 흑색이었다. 이 흑색 기판의 분광 반사율과 분광 투과율을 측정한 바, 분광 반사율은 가시광 영역(파장이 400 nm 내지 800 nm)의 어느 파장에서도 5 ％ 이하이며, 동일한 범위의 파장에서 투과율은 0.5 ％이하였다. 분광 반사율, 분광 투과율 모두, 가시광 영역에서 특정한 스펙트럼 패턴(피크등)은 없고, 스펙트럼은 한결같이 편평하였다. 또한, 분광 반사율은 JIS Z 8722의 조건 C에 적합한 조명ㆍ수광 광학계를 탑재한 장치(미놀타 카메라 제조, CM-2002)를 이용하여, 담체로부터의 정반사광을 수신한 경우의 분광 반사율을 측정하였다.

기판의 형상은, 크기가 세로 76 mm, 가로 26 mm, 두께 1 mm이고, 기판의 중앙부를 제외하고 표면은 평탄하였다. 기판의 중앙에는, 직경 10 mm, 깊이 0.2 mm의 오목한 부분이 설치되어 있고, 이 오목부 중에, 최상부의 직경 0.2 mm, 높이 0.2 mm의 볼록부를 64(8×8) 개소 설치하였다. 또한, 볼록부의 최저부(볼록부의 근본)의 직경은 0.23 mm로, 볼록부에 테이퍼를 붙여 사출 성형 후의 기판의 이형이 용이하도록 하였다. 요철 부분의 볼록부 상면의 높이(64 개소의 볼록부의 높이의 평균값)와 평탄 부분과의 높이차를 측정한 바, 3 ㎛ 이하였다. 또한, 64개의 볼록부 상면의 높이의 변동(가장 높은 볼록부 상면의 높이와 가장 낮은 볼록부 상면과의 높이차), 또한 볼록부 상면의 높이의 평균값과 평탄부 상면의 높이차를 측정한 바 각각 3 ㎛ 이하였다. 또한, 요철부 볼록부의 피치(볼록부 중앙부에서 인접한 볼록부 중앙부까지의 거리)는 0.6 mm였다.

상기 PMMA 기판을 10 N의 수산화나트륨 수용액에 65 ℃에서 12 시간 침지하였다. 이것을 순수한 물, 0.1 N의 HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하여, 기판 표면에 카르복실기를 생성하였다. 또한, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 본 실시예에서 이용한 카본 블랙 함유의 PMMA의 평판을, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 측정하였을 때, 이 판의 자가 형광 강도는 250이었다.

(프로브 DNA의 고정화)

또한, 서열 2(60 염기, 5' 말단 아미노화)의 DNA를 합성하였다. 이 DNA는 5' 말단이 아미노화되어 있다. 이 DNA를, 순수한 물에 0.27 nmol/㎕의 농도로 용해시켜 스톡 솔루션으로 하였다. 기판에 점착할 때는, PBS(pH 5.5)로 프로브의 종료 농도를 0.027 nmol/㎕로 하고, 또한 담체 표면의 카르복실기와 프로브 DNA의 말단의 아미노기를 축합시키기 위해서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 첨가하여 이 종료 농도를 50 mg/㎖로 하였다. 또한, 이들 혼합 용액을 유리제 모세관에 취하여, 현미경하에서 이 프로브 DNA를 PMMA 기판의 볼록부상의 4 개소에 점착하였다. 다음으로, 이 기판을 밀폐된 플라스틱 용기에 넣고, 37 ℃, 습도 100 ％의 조건에서 20 시간 정도 인큐베이션한 후 순수한 물로 세정하였다.

(검체 DNA의 제조)

실시예 1과 동일하게 행하였다.

(하이브리다이제이션)

상술한 (검체 DNA의 제조)에서 제조한 DNA 용액을 10 ㎕ 취하고, 이것에 30 ㎕의, 1 중량 체적％ BSA, 5×SSC, 0. 1 중량 체적％ SDS, 0.01 중량 체적％ 연어 정자 DNA의 용액을 첨가하여, 총 40 ㎕로 하였다(즉, 실시예 1 또는 2와 비교하면, 검체의 농도는 1/4이지만, 총 검체량은 실시예 1과 동일해짐). 또한, 이것을 상술한 DNA가 고정화된 담체의 요철 부분에 적하하여, 주의 깊게 커버 유리를 덮었다. 또한, 커버 유리의 주위를 페이퍼 본드로 밀봉하여, 하이브리다이제이션 용액이 건조되지 않도록 하였다. 즉, 검체 DNA의 분자량을 실시예 1 또는 비교예 1과 동일하게 하였다. 이것을 플라스틱 용기 중에 넣고, 습도 100 ％, 65 ℃의 상태에서 10 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 커버 유리를 떼어내어 세정ㆍ건조시켰다.

(측정)

실시예 1과 동일한 조건에서, 스캐너에 의해 형광 측정을 행하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

이로부터, 형광 강도에 대해서는 실시예 2와 거의 동일하였지만, 노이즈에 대해서는 실시예 2보다 더 저하되었다.

실시예 7

다음으로, 볼록부의 높이가 변동된 경우에 대하여 실험을 행하였다. 실시예 6에서 이용한 PMMA의 사출 성형품의 볼록부를 랩핑 페이퍼로 깎아, 볼록부 상면의 높이에 차를 두었다. 즉, 다른 볼록부 상면(기준이 되는 볼록부)보다 30 ㎛ 낮은 볼록부(4 개소)가 있는 담체(담체 가), 다른 볼록부 상면보다 50 ㎛ 낮은 볼록부(4 개소)가 있는 담체(담체 나)를 각각 제조하였다. 또한, 이들 담체가 낮은 부분 이외의 볼록부(기준이 되는 볼록부) 상면의 높이와, 평탄 부분의 높이차는 3 ㎛ 이하였다. 실시예 6과 동일하게, 점착하는 프로브 DNA의 제조를 행하였다. 이어서, 기준이 되는 볼록부 상면에 4 개소, 낮은 볼록부 상면에 4 개소에 프로브 DNA 용액의 점착을 실시예 6과 동일하게 행하였다. 또한, 하이브리다이제이션용 DNA의 제조, 하이브리다이제이션 조작을 실시예 6과 동일하게 행하여, 측정도 실시예 6과 동일하게 행하였다. 기준이 되는 볼록부 상면의 형광 강도의 평균값과 그 주위의 노이즈의 평균값, 높이가 낮은 볼록부 상면의 형광 강도의 평균값과 그 주위의 노이즈의 평균값을 표 5에 나타내었다.

이와 같이, 볼록부의 높이에 변동(50 ㎛ 이하)이 있어도 충분히 큰 S/N이 얻어진 것을 알 수 있었다.

실시예 8

또한, 볼록부 상면과 평탄부의 차가 있는 경우에 대하여 검토하였다. 실시예 6에서 이용한 PMMA의 사출 성형품의 평탄부를 랩핑 페이퍼로 깎아, 평탄부 상면과 볼록부 상면의 높이차가 30 ㎛(담체 다), 50 ㎛(담체 라)인 2종류의 담체를 제조하였다. 즉, 담체 다는 볼록부의 높이가 평탄부의 높이보다 30 ㎛ 높은 것인 것이다. 실시예 6과 동일하게, 점착하는 프로브 DNA의 제조, 볼록부 상면에의 프로브 DNA 용액의 점착, 하이브리다이제이션용 DNA의 제조, 하이브리다이제이션의 조작을 행하여, 실시예 6과 동일하게 측정하였다. 또한, 상면에 DNA 용액을 스폿팅한 볼록부는 각각의 기판에 대하여 4 개소이다. 또한, DNA를 점착한 스폿(4 개소)의 형광 강도와, 그 주위의 노이즈(4 개소)의 평균값을 구하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

이와 같이, 평탄부 상면과 볼록부 상면과의 높이에 차(50 ㎛ 이하)가 있어도, 비교예와 비교하면 충분히 큰 S/N이 얻어진 것을 알 수 있었다.

실시예 9

폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리페닐메타크릴레이트의 평판을 캐스트법으로 제조하고, 이것을 10 N의 수산화나트륨 수용액에 50 ℃에서 10 시간 침지하였다. 다음으로, 순수한 물, 0.1 N HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하였다. 이와 같이 하여, 판 표면의 중합체 측쇄를 가수 분해하여 카르복실기를 생성하였다.

프로브 DNA의 고정화(단, 고정화한 프로브 DNA는 60 염기 길이만임), 검체 DNA의 제조, 하이브리다이제이션, 측정을 실시예 1과 동일하게 행하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

이와 같이, 비교예와 비교하면 충분히 큰 S/N이 얻어진 것을 알 수 있었다.

실시예 10

(DNA 고정화 담체의 제조)

실시예 6과 동일한 기판을 제조하였다. 이어서, 이 기판상에 스퍼터링법에 의해 Ni-Cl(조성은 Ni₈Cr₂)을 50 nm 제조하였다. 별도로, 클로로포름 10 ㎖ 중에 상기 기판(Ni-Cr막은 설치되어 있지 않음)을 분쇄한 것을 1 g의 비율로 용해시킨 용액을 준비하였다. 또한, 이것을 스핀 코팅법에 의해 도포하여, Ni-Cr 막 위에 흑색의 PMMA막을 포함하는 절연층을 제조하였다. 이어서, 연마기에 의해, 볼록부 상면의 절연층, Ni-Cl막을 제거한 후, 65 ℃의 10 N의 NaOH 용액에 침지시킨 후, 순수한 물, 0.1 N의 HCl 수용액, 순수한 물의 순서로 세정하였다. 또한, 프로브 DNA의 고정화, 검체 DNA의 제조는 실시예 6과 동일하게 행하였다.

(하이브리다이제이션)

커버 유리에 크롬을 5 nm, 금을 100 nm 증착시켰다. 이것에 금선을 납땜하였다. 한편, 먼저 준비한 핵산이 고정화되어 있는 담체의 요철 부분에, 하이브리다이제이션용 용액을 50 ㎕ 가하고, 커버 유리의 금의 면이 담체의 요철 부분에 향하도록 하여 상기 커버 유리를 덮었다. 이 때, 담체의 금과 커버 유리의 금이 전기적으로 단락되지 않도록, 높이 0.2 mm의 스페이서를 사이에 넣었다. 커버 유리의 주위를 페이퍼 본드로 밀봉하여, 하이브리다이제이션 용액이 건조되지 않도록 하였다.

이어서, 담체의 Ni-Cr막과 전원의 양극이 전기적으로 도통하도록, 금선 및 시판되는 은 페이스트를 이용하여 접속하고, 커버 유리의 금(금선)을 전원의 음극에 연결하였다. 이것을 65 ℃의 오븐에 넣어 15 분간 인큐베이션하였다. 또한, 전원으로부터 1 V의 전압을 5 분간 인가한 후, 오븐에서 꺼내어 커버 유리를 떼어내어 세정, 건조시켰다.

그 결과, 실시예 6과 동일한 결과가 얻어졌다. 이와 같이, 하이브리다이제이션 시간이 짧더라도, 볼록부의 측면에 전극을 설치하여 전계를 인가함으로써 하이브리다이제이션 시간을 단축시킬 수 있었다.

비교예 4

폴리아크릴로니트릴을 주성분으로 하는 1 mm 두께의 판(미쓰이 가가꾸(주) 제조 제크론)을 75 mm×25 mm의 크기로 절단하였다. 이것을 10 N의 NaOH에 침지하여 70 ℃에서 12 시간 방치하였다. 이것을 세정 후, 실시예 1과 동일하게 프로브 DNA의 고정화(프로브 DNA의 염기 길이는 60 염기), 검체 DNA와의 하이브리다이제이션을 행하였다. 실시예 1과 동일하게 측정한 결과, 자가 형광이 커서 검체와 프로브와의 하이브리다이제이션의 유무를 검출하는 것이 불가능하였다. 이것은, 판 자체가 황색을 띠고 있기 때문에, 자가 형광이 매우 크기 때문이었다. 또한, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 알칼리 처리전의 평판을 측정하였을 때, 이 판의 자가 형광 강도는 30000으로 매우 컸다.

비교예 5

메틸메타크릴레이트(MMA) 99 중량부와 메타크릴산 1 중량부를 공중합하였다. 이것을 정제한 후, 용매에 용해시키고, 디핑법에 의해 PMMA를 포함하는 판 위에, 이 중합체를 포함하는 막을 제조하였다. 알칼리에 침지하는 것을 생략한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 이 막 위에서의 프로브 DNA(60 염기 길이)의 고정화, 검체 DNA와의 하이브리다이제이션을 행하여 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 그 결과, 시그널은 6000, 노이즈는 300이었다.

실시예 11

메틸메타크릴레이트(MMA) 99 중량부와 메타크릴산 1 중량부를 공중합하였다. 이것을 정제한 후, 용매에 용해시키고, 디핑법에 의해 PMMA를 포함하는 판 위에, 이 공중합 중합체를 포함하는 막을 제조하였다. 이것을 50 ℃에서 10 시간 알칼리에 침지한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 이 막 위에서의 프로브 DNA (60 염기 길이)의 고정화, 검체 DNA와의 하이브리다이제이션을 행하여 실시예 1과 동일하게 측정하였다. 그 결과, 시그널은 15000, 노이즈는 150이었다. 비교예 5보다 본 실시예가 우수한 이유는, 알칼리 처리를 행함으로써 담체 표면의 카르복실기량이 증가하였기 때문이라고 추정된다. 또한, 메틸메타크릴레이트(MMA) 99 중량부와 메타크릴산 1 중량부를 공중합한 중합체를 포함하는 1 mm 두께의 판을 캐스트법에 의해 제조하고, 액손 인스트루먼츠사의 제네픽스 4000B를 이용하여, 여기 파장 532 nm, 포토멀티플레이어의 게인 설정 700, 레이저 파워 33 ％의 조건에서 알칼리 처리를 미실시한 평판을 측정하였을 때, 이 판의 자가 형광 강도는 850이었다.

비교예 6

실시예 1의 알칼리 처리(수산화나트륨에 침지하는 것)를 생략한 것 이외에는, 동일한 실험을 행하였다. 이 때, 하이브리다이제이션을 나타내는 형광은 관찰되지 않았다. 이것은, 알칼리 처리품이나 산에 의한 표면 처리를 행하지 않으면, 카르복실기가 충분히 생성되지 않고, 결과적으로 고정화되는 프로브 DNA가 매우 적은 것이 원인이라고 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> SUPPORT HAVING SELECTIVELY BONDING SUBSTANCE FIXED THERETO <130> TD-04021-PCT <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 1 atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg 60 ttcatctgga 70 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 2 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 60 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 3 cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcatctgga 40 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 4 aaccagaccg ttcatctgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 5 gggcgaagaa gttgtccata 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 6 gcagagcgag gtatgtaggc 20 <210> 7 <211> 2246 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 7 atggcaacag tcaatcagct ggttcgaaag ccgcgagctc gtaaagtggc caaatctaac 60 gttccggctc tcgaggcatg cccgtagaag cgtggcatat gcacacgcgt atacactact 120 actccgaaga aaccgaattc agcgctgcgc aagctttgcc gcgtacgcct gaccaacggt 180 ttcgaggtca cctcatatat aggtggtgaa ggacacaacc tgcaggaaca ctctgttatc 240 ctgatcagag gcggccgcgt taaagatctg cccgggatcc ggtaccacac cgtccgcggc 300 gctctagact gctccggagt aaaggaccgt cgacaggatc gatcgaaata cggtgtaaaa 360 cgtccgaagg cctaatagaa gctagcttgg cactgggcca agctgaattt ctgccattca 420 tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc aataactgcc 480 ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 540 tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag 600 caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catagtgaaa acgggggcga agaagttgtc 660 catattagcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa 720 aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac 780 atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga 840 tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat 900 caccagctca ccgtctttca ttgccatacg aaattccgta tgagcattca tcaggcgggc 960 aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa 1020 ggccgtaata tccagatgaa cggtctggtt ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc 1080 ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt 1140 tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg 1200 tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca 1260 ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc ggtatcaaca gggacaccag gatttattta 1320 ttctgcgaag tgatcttccg ttcgacggag ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 1380 atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 1440 aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 1500 aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 1560 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 1620 ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 1680 tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 1740 ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc 1800 acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 1860 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 1920 cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 1980 aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 2040 atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 2100 gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 2160 gaagaagcat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc gaactagtta actagtacgc 2220 aagttcacgt aaaaagggta tcgacc 2246 <210> 8 <211> 968 <212> DNA <213> Plasmid pKF3 <400> 8 gggcgaagaa gttgtccata ttagccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 60 gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 120 caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 180 attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 240 gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccgtatgag 300 cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 360 ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gatgaacggt ctggttatag gtacattgag 420 caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 480 tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact 540 caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt 600 gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga 660 caccaggatt tatttattct gcgaagtgat cttccgttcg acggagttcc actgagcgtc 720 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 780 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 840 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 900 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 960 cgctctgc 968

Claims

선택 결합성 물질이 고정화된 담체이며, 상기 담체에는 요철부가 설치되어 있으며, 상기 담체의 표면이 저자가(低自家) 형광 수지를 포함하고, 알칼리 또는 산으로 이 저자가 형광 수지의 표면을 처리하여 카르복실기를 생성하며, 또한 선택 결합성 물질을 요철부의 복수의 볼록부 상면에 고정화한 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
담체의 표면에 선택 결합성 물질을 고정화한 선택 결합성 물질 고정화 담체이며, 상기 담체에는 요철부가 설치되어 있으며, 상기 담체의 표면이 하기 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 함유하고 있는 중합체를 가지고, 알칼리 또는 산으로 이 중합체의 표면을 처리하여 카르복실기를 생성하고 나서 선택 결합성 물질을 요철부의 복수의 볼록부 상면에 고정화한 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.

<화학식 1>

(화학식 1 중 R¹, R², R³은 알킬기, 아릴기 또는 수소 원자를 나타낸다.)
제2항에 있어서, 담체 표면의 중합체를 알칼리 또는 산으로 처리하여, 화학식 1로 이루어지는 구조 단위의 측쇄를 카르복실기로 하고, 이 카르복실기와 선택 결합성 물질의 관능기를 결합함으로써 선택 결합성 물질이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 담체 표면의 저자가 형광 수지 또는 중합체가 하기 화학식 1의 구조 단위를 전체 단량체 단위의 10 ％ 이상 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.

<화학식 1>

(화학식 1 중 R¹, R², R³은 알킬기, 아릴기 또는 수소 원자를 나타낸다.)
제1항 또는 제2항에 있어서, 선택 결합성 물질의 아미노기 또는 수산기와, 담체 표면의 카르복실기와의 공유 결합에 의해, 담체에 선택 결합성 물질이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 선택 결합성 물질이 핵산인 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 담체 표면의 저자가 형광 수지 또는 중합체가 폴리메틸메타크릴레이트를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 담체의 표면이 흑색인 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제8항에 있어서, 저자가 형광 수지 또는 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 갖는 중합체가 카본 블랙을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 담체가 적어도 지지체층과 선택 결합성 물질 고정화층을 가지고 있고, 선택 결합성 물질 고정화층 표면이 하기 화학식 1로 표시되는 구조 단위를 갖는 중합체를 가지며, 또한 선택 결합성 물질은 선택 결합성 물질 고정화층의 표면과 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.

<화학식 1>

(화학식 1 중 R¹, R², R³은 알킬기, 아릴기 또는 수소 원자를 나타낸다.)
제10항에 있어서, 지지체층이 유리 또는 금속인 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 요철부의 볼록부 상면이 높이 50 ㎛ 이상의 요철을 갖지 않고, 선택 결합성 물질이 고정화된 볼록부 상면의 높이의 차가 100 ㎛보다 작은 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 담체에는 평탄부가 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 선택성 결합 물질이 고정화된 복수의 볼록부 중, 가장 높은 볼록부의 높이와 가장 낮은 볼록부의 높이의 차가 50 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제14항에 있어서, 요철부의 볼록부 상면의 높이와 평탄 부분의 높이의 차가 50 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 볼록부의 측면에 도전성 재료가 설치되어 있는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
제1항에 있어서, 카르복실기와 선택 결합성 물질의 관능기를 결합함으로써 선택 결합성 물질이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 선택 결합성 물질 고정화 담체.
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