JP2001337089A - Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 - Google Patents
Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法Info
- Publication number
- JP2001337089A JP2001337089A JP2000156870A JP2000156870A JP2001337089A JP 2001337089 A JP2001337089 A JP 2001337089A JP 2000156870 A JP2000156870 A JP 2000156870A JP 2000156870 A JP2000156870 A JP 2000156870A JP 2001337089 A JP2001337089 A JP 2001337089A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- fragment
- dna
- nucleic acid
- dna fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 基板表面に一本鎖のＤＮＡ断片をジスルホン
化合物を用いて共有結合により固定する方法ＤＮＡチッ
プ及び試料核酸断片の検出方法を提供すること。 【解決手段】 反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ断片を
その末端部にて基板表面に固定する方法であって、二本
鎖のＤＮＡ断片を、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−Ｓ
Ｏ2−Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ3−、結合基：−Ｒ3
Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）
n−、又は結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ）n−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2
−（ＣＲ1Ｒ2）n−［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに
独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、及び炭素原子数が６乃至２０のアリール基からなる
群より選ばれる原子又は基を表し；ｎは、１乃至６の整
数を表し；そして、Ｌは、二価の連結基を表す］を介し
て基板表面に結合させる方法。
化合物を用いて共有結合により固定する方法ＤＮＡチッ
プ及び試料核酸断片の検出方法を提供すること。 【解決手段】 反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ断片を
その末端部にて基板表面に固定する方法であって、二本
鎖のＤＮＡ断片を、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−Ｓ
Ｏ2−Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ3−、結合基：−Ｒ3
Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）
n−、又は結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ）n−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2
−（ＣＲ1Ｒ2）n−［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、互いに
独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル
基、及び炭素原子数が６乃至２０のアリール基からなる
群より選ばれる原子又は基を表し；ｎは、１乃至６の整
数を表し；そして、Ｌは、二価の連結基を表す］を介し
て基板表面に結合させる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、ＤＮＡ断片
が共有結合によって基板表面に固定されたＤＮＡチップ
の製造方法、およびＤＮＡチップに関する。本発明は、
また、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有
する試料核酸断片の検出方法にも関する。
異、多型等の同時解析に非常に有用である、ＤＮＡ断片
が共有結合によって基板表面に固定されたＤＮＡチップ
の製造方法、およびＤＮＡチップに関する。本発明は、
また、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有
する試料核酸断片の検出方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッド構造内に取り込まれる蛍光発生
基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する
方法などが知られている。
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッド構造内に取り込まれる蛍光発生
基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する
方法などが知られている。
【０００３】ＤＮＡチップの作製方法として、予め調製
したＤＮＡ断片を固相担体表面に点着して固定する方法
が知られている。その方法は、ＤＮＡ断片の種類や固相
担体の種類に応じて異なるが、（１）ｃＤＮＡやＰＣＲ
産物をポリ陽イオンで表面処理した固相担体表面に点着
し、ＤＮＡ断片の荷電を利用して固相担体にイオン結合
させる方法（Schena, M. et al., Science, 270, 467-4
70(1995)およびShalon，D. et al., Genome Res., 6, 6
39-645(1996)）、および（２）反応性基で修飾した合成
オリゴヌクレオチドを表面処理した固相担体表面に点着
し、共有結合させる方法（「蛋白質・核酸・酵素」,４
３巻、(1998), 2004-2011、Lamture, J. B. et al., Nuc
l. Acids Res., 22, 2121-2125, 1994、およびGuo. Z.,
et al., Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465, 1994）が
実用されている。上記の（１）の方法は、イオン結合に
よる固定方法であるため、一度固定されたＤＮＡ断片の
安定性を補強するため、紫外線や熱による処理をさらに
行うこともできる。一般に、塩基数が５０以上の長鎖の
ＤＮＡ断片は、その一端ではなく、ＤＮＡ断片が有する
複数の電荷を利用して、多点でイオン結合により固相担
体に固定される。
したＤＮＡ断片を固相担体表面に点着して固定する方法
が知られている。その方法は、ＤＮＡ断片の種類や固相
担体の種類に応じて異なるが、（１）ｃＤＮＡやＰＣＲ
産物をポリ陽イオンで表面処理した固相担体表面に点着
し、ＤＮＡ断片の荷電を利用して固相担体にイオン結合
させる方法（Schena, M. et al., Science, 270, 467-4
70(1995)およびShalon，D. et al., Genome Res., 6, 6
39-645(1996)）、および（２）反応性基で修飾した合成
オリゴヌクレオチドを表面処理した固相担体表面に点着
し、共有結合させる方法（「蛋白質・核酸・酵素」,４
３巻、(1998), 2004-2011、Lamture, J. B. et al., Nuc
l. Acids Res., 22, 2121-2125, 1994、およびGuo. Z.,
et al., Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465, 1994）が
実用されている。上記の（１）の方法は、イオン結合に
よる固定方法であるため、一度固定されたＤＮＡ断片の
安定性を補強するため、紫外線や熱による処理をさらに
行うこともできる。一般に、塩基数が５０以上の長鎖の
ＤＮＡ断片は、その一端ではなく、ＤＮＡ断片が有する
複数の電荷を利用して、多点でイオン結合により固相担
体に固定される。
【０００４】ＤＮＡ断片をイオン結合によって固相担体
に固定させる場合には、ＤＮＡ断片の点着は通常二本鎖
ＤＮＡ断片を用いて行われる。そして、二本鎖ＤＮＡ断
片を固定後に、熱、イオン強度、尿素の添加などの条件
（変性処理の条件）を付与することによって、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を解離させ、一本鎖ＤＮＡ断片のみを固定させ
る。しかし、二本鎖ＤＮＡ断片は、何れの鎖も多点で固
定されるため、変性処理後に、対象とする一方の鎖のみ
を固定し、他方の鎖を選択的に排除することが非常に困
難である。
に固定させる場合には、ＤＮＡ断片の点着は通常二本鎖
ＤＮＡ断片を用いて行われる。そして、二本鎖ＤＮＡ断
片を固定後に、熱、イオン強度、尿素の添加などの条件
（変性処理の条件）を付与することによって、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を解離させ、一本鎖ＤＮＡ断片のみを固定させ
る。しかし、二本鎖ＤＮＡ断片は、何れの鎖も多点で固
定されるため、変性処理後に、対象とする一方の鎖のみ
を固定し、他方の鎖を選択的に排除することが非常に困
難である。
【０００５】二本鎖ＤＮＡ断片を共有結合によって固定
する場合には、二本鎖の内の一方の鎖の末端部に予め導
入した反応性基と固相担体上の反応性基との共有結合に
よるため、変性処理後、対象とする一方の鎖のみを固定
させることが可能である。共有結合によってＰＣＲ産物
が固定されたＤＮＡチップを、試料ＤＮＡ断片とのハイ
ブリダイゼーションに供することによって、ＤＮＡチッ
プ上のｃＤＮＡに相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出
する方法が知られている（図２）。この方法で使用する
ＤＮＡチップ（ｂ２）は、二本鎖のｃＤＮＡ（２）が結
合基−Ｌ0−を介して、基板（１）表面に固定されたも
の（ｂ１）を変性処理することのみによって作製された
ものであり、解離した一本鎖のｃＤＮＡ（４）は反応系
外に除かれていない。従って、ハイブリダイゼーション
の際に、解離したｃＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片（５）
とは、ＤＮＡチップ上に固定されたｃＤＮＡに対して競
合すると考えられる。そのため、このＤＮＡチップを用
いるハイブリダイゼーションでは、その効率の低下を招
くという問題点を生じる。
する場合には、二本鎖の内の一方の鎖の末端部に予め導
入した反応性基と固相担体上の反応性基との共有結合に
よるため、変性処理後、対象とする一方の鎖のみを固定
させることが可能である。共有結合によってＰＣＲ産物
が固定されたＤＮＡチップを、試料ＤＮＡ断片とのハイ
ブリダイゼーションに供することによって、ＤＮＡチッ
プ上のｃＤＮＡに相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出
する方法が知られている（図２）。この方法で使用する
ＤＮＡチップ（ｂ２）は、二本鎖のｃＤＮＡ（２）が結
合基−Ｌ0−を介して、基板（１）表面に固定されたも
の（ｂ１）を変性処理することのみによって作製された
ものであり、解離した一本鎖のｃＤＮＡ（４）は反応系
外に除かれていない。従って、ハイブリダイゼーション
の際に、解離したｃＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片（５）
とは、ＤＮＡチップ上に固定されたｃＤＮＡに対して競
合すると考えられる。そのため、このＤＮＡチップを用
いるハイブリダイゼーションでは、その効率の低下を招
くという問題点を生じる。
【０００６】国際公開出願明細書（ＷＯ９８／１８９
６）には、上記記載の方法において、結合基−Ｌ0−と
して、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジチオイソシアナート）
より誘導される基を選択し、かつ、解離した一本鎖のｃ
ＤＮＡを反応系外へ除去することを特徴とする非競合型
の方法が開示されている。また、二本鎖のｃＤＮＡの変
性処理および当該一本鎖のｃＤＮＡの除去については、
９５℃の沸騰水を用いることによって行っている。しか
し、ＰＤＣを用いる二本鎖のｃＤＮＡの固定は、その反
応が遅いという問題点を有する。
６）には、上記記載の方法において、結合基−Ｌ0−と
して、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジチオイソシアナート）
より誘導される基を選択し、かつ、解離した一本鎖のｃ
ＤＮＡを反応系外へ除去することを特徴とする非競合型
の方法が開示されている。また、二本鎖のｃＤＮＡの変
性処理および当該一本鎖のｃＤＮＡの除去については、
９５℃の沸騰水を用いることによって行っている。しか
し、ＰＤＣを用いる二本鎖のｃＤＮＡの固定は、その反
応が遅いという問題点を有する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、基板表面に
一本鎖のＤＮＡ断片をジスルホン化合物を用いて共有結
合によって固定する方法、ＤＮＡチップ、およびＤＮＡ
チップを用いる非競合型のハイブリダイゼーションによ
って試料核酸断片を検出する方法を提供することを、そ
の課題とする。
一本鎖のＤＮＡ断片をジスルホン化合物を用いて共有結
合によって固定する方法、ＤＮＡチップ、およびＤＮＡ
チップを用いる非競合型のハイブリダイゼーションによ
って試料核酸断片を検出する方法を提供することを、そ
の課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）表面に
反応性基が導入された基板上に、一方の末端部に反応性
基を有する一本鎖のＤＮＡ断片と反応性基を有しない一
本鎖のＤＮＡ断片とからなる二本鎖のＤＮＡ断片を含む
水性液を接触させることによって、基板表面の反応性基
と該二本鎖のＤＮＡ断片の内の一方のＤＮＡ断片が有す
る反応性基とを反応させて共有結合を形成させることに
より、該二本鎖のＤＮＡ断片を基板表面に固定する工
程；（２）該二本鎖のＤＮＡ断片から反応性基を有しな
い一本鎖のＤＮＡ断片を遊離させる工程；そして、
（３）遊離した一本鎖のＤＮＡ断片を除去する工程を含
む、反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ断片をその末端部
にて基板表面に固定する方法であって、上記工程（１）
において、該二本鎖のＤＮＡ断片を、結合基：−Ｒ3Ｒ2
Ｃ−Ｒ 1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ
3−、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2
−（ＣＲ1Ｒ2）n−、あるいは結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ）n
−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−［式中、Ｒ1、Ｒ
2およびＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が
１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が６乃至２０
のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
表し；ｎは、１乃至６の整数を表し；そして、Ｌは、二
価の連結基を表す］を介して基板表面に結合させること
を特徴とする固定方法にある。
反応性基が導入された基板上に、一方の末端部に反応性
基を有する一本鎖のＤＮＡ断片と反応性基を有しない一
本鎖のＤＮＡ断片とからなる二本鎖のＤＮＡ断片を含む
水性液を接触させることによって、基板表面の反応性基
と該二本鎖のＤＮＡ断片の内の一方のＤＮＡ断片が有す
る反応性基とを反応させて共有結合を形成させることに
より、該二本鎖のＤＮＡ断片を基板表面に固定する工
程；（２）該二本鎖のＤＮＡ断片から反応性基を有しな
い一本鎖のＤＮＡ断片を遊離させる工程；そして、
（３）遊離した一本鎖のＤＮＡ断片を除去する工程を含
む、反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ断片をその末端部
にて基板表面に固定する方法であって、上記工程（１）
において、該二本鎖のＤＮＡ断片を、結合基：−Ｒ3Ｒ2
Ｃ−Ｒ 1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ
3−、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2
−（ＣＲ1Ｒ2）n−、あるいは結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ）n
−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−［式中、Ｒ1、Ｒ
2およびＲ3は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が
１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が６乃至２０
のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
表し；ｎは、１乃至６の整数を表し；そして、Ｌは、二
価の連結基を表す］を介して基板表面に結合させること
を特徴とする固定方法にある。
【０００９】本発明の固定方法の好ましい態様は以下の
通りである。 （イ）一方の末端部に反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ
断片および反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ断片とし
て、共に、塩基数が５０乃至１０００００の範囲にある
ものを用いる。 （ロ）一本鎖のＤＮＡ断片が有する反応性基がアミノ基
である。
通りである。 （イ）一方の末端部に反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ
断片および反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ断片とし
て、共に、塩基数が５０乃至１０００００の範囲にある
ものを用いる。 （ロ）一本鎖のＤＮＡ断片が有する反応性基がアミノ基
である。
【００１０】本発明は、また、上記記載の本発明の固定
方法によって作製されたＤＮＡチップにもある。
方法によって作製されたＤＮＡチップにもある。
【００１１】本発明は、さらに、上記記載の本発明のＤ
ＮＡチップの表面に、蛍光物質で標識した核酸断片を含
む水性液を付与し、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と蛍光
物質で標識した試料核酸断片とのハイブリッドを形成さ
せ、そして、蛍光物質から発生する蛍光を検出すること
を特徴とする、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相
補性を有する試料核酸断片を検出する方法にもある。
ＮＡチップの表面に、蛍光物質で標識した核酸断片を含
む水性液を付与し、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と蛍光
物質で標識した試料核酸断片とのハイブリッドを形成さ
せ、そして、蛍光物質から発生する蛍光を検出すること
を特徴とする、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相
補性を有する試料核酸断片を検出する方法にもある。
【００１２】本発明は、さらにまた、前記記載の本発明
のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基を有するインター
カレータと試料核酸断片とを含む水性液を付与し、ＤＮ
Ａチップ上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリッ
ドを形成させ、そして、該ハイブリッド構造内に取り込
まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光
を検出することを特徴とする、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ
断片に対して相補性を有する試料核酸断片の検出方法に
もある。本明細書では、塩基数が１乃至９の範囲にある
ＤＮＡ断片をオリゴヌクレオチド、１０乃至４９の範囲
にあるＤＮＡ断片をポリヌクレオチドとし、ポリヌクレ
オチドより長鎖のＤＮＡ断片とは、塩基数が５０以上の
ＤＮＡ断片をいう。
のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基を有するインター
カレータと試料核酸断片とを含む水性液を付与し、ＤＮ
Ａチップ上のＤＮＡ断片と試料核酸断片とのハイブリッ
ドを形成させ、そして、該ハイブリッド構造内に取り込
まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光
を検出することを特徴とする、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ
断片に対して相補性を有する試料核酸断片の検出方法に
もある。本明細書では、塩基数が１乃至９の範囲にある
ＤＮＡ断片をオリゴヌクレオチド、１０乃至４９の範囲
にあるＤＮＡ断片をポリヌクレオチドとし、ポリヌクレ
オチドより長鎖のＤＮＡ断片とは、塩基数が５０以上の
ＤＮＡ断片をいう。
【００１３】
【発明の実施の形態】図１に、本発明の代表的なＤＮＡ
チップ、代表的なＤＮＡチップの製造方法を表す工程、
および代表的な試料核酸断片の検出方法を示す。
チップ、代表的なＤＮＡチップの製造方法を表す工程、
および代表的な試料核酸断片の検出方法を示す。
【００１４】本発明のＤＮＡチップの製造方法では、ま
ず、基板（１）表面に反応性基Ｄ1が導入された修飾基
板（ａ０）に二本鎖のＤＮＡ断片（２）を接触すること
によって、二本鎖の内の一方のＤＮＡ断片（３）の末端
部に導入されている反応性基Ｄ2と基板表面に導入され
ている反応性基Ｄ1とをスペーサを介して共有結合させ
ることにより、二本鎖のＤＮＡ断片を基板表面に固定す
る。二本鎖のＤＮＡ断片は、反応性基Ｄ2を有するＤＮ
Ａ断片（３）と反応性基を有しないＤＮＡ断片（４）と
で形成されている。次いで、固定されている二本鎖のＤ
ＮＡ断片に変性処理を施すことによって、二本鎖の内の
他方のＤＮＡ断片（４）を解離させると共に、反応系か
ら除外する。結合基−Ｌ0−は、スペーサ、反応性基Ｄ1
および反応性基Ｄ2から形成される結合基を示す。上記
の工程によって製造される本発明のＤＮＡチップ（ａ
３）は、一方のＤＮＡ断片（３）のみがその末端部にて
固定されてなるチップである。
ず、基板（１）表面に反応性基Ｄ1が導入された修飾基
板（ａ０）に二本鎖のＤＮＡ断片（２）を接触すること
によって、二本鎖の内の一方のＤＮＡ断片（３）の末端
部に導入されている反応性基Ｄ2と基板表面に導入され
ている反応性基Ｄ1とをスペーサを介して共有結合させ
ることにより、二本鎖のＤＮＡ断片を基板表面に固定す
る。二本鎖のＤＮＡ断片は、反応性基Ｄ2を有するＤＮ
Ａ断片（３）と反応性基を有しないＤＮＡ断片（４）と
で形成されている。次いで、固定されている二本鎖のＤ
ＮＡ断片に変性処理を施すことによって、二本鎖の内の
他方のＤＮＡ断片（４）を解離させると共に、反応系か
ら除外する。結合基−Ｌ0−は、スペーサ、反応性基Ｄ1
および反応性基Ｄ2から形成される結合基を示す。上記
の工程によって製造される本発明のＤＮＡチップ（ａ
３）は、一方のＤＮＡ断片（３）のみがその末端部にて
固定されてなるチップである。
【００１５】本発明において、「ＤＮＡチップ」とは、
一本鎖のＤＮＡ断片がその末端部にて共有結合で固定さ
れてなる基板をいい、固定されているＤＮＡ断片の種類
は問わない。従って、一本鎖のｃＤＮＡが固定されてい
ても、ＤＮＡチップという。「末端部」とは、末端部の
付近をも含むものとする。一本鎖のＤＮＡ断片の種類
は、一種類であっても二種類以上であってもよい。二種
類以上の場合には、アレイ状にＤＮＡ断片（厳密には、
複数個のＤＮＡ断片で構成されている一つの領域）が整
列していることが好ましい。
一本鎖のＤＮＡ断片がその末端部にて共有結合で固定さ
れてなる基板をいい、固定されているＤＮＡ断片の種類
は問わない。従って、一本鎖のｃＤＮＡが固定されてい
ても、ＤＮＡチップという。「末端部」とは、末端部の
付近をも含むものとする。一本鎖のＤＮＡ断片の種類
は、一種類であっても二種類以上であってもよい。二種
類以上の場合には、アレイ状にＤＮＡ断片（厳密には、
複数個のＤＮＡ断片で構成されている一つの領域）が整
列していることが好ましい。
【００１６】本発明の試料核酸断片の検出方法は、本発
明のＤＮＡチップ（ａ３）上に標識物質（６）を有する
試料核酸断片（５）を接触させ、ＤＮＡチップ（ａ３）
上に固定されている一本鎖のＤＮＡ断片と標識された試
料核酸断片（５）とのハイブリッドを形成させ、標識量
を検出する方法である。図１には、形成されたハイブリ
ッド（ａ４に該当）を、試料核酸断片が有する蛍光物質
の蛍光量を測定することによって検出する代表例を示
す。
明のＤＮＡチップ（ａ３）上に標識物質（６）を有する
試料核酸断片（５）を接触させ、ＤＮＡチップ（ａ３）
上に固定されている一本鎖のＤＮＡ断片と標識された試
料核酸断片（５）とのハイブリッドを形成させ、標識量
を検出する方法である。図１には、形成されたハイブリ
ッド（ａ４に該当）を、試料核酸断片が有する蛍光物質
の蛍光量を測定することによって検出する代表例を示
す。
【００１７】［基板］基板としては、疎水性、あるいは
親水性の低い担体であることが好ましい。また、その表
面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく
用いることができる。固相担体の材質としては、ガラ
ス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュー
セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セル
ロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリス
チレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリ
コン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多
孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、
短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙
げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃
至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５
００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板の材質
は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好まし
い。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による
解析の容易さによるものである。基板の厚さは、１００
乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
親水性の低い担体であることが好ましい。また、その表
面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく
用いることができる。固相担体の材質としては、ガラ
ス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュー
セラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セル
ロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリス
チレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリ
コン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多
孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、
短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙
げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃
至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５
００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板の材質
は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好まし
い。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による
解析の容易さによるものである。基板の厚さは、１００
乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００１８】ポリ陽イオンで処理がされた基板表面に、
さらに電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって、ポリ陽イオン処理がされた基板の凹凸を軽減
することができる。基板の種類によっては、その担体中
に親水性高分子等を含有させることも可能であり、この
ような処理を施した基板も好ましく用いることができ
る。
さらに電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって、ポリ陽イオン処理がされた基板の凹凸を軽減
することができる。基板の種類によっては、その担体中
に親水性高分子等を含有させることも可能であり、この
ような処理を施した基板も好ましく用いることができ
る。
【００１９】基板は、二本鎖のＤＮＡ断片を固定させる
ため、その表面に反応性基Ｄ1を有しているが、反応性
基Ｄ1は、基板表面をポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ
−リシン、ポリエチレンイミンもしくはポリアルキルア
ミンであることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであるこ
とが特に好ましい）で被覆処理することによって導入さ
れたものであっても、または反応性基Ｄ1を有するシラ
ンカップリング剤を基板表面に接触させることによって
導入されたものであってもよい。反応性基Ｄ1は、反応
性基Ｄ1を有するシランカップリング剤を基板表面に接
触させることによって導入されたものであることが特に
好ましい。反応性基Ｄ1は、スペーサとなる化合物が有
する反応性基の一部と反応できる基であれば何であって
もよい。このような反応性基Ｄ1としては、アミノ基、
メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシ
ル基もしくは水酸基であることがより好ましく、アミノ
基もしくはメルカプト基であることが特に好ましい。上
記のポリ陽イオンによる被覆処理では、反応性基Ｄ
1は、アミノ基である。
ため、その表面に反応性基Ｄ1を有しているが、反応性
基Ｄ1は、基板表面をポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ
−リシン、ポリエチレンイミンもしくはポリアルキルア
ミンであることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであるこ
とが特に好ましい）で被覆処理することによって導入さ
れたものであっても、または反応性基Ｄ1を有するシラ
ンカップリング剤を基板表面に接触させることによって
導入されたものであってもよい。反応性基Ｄ1は、反応
性基Ｄ1を有するシランカップリング剤を基板表面に接
触させることによって導入されたものであることが特に
好ましい。反応性基Ｄ1は、スペーサとなる化合物が有
する反応性基の一部と反応できる基であれば何であって
もよい。このような反応性基Ｄ1としては、アミノ基、
メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシ
ル基もしくは水酸基であることがより好ましく、アミノ
基もしくはメルカプト基であることが特に好ましい。上
記のポリ陽イオンによる被覆処理では、反応性基Ｄ
1は、アミノ基である。
【００２０】アミノ基を有するシランカップリング剤と
しては、具体的には、γ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルト
リメトキシシランおよびＮ−β（アミノエチル）γ−ア
ミノプロピルメチルジメトキシシランを挙げることがで
き、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いるこ
とが特に好ましい。
しては、具体的には、γ−アミノプロピルトリエトキシ
シラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルト
リメトキシシランおよびＮ−β（アミノエチル）γ−ア
ミノプロピルメチルジメトキシシランを挙げることがで
き、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いるこ
とが特に好ましい。
【００２１】［スペーサ］反応性基Ｄ1と反応性基Ｄ2と
の共有結合は、スペーサを介して形成される。スペーサ
としては、下記式（Ｉ）で表されるジスルホン化合物を
用いる。
の共有結合は、スペーサを介して形成される。スペーサ
としては、下記式（Ｉ）で表されるジスルホン化合物を
用いる。
【００２２】
【化１】（Ｉ） Ｘ1−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−Ｘ2
【００２３】上記式中、Ｘ1は、−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｙを
表し、Ｘ2は、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3、または−（ＣＲ
1Ｒ2）n−Ｙを表す。Ｘ2が−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｙを表す
とき、Ｘ1およびＸ2は、互いに同一の基であっても、異
なる基であってもよい。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに
独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基
および炭素原子数が６乃至２０のアリール基からなる群
より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃
至６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｎ−ブチル基、もしくはｎ−ヘキシル基で
あることが好ましく、メチル基であることが特に好まし
い。上記アリール基としては、フェニル基もしくはナフ
チル基であることが好ましく、フェニル基であることが
特に好ましい。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、共に、水素原子
であることが好ましい。ｎは、１乃至６の整数を表し、
好ましくは２を表す。Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ0、−Ｓ
Ｈ、ＮＨ3、ＮＨ2Ｒ0等（但し、Ｒ0は、水素原子を除く
基とする。）の求核試薬によって置換される基、あるい
は塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表す。Ｙ
は、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、−ＯＳＯ2−
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、−ＯＳＯ2−炭素
原子数が６乃至２０のアリール基、−ＯＳＯ3Ｍ、−Ｏ
ＣＯ−炭素原子数が１乃至６のアルキル基、−ＯＣＯ−
炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至２６のアラルキル基、−ＮＨ−炭素原子数が１乃至６
のアルキレン基−ＯＳＯ3Ｍ、および置換基を有してい
てもよい四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原
子もしくは基であることが好ましい。上記アルキル基、
アリール基、アルキレン基、アラルキル基およびハロゲ
ン化アルキル基は、さらに置換されていてもよい。四級
ピリジニウム基が有していてもよい置換基としては、−
アルキレン基−ＳＯ3 -および−ＮＨ−アルキレン基−Ｓ
Ｏ3 - を挙げることができる。これらのアルキレン基と
しては、メチレン基もしくはエチレン基であることが好
ましい。四級ピリジニウム基は、ハロゲン化酸塩を形成
していてもよく、塩酸塩であることが特に好ましい。Ｍ
は、水素原子、アルカリ金属原子（ナトリウム原子、カ
リウム原子等）および置換基を有していてもよいアンモ
ニウムカチオンからなる群より選ばれる原子もしくはカ
チオンを表す。置換基を有していてもよいアンモニウム
カチオンとしては、 ＮＨ（Ｃ2Ｈ5）3、ＮＨ（ＣＨ2Ｃ
ＨＯＨＣＨ3）3、ＮＨ3Ｃ2Ｈ5、ＮＨ3（ｎ−Ｃ3Ｈ7）、
ＮＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9）、ＮＨ2（Ｃ2Ｈ2ＯＨ）2 、ＮＨ2
（Ｃ2Ｈ 5）2 、ＮＨ2（ｉ−Ｃ3Ｈ7）2 、ＮＨ2（ｎ−Ｃ
3Ｈ7）2 、ＮＨ2ＣＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9） 、ＮＨ2（Ｃ
Ｈ3）2 、ＮＨ2（ｎ−Ｃ4Ｈ9）2 、ＮＨＣ2Ｈ5（ｉ−Ｃ
3Ｈ7）2、もしくはＮＨＣＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9）2 を挙げる
ことができる（但し、窒素原子が有する静電荷（＋）を
省略する）。Ｍは、ナトリウム原子、もしくはカリウム
原子であることが特に好ましい。
表し、Ｘ2は、−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3、または−（ＣＲ
1Ｒ2）n−Ｙを表す。Ｘ2が−（ＣＲ1Ｒ2）n−Ｙを表す
とき、Ｘ1およびＸ2は、互いに同一の基であっても、異
なる基であってもよい。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに
独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基
および炭素原子数が６乃至２０のアリール基からなる群
より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が１乃
至６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｎ−ブチル基、もしくはｎ−ヘキシル基で
あることが好ましく、メチル基であることが特に好まし
い。上記アリール基としては、フェニル基もしくはナフ
チル基であることが好ましく、フェニル基であることが
特に好ましい。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、共に、水素原子
であることが好ましい。ｎは、１乃至６の整数を表し、
好ましくは２を表す。Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ0、−Ｓ
Ｈ、ＮＨ3、ＮＨ2Ｒ0等（但し、Ｒ0は、水素原子を除く
基とする。）の求核試薬によって置換される基、あるい
は塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表す。Ｙ
は、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、−ＯＳＯ2−
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、−ＯＳＯ2−炭素
原子数が６乃至２０のアリール基、−ＯＳＯ3Ｍ、−Ｏ
ＣＯ−炭素原子数が１乃至６のアルキル基、−ＯＣＯ−
炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至２６のアラルキル基、−ＮＨ−炭素原子数が１乃至６
のアルキレン基−ＯＳＯ3Ｍ、および置換基を有してい
てもよい四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原
子もしくは基であることが好ましい。上記アルキル基、
アリール基、アルキレン基、アラルキル基およびハロゲ
ン化アルキル基は、さらに置換されていてもよい。四級
ピリジニウム基が有していてもよい置換基としては、−
アルキレン基−ＳＯ3 -および−ＮＨ−アルキレン基−Ｓ
Ｏ3 - を挙げることができる。これらのアルキレン基と
しては、メチレン基もしくはエチレン基であることが好
ましい。四級ピリジニウム基は、ハロゲン化酸塩を形成
していてもよく、塩酸塩であることが特に好ましい。Ｍ
は、水素原子、アルカリ金属原子（ナトリウム原子、カ
リウム原子等）および置換基を有していてもよいアンモ
ニウムカチオンからなる群より選ばれる原子もしくはカ
チオンを表す。置換基を有していてもよいアンモニウム
カチオンとしては、 ＮＨ（Ｃ2Ｈ5）3、ＮＨ（ＣＨ2Ｃ
ＨＯＨＣＨ3）3、ＮＨ3Ｃ2Ｈ5、ＮＨ3（ｎ−Ｃ3Ｈ7）、
ＮＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9）、ＮＨ2（Ｃ2Ｈ2ＯＨ）2 、ＮＨ2
（Ｃ2Ｈ 5）2 、ＮＨ2（ｉ−Ｃ3Ｈ7）2 、ＮＨ2（ｎ−Ｃ
3Ｈ7）2 、ＮＨ2ＣＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9） 、ＮＨ2（Ｃ
Ｈ3）2 、ＮＨ2（ｎ−Ｃ4Ｈ9）2 、ＮＨＣ2Ｈ5（ｉ−Ｃ
3Ｈ7）2、もしくはＮＨＣＨ3（ｎ−Ｃ4Ｈ9）2 を挙げる
ことができる（但し、窒素原子が有する静電荷（＋）を
省略する）。Ｍは、ナトリウム原子、もしくはカリウム
原子であることが特に好ましい。
【００２４】Ｌは、二価の連結基を表す。二価の連結基
は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、炭素原子数
が３乃至１６の脂肪族環基、炭素原子数が６乃至２０の
アリーレン基、Ｎ、ＳおよびＰからなる群より選ばれる
ヘテロ原子を１乃至３個含む炭素原子数が２乃至２０の
複素環基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−
ＳＯ3−、−ＮＲ11−、−ＣＯ−およびこれらの組み合
わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み合
わせてなる基であることが好ましい。Ｒ11は、水素原
子、炭素原子数が１乃至１５のアルキル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基、および炭素原子数が１乃至
６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２１のアラ
ルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基である
ことが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至
６のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原
子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好まし
い。Ｌが−ＮＲ11−、−ＳＯＮＲ11−、−ＣＯＮＲ
11−、−ＮＲ11ＣＯＯ−、および−ＮＲ11ＣＯＮＲ11−
からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる
基である場合には、それらのＲ11同士が結合して環を形
成していてもよい。
は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、炭素原子数
が３乃至１６の脂肪族環基、炭素原子数が６乃至２０の
アリーレン基、Ｎ、ＳおよびＰからなる群より選ばれる
ヘテロ原子を１乃至３個含む炭素原子数が２乃至２０の
複素環基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−
ＳＯ3−、−ＮＲ11−、−ＣＯ−およびこれらの組み合
わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み合
わせてなる基であることが好ましい。Ｒ11は、水素原
子、炭素原子数が１乃至１５のアルキル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基、および炭素原子数が１乃至
６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２１のアラ
ルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基である
ことが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至
６のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原
子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好まし
い。Ｌが−ＮＲ11−、−ＳＯＮＲ11−、−ＣＯＮＲ
11−、−ＮＲ11ＣＯＯ−、および−ＮＲ11ＣＯＮＲ11−
からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる
基である場合には、それらのＲ11同士が結合して環を形
成していてもよい。
【００２５】上記アルキレン基、脂肪族環基、アリーレ
ン基、Ｒ11のアルキル基、Ｒ11のアリール基、およびＲ
11のアラルキル基は、置換されていてもよい。このよう
な置換基としては、水酸基、炭素原子数が１乃至６のア
ルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルケニル基、炭
素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭素原子数が１
乃至６のアルキル基、炭素原子数が２乃至７のアラルキ
ル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、スルファ
モイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、スルホ基
（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カルボン酸基（もし
くはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原子、炭素原子数
が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子数が６乃至２０
のアリーレン基、スルホニル基、およびこれらの組み合
わせからなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げるこ
とができる。
ン基、Ｒ11のアルキル基、Ｒ11のアリール基、およびＲ
11のアラルキル基は、置換されていてもよい。このよう
な置換基としては、水酸基、炭素原子数が１乃至６のア
ルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルケニル基、炭
素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭素原子数が１
乃至６のアルキル基、炭素原子数が２乃至７のアラルキ
ル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、スルファ
モイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、スルホ基
（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カルボン酸基（もし
くはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原子、炭素原子数
が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子数が６乃至２０
のアリーレン基、スルホニル基、およびこれらの組み合
わせからなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げるこ
とができる。
【００２６】上記Ｘ1およびＸ2の好ましい具体例を以下
に示す。
に示す。
【００２７】
【化２】
【００２８】Ｘ1およびＸ2は、上記具体例の中で、互い
に独立に、（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、
（Ｘ７）、（Ｘ８）、（Ｘ１３）あるいは（Ｘ１４）で
あることが好ましく、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）である
ことがさらに好ましく、（Ｘ１）であることが特に好ま
しい。
に独立に、（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、
（Ｘ７）、（Ｘ８）、（Ｘ１３）あるいは（Ｘ１４）で
あることが好ましく、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）である
ことがさらに好ましく、（Ｘ１）であることが特に好ま
しい。
【００２９】Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、
ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であること
が好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃
至６の整数であり、２もしくは３であることが好まし
い。
ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であること
が好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃
至６の整数であり、２もしくは３であることが好まし
い。
【００３０】
【化３】
【００３１】Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他
に、上記アルキレン基の水素原子が−ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2
基によって置換されてなる基も好ましい。
に、上記アルキレン基の水素原子が−ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2
基によって置換されてなる基も好ましい。
【００３２】本発明で好ましく用いる一般式（Ｉ）で表
されるジスルホン化合物の代表例を下記に示す。
されるジスルホン化合物の代表例を下記に示す。
【００３３】
【化４】
【００３４】本発明で用いる一般式（Ｉ）で表されるジ
スルホン化合物の合成法については、特公昭４７−２４
２９号、同５０−３５８０７号、特開昭４９−２４４３
５号、同５３−４１５５１号、同５９−１８９４４号等
の各公報に詳細が記載されている。
スルホン化合物の合成法については、特公昭４７−２４
２９号、同５０−３５８０７号、特開昭４９−２４４３
５号、同５３−４１５５１号、同５９−１８９４４号等
の各公報に詳細が記載されている。
【００３５】本発明で用いられる一般式（Ｉ）で表され
るジスルホン化合物は、二種類以上を混合して用いても
よい。
るジスルホン化合物は、二種類以上を混合して用いても
よい。
【００３６】基板表面に導入された反応性基Ｄ1と二本
鎖のＤＮＡ断片が有する反応性基Ｄ2とのスペーサを介
した共有結合の形成については、ａ）反応性基Ｄ1とス
ペーサが有する反応性基との間で形成される共有結合、
およびｂ）反応性基Ｄ2とスペーサが有する反応性基と
の間で形成される共有結合の順を問わない。従って、基
板にスペーサを接触させて、まずスペーサを基板に結合
させ、次いで、ここにＤＮＡ断片を接触させてスペーサ
にＤＮＡ断片を結合させることも好ましく（図１に該
当）、スペーサにＤＮＡ断片を接触させて、まずスペー
サにＤＮＡ断片を結合させてから、これを基板に接触さ
せることも好ましく、または基板、スペーサおよびＤＮ
Ａ断片を実質的に同時に接触させることも好ましい。こ
こで、上記ａ）は、一般式（Ｉ）中のＸ1もしくはＸ2の
−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3基に、反応性基Ｄ1を付加させて得ら
れる結合、またはＸ1もしくはＸ2の−Ｙ基に反応性基Ｄ
1を置換させて得られる結合である。上記ｂ）について
は、ａ）と同様である。従って、図１において、結合基
−Ｌ0−とは、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−
Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ3−、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ
−Ｒ 1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−、ある
いは結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ） n−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−
（ＣＲ1Ｒ2）n−を含む基を表す。
鎖のＤＮＡ断片が有する反応性基Ｄ2とのスペーサを介
した共有結合の形成については、ａ）反応性基Ｄ1とス
ペーサが有する反応性基との間で形成される共有結合、
およびｂ）反応性基Ｄ2とスペーサが有する反応性基と
の間で形成される共有結合の順を問わない。従って、基
板にスペーサを接触させて、まずスペーサを基板に結合
させ、次いで、ここにＤＮＡ断片を接触させてスペーサ
にＤＮＡ断片を結合させることも好ましく（図１に該
当）、スペーサにＤＮＡ断片を接触させて、まずスペー
サにＤＮＡ断片を結合させてから、これを基板に接触さ
せることも好ましく、または基板、スペーサおよびＤＮ
Ａ断片を実質的に同時に接触させることも好ましい。こ
こで、上記ａ）は、一般式（Ｉ）中のＸ1もしくはＸ2の
−ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3基に、反応性基Ｄ1を付加させて得ら
れる結合、またはＸ1もしくはＸ2の−Ｙ基に反応性基Ｄ
1を置換させて得られる結合である。上記ｂ）について
は、ａ）と同様である。従って、図１において、結合基
−Ｌ0−とは、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ2−
Ｌ−ＳＯ2−ＣＨＲ1−ＣＲ2Ｒ3−、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ
−Ｒ 1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−、ある
いは結合基：−（Ｒ2Ｒ1Ｃ） n−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−
（ＣＲ1Ｒ2）n−を含む基を表す。
【００３７】［ＤＮＡ断片の点着］本発明のＤＮＡチッ
プは、主に、遺伝子の発現態様（特定の遺伝子の発現
量、発現した遺伝子の種類など）を調べるために用いら
れる。従って、基板表面に固定する二本鎖のＤＮＡ断片
は、ｍＲＮＡに対してＲＴ（reverse transcription）
法によって得たｃＤＮＡ断片をベクターに組み込んだも
の（ｃＤＮＡのライブラリ）をテンプレートとしてＰＣ
Ｒ法によって増幅して調製することが好ましい。一本鎖
のｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅して得られる二本
鎖のｃＤＮＡ断片は、一方の鎖がその末端部に反応性基
Ｒ2を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないもので
あり、これは、一般的に、二種類のプライマ（反応性基
Ｒ2を５’末端に有するプライマと反応性基を有しない
プライマ）を用いて調製することができる。反応性基Ｄ
2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カル
バモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボ
キシイミド基であることが好ましく、アミノ基であるこ
とが特に好ましい。固定の様式は、ＰＣＲ法によって得
られた二本鎖のｃＤＮＡ断片の一方の鎖の末端部（好ま
しくは、５’末端）に有する反応性基Ｄ2と基板表面に
導入された反応性基Ｄ1との共有結合によって行うこと
が好ましい。実際の固定は、ｃＤＮＡ断片が分散または
溶解してなる水性液を基板表面に点着することによって
実施することが好ましい。ｃＤＮＡ断片の塩基数は、５
０乃至１０００００の範囲にあることが好ましく、５０
乃至１００００の範囲にあることがより好ましく、５０
乃至１０００の範囲にあることが特に好ましい。本発明
では、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドではな
く、長鎖のＤＮＡ断片を固定の対象とする。
プは、主に、遺伝子の発現態様（特定の遺伝子の発現
量、発現した遺伝子の種類など）を調べるために用いら
れる。従って、基板表面に固定する二本鎖のＤＮＡ断片
は、ｍＲＮＡに対してＲＴ（reverse transcription）
法によって得たｃＤＮＡ断片をベクターに組み込んだも
の（ｃＤＮＡのライブラリ）をテンプレートとしてＰＣ
Ｒ法によって増幅して調製することが好ましい。一本鎖
のｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅して得られる二本
鎖のｃＤＮＡ断片は、一方の鎖がその末端部に反応性基
Ｒ2を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないもので
あり、これは、一般的に、二種類のプライマ（反応性基
Ｒ2を５’末端に有するプライマと反応性基を有しない
プライマ）を用いて調製することができる。反応性基Ｄ
2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カル
バモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボ
キシイミド基であることが好ましく、アミノ基であるこ
とが特に好ましい。固定の様式は、ＰＣＲ法によって得
られた二本鎖のｃＤＮＡ断片の一方の鎖の末端部（好ま
しくは、５’末端）に有する反応性基Ｄ2と基板表面に
導入された反応性基Ｄ1との共有結合によって行うこと
が好ましい。実際の固定は、ｃＤＮＡ断片が分散または
溶解してなる水性液を基板表面に点着することによって
実施することが好ましい。ｃＤＮＡ断片の塩基数は、５
０乃至１０００００の範囲にあることが好ましく、５０
乃至１００００の範囲にあることがより好ましく、５０
乃至１０００の範囲にあることが特に好ましい。本発明
では、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドではな
く、長鎖のＤＮＡ断片を固定の対象とする。
【００３８】二本鎖のｃＤＮＡ断片が分散または溶解し
てなる水性液を基板表面に点着する際には、この水性液
から反応性基Ｄ2を有するプライマを除去しておくこと
が好ましい。通常、その水性液中には、二本鎖のｃＤＮ
Ａ断片の他に、未反応の反応性基Ｄ2を有するプライマ
が含まれており、特にその未反応の反応性基Ｒ2を有す
るプライマを除去することなく、点着に使用すると該プ
ライマも基板表面上の反応性基Ｄ1と反応して固定され
ることとなってしまうためである。除去の方法として
は、市販のスピンカラム・ガラスフィルタを用いる濾過
またはイソプロパノール沈殿もしくはエタノール沈殿を
挙げることができる。
てなる水性液を基板表面に点着する際には、この水性液
から反応性基Ｄ2を有するプライマを除去しておくこと
が好ましい。通常、その水性液中には、二本鎖のｃＤＮ
Ａ断片の他に、未反応の反応性基Ｄ2を有するプライマ
が含まれており、特にその未反応の反応性基Ｒ2を有す
るプライマを除去することなく、点着に使用すると該プ
ライマも基板表面上の反応性基Ｄ1と反応して固定され
ることとなってしまうためである。除去の方法として
は、市販のスピンカラム・ガラスフィルタを用いる濾過
またはイソプロパノール沈殿もしくはエタノール沈殿を
挙げることができる。
【００３９】基板表面に反応性基Ｄ2を有するＤＮＡ断
片を点着させると、基板表面にはＤＮＡ断片が結合して
いない未反応の反応性基Ｄ1も存在する。このような反
応性基Ｒ2は、標識された試料核酸断片とのハイブリダ
イゼーションにおいて非特異的な結合を生じる可能性が
あるため、予めこのような反応性基Ｄ1をマスク処理し
ておくことが好ましい。マスク処理は、基板表面に、ア
ミノ基もしくはメルカプト基を有するアニオン性化合物
を接触させることによって行うことが好ましい。このよ
うなアニオン性化合物としては、反応性基Ｄ1と反応
し、かつ負の電荷（ＣＯＯ-、ＳＯ3 -、ＯＳＯ3 -、ＰＯ3
-、もしくはＰＯ2 -）を有するものであれば何れのもの
も用いることができるが、アミノ酸であることが好まし
く、グリシンもしくはシステインであることが特に好ま
しい。また、タウリンも好ましく用いることができる。
片を点着させると、基板表面にはＤＮＡ断片が結合して
いない未反応の反応性基Ｄ1も存在する。このような反
応性基Ｒ2は、標識された試料核酸断片とのハイブリダ
イゼーションにおいて非特異的な結合を生じる可能性が
あるため、予めこのような反応性基Ｄ1をマスク処理し
ておくことが好ましい。マスク処理は、基板表面に、ア
ミノ基もしくはメルカプト基を有するアニオン性化合物
を接触させることによって行うことが好ましい。このよ
うなアニオン性化合物としては、反応性基Ｄ1と反応
し、かつ負の電荷（ＣＯＯ-、ＳＯ3 -、ＯＳＯ3 -、ＰＯ3
-、もしくはＰＯ2 -）を有するものであれば何れのもの
も用いることができるが、アミノ酸であることが好まし
く、グリシンもしくはシステインであることが特に好ま
しい。また、タウリンも好ましく用いることができる。
【００４０】［変性処理］基板表面に固定された二本鎖
のＤＮＡ断片を解離させる変性処理の方法としては、公
知の方法を用いることができる。熱処理、高いｐＨやイ
オン強度の低い水性溶媒での処理、または界面活性剤、
有機溶剤（アルコール、アルデヒドなど）もしくは尿素
やアミドの添加処理を挙げることができるが、操作の簡
便さの点や特定のＤＮＡ断片についてはその融解温度
（Ｔｍ）が既知であるという点から、熱処理あるいは水
性溶媒のｐＨを上げる方法を用いることが好ましい。
のＤＮＡ断片を解離させる変性処理の方法としては、公
知の方法を用いることができる。熱処理、高いｐＨやイ
オン強度の低い水性溶媒での処理、または界面活性剤、
有機溶剤（アルコール、アルデヒドなど）もしくは尿素
やアミドの添加処理を挙げることができるが、操作の簡
便さの点や特定のＤＮＡ断片についてはその融解温度
（Ｔｍ）が既知であるという点から、熱処理あるいは水
性溶媒のｐＨを上げる方法を用いることが好ましい。
【００４１】水性溶媒としては、蒸留水、またはクエン
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝
液、グッド緩衝液等の一般的な緩衝液、これらの緩衝液
に電解質を添加したもの、あるいはさらに、ジメチルス
ルホキシドのような二本鎖の結合状態に影響を与えない
有機溶媒を添加したものを用いることが好ましい。
酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝
液、グッド緩衝液等の一般的な緩衝液、これらの緩衝液
に電解質を添加したもの、あるいはさらに、ジメチルス
ルホキシドのような二本鎖の結合状態に影響を与えない
有機溶媒を添加したものを用いることが好ましい。
【００４２】二本鎖の結合状態に影響を与える水性溶媒
の接触は、二本鎖のＤＮＡ断片が固定された基板を、所
定の温度に設定した水性溶媒に接触（好ましくは、浸
漬）させることによって実施することが好ましい。所定
の温度とは、二本鎖のＤＮＡ断片をほぼ完全に解離させ
るために、約９０乃至１００℃の範囲にあることが好ま
しい。接触は、３乃至６０分間の範囲にて行うことが好
ましく、１５乃至３０分間の範囲にて行うことが特に好
ましい。イオン強度を利用する場合には、緩衝液に添加
する電解質（例えば、塩化カリウム）の濃度が０．１乃
至０．９Ｍの範囲にある緩衝液を用いることが好まし
く、０．３乃至０．７Ｍの範囲にある緩衝液を用いるこ
とが特に好ましい。ｐＨを利用する場合には、約１１に
て行うことが好ましい。
の接触は、二本鎖のＤＮＡ断片が固定された基板を、所
定の温度に設定した水性溶媒に接触（好ましくは、浸
漬）させることによって実施することが好ましい。所定
の温度とは、二本鎖のＤＮＡ断片をほぼ完全に解離させ
るために、約９０乃至１００℃の範囲にあることが好ま
しい。接触は、３乃至６０分間の範囲にて行うことが好
ましく、１５乃至３０分間の範囲にて行うことが特に好
ましい。イオン強度を利用する場合には、緩衝液に添加
する電解質（例えば、塩化カリウム）の濃度が０．１乃
至０．９Ｍの範囲にある緩衝液を用いることが好まし
く、０．３乃至０．７Ｍの範囲にある緩衝液を用いるこ
とが特に好ましい。ｐＨを利用する場合には、約１１に
て行うことが好ましい。
【００４３】［核酸断片試料］試料核酸断片は、遺伝子
発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織からｍＲ
ＮＡを抽出し、逆転写反応により蛍光標識されたｄＮＴ
Ｐを取り込ませて、標識ｃＤＮＡとしたものを用いるこ
とが好ましい。一方、ｍＲＮＡそのものを蛍光標識して
用いることも好ましい。
発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織からｍＲ
ＮＡを抽出し、逆転写反応により蛍光標識されたｄＮＴ
Ｐを取り込ませて、標識ｃＤＮＡとしたものを用いるこ
とが好ましい。一方、ｍＲＮＡそのものを蛍光標識して
用いることも好ましい。
【００４４】［ハイブリダイゼーション］ハイブリダイ
ゼーションは、本発明のＤＮＡチップに、蛍光物質で標
識された試料核酸断片が溶解または分散してなる水性液
を接触させることによって、あるいは蛍光発生基を有す
るインターカレータの存在下、非標識の試料核酸断片が
溶解または分散してなる水性液を接触させることによっ
て行うことが好ましい。上記後者の場合には、蛍光イン
ターカレータは、ハイブリダイゼーションの終了後に、
形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させても、ハイブ
リダイゼーションの際に試料核酸断片を含む水性液中に
蛍光インターカレータを含めることによって、形成され
るハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。ハイブリダ
イゼーションの終了後に接させる場合には、蛍光インタ
ーカレータが、（一本鎖の）試料核酸断片あるいは試料
中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に非特異的に結合す
るのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未
反応の試料核酸断片を除去してから、接触させることが
望ましい。洗浄には、界面活性剤（好ましくは、ドデシ
ル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩
衝液）との混合溶液を用いることが好ましい。蛍光イン
ターカレータは、何れも１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範
囲にて用いることが好ましい。ハイブリダイゼーション
は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２
０時間の範囲で実施することが好ましい。
ゼーションは、本発明のＤＮＡチップに、蛍光物質で標
識された試料核酸断片が溶解または分散してなる水性液
を接触させることによって、あるいは蛍光発生基を有す
るインターカレータの存在下、非標識の試料核酸断片が
溶解または分散してなる水性液を接触させることによっ
て行うことが好ましい。上記後者の場合には、蛍光イン
ターカレータは、ハイブリダイゼーションの終了後に、
形成されたハイブリッドＤＮＡに接触させても、ハイブ
リダイゼーションの際に試料核酸断片を含む水性液中に
蛍光インターカレータを含めることによって、形成され
るハイブリッドＤＮＡに接触させてもよい。ハイブリダ
イゼーションの終了後に接させる場合には、蛍光インタ
ーカレータが、（一本鎖の）試料核酸断片あるいは試料
中に含まれる二本鎖の試料核酸断片に非特異的に結合す
るのを避けるため、ハイブリダイゼーション終了後に未
反応の試料核酸断片を除去してから、接触させることが
望ましい。洗浄には、界面活性剤（好ましくは、ドデシ
ル硫酸ナトリウム）と緩衝液（好ましくは、クエン酸緩
衝液）との混合溶液を用いることが好ましい。蛍光イン
ターカレータは、何れも１０ｎＭ乃至１０ｍＭの濃度範
囲にて用いることが好ましい。ハイブリダイゼーション
は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２
０時間の範囲で実施することが好ましい。
【００４５】ハイブリダイゼーション中の乾燥を防ぐた
めに、試料核酸断片を含む水性液に、高沸点の物質を添
加してもよい。高沸点の物質としては、試料核酸断片を
含む水性液に溶解し得るものであって、ハイブリダイゼ
ーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物
質であることが好ましい。このような物質としては、グ
リセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド
および低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。
低分子の親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミ
ド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等を挙げることができる。高沸点の物質の濃度は、試
料核酸断片を含む水性液中、０．１乃至２容量％の範囲
にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあ
ることが特に好ましい。低分子の親水性ポリマーについ
ては、特願平１１−３０４２９号の明細書に詳細が記載
されている。また、同じ目的のために、ハイブリダイゼ
ーション中のＤＮＡチップを、９０％以上の湿度および
２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好まし
い。
めに、試料核酸断片を含む水性液に、高沸点の物質を添
加してもよい。高沸点の物質としては、試料核酸断片を
含む水性液に溶解し得るものであって、ハイブリダイゼ
ーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物
質であることが好ましい。このような物質としては、グ
リセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド
および低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。
低分子の親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミ
ド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等を挙げることができる。高沸点の物質の濃度は、試
料核酸断片を含む水性液中、０．１乃至２容量％の範囲
にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあ
ることが特に好ましい。低分子の親水性ポリマーについ
ては、特願平１１−３０４２９号の明細書に詳細が記載
されている。また、同じ目的のために、ハイブリダイゼ
ーション中のＤＮＡチップを、９０％以上の湿度および
２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好まし
い。
【００４６】ＤＮＡチップ上の一本鎖のｃＤＮＡ断片と
試料核酸断片とで形成されるハイブリッドの検出は、蛍
光発生基を有するインターカレータ（以下、「蛍光イン
ターカレータ」という。）あるいは試料核酸断片を標識
している蛍光物質から発せられる蛍光量を測定すること
によって行う。
試料核酸断片とで形成されるハイブリッドの検出は、蛍
光発生基を有するインターカレータ（以下、「蛍光イン
ターカレータ」という。）あるいは試料核酸断片を標識
している蛍光物質から発せられる蛍光量を測定すること
によって行う。
【００４７】［蛍光物質］蛍光物質としては、試料核酸
断片の核酸塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ Ｄ
ｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ
試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレ
ン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導
体）を使用することができる。
断片の核酸塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ Ｄ
ｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ
試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレ
ン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導
体）を使用することができる。
【００４８】［蛍光発生基を有するインターカレータ］
蛍光インターカレータとしては、文献（Bull.Chem.Soc.
Jpn.,72,327-337(1999)）に記載のものを用いることが
できる。この他のものとしては、水溶性縫い込み型蛍光
インターカレータであって、下記一般式（ＩＩ）で表さ
れるものも好ましく用いることができる。下記式で表さ
れる蛍光インターカレータは蛍光性基（Ｆ）を一つのみ
有する。
蛍光インターカレータとしては、文献（Bull.Chem.Soc.
Jpn.,72,327-337(1999)）に記載のものを用いることが
できる。この他のものとしては、水溶性縫い込み型蛍光
インターカレータであって、下記一般式（ＩＩ）で表さ
れるものも好ましく用いることができる。下記式で表さ
れる蛍光インターカレータは蛍光性基（Ｆ）を一つのみ
有する。
【００４９】
【化５】（ＩＩ） Ｆ−Ｙ4−Ｌ1−Ｘ3−Ｌ2−Ｑ
【００５０】上記式中、Ｘ3は、蛍光インターカレータ
のコア部分であり、置換基を有していてもよい二価の環
状基を表す。二価の環状基としては、平面性を有する環
状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を
有するナフタレンジイミド基、２位と６位もしくは１位
と５位（好ましくは、２位と６位）とに結合手を有する
アントラセン基、アントラセン基と同じ位置に結合手を
有するアントラキノン基、２位と６位とに結合手を有す
るフルオレン基、２位と６位とに結合手を有するビフェ
ニレン基、２位と７位とに結合手を有するフェナントレ
ン基、および２位と７位とに結合手を有するピレン基か
らなる群より選ばれる環状基であることが好ましく、二
つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基で
あることが特に好ましい。置換基としては、ハロゲン原
子、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である
ことが好ましいが、水素原子であることが好ましい。炭
素原子数が１乃至６のアルキル基としては、メチル基、
エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが好まし
い。
のコア部分であり、置換基を有していてもよい二価の環
状基を表す。二価の環状基としては、平面性を有する環
状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を
有するナフタレンジイミド基、２位と６位もしくは１位
と５位（好ましくは、２位と６位）とに結合手を有する
アントラセン基、アントラセン基と同じ位置に結合手を
有するアントラキノン基、２位と６位とに結合手を有す
るフルオレン基、２位と６位とに結合手を有するビフェ
ニレン基、２位と７位とに結合手を有するフェナントレ
ン基、および２位と７位とに結合手を有するピレン基か
らなる群より選ばれる環状基であることが好ましく、二
つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基で
あることが特に好ましい。置換基としては、ハロゲン原
子、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である
ことが好ましいが、水素原子であることが好ましい。炭
素原子数が１乃至６のアルキル基としては、メチル基、
エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが好まし
い。
【００５１】Ｘ3の具体例を次に示す。＊印は、結合手
の位置を示す。
の位置を示す。
【００５２】
【化６】
【００５３】Ｆは、蛍光性基（一つの結合手を有する蛍
光発生物質）を表す。蛍光発生物質は、特定の波長、例
えば、波長が４００乃至７００ｎｍの範囲（好ましく
は、４００乃至５５０ｎｍの範囲）にある励起光の照射
によって蛍光を発する物質であることが好ましい。この
ような蛍光発生物質としては、インドシアニン系化合
物、アザインドレニンシアニン系化合物、アクリジン系
化合物、および溝結合型化合物（groove binder）を挙
げることができる。ここで、溝結合型化合物とは、一般
的に、その分子内に四級カチオン性基を有し、そのカチ
オン性基の存在によって、二本鎖核酸断片のリン酸エス
テル基のアニオンと強く相互作用する化合物をいう。溝
結合型化合物は、そのコア部分（Ｘ3）と蛍光性基
（Ｆ）とが塩基対を介して積層した状態で二本鎖核酸断
片に取り込まれる。
光発生物質）を表す。蛍光発生物質は、特定の波長、例
えば、波長が４００乃至７００ｎｍの範囲（好ましく
は、４００乃至５５０ｎｍの範囲）にある励起光の照射
によって蛍光を発する物質であることが好ましい。この
ような蛍光発生物質としては、インドシアニン系化合
物、アザインドレニンシアニン系化合物、アクリジン系
化合物、および溝結合型化合物（groove binder）を挙
げることができる。ここで、溝結合型化合物とは、一般
的に、その分子内に四級カチオン性基を有し、そのカチ
オン性基の存在によって、二本鎖核酸断片のリン酸エス
テル基のアニオンと強く相互作用する化合物をいう。溝
結合型化合物は、そのコア部分（Ｘ3）と蛍光性基
（Ｆ）とが塩基対を介して積層した状態で二本鎖核酸断
片に取り込まれる。
【００５４】下記に、インドシアニン系化合物（Ｆ
１）、アザインドレニンシアニン系化合物（Ｆ２）、ア
クリジン系化合物（Ｆ３）、および溝結合型化合物（Ｆ
４）の具体例をこの順に、一つの結合手を有する構造と
して示す。結合手の位置を＊印で示す。
１）、アザインドレニンシアニン系化合物（Ｆ２）、ア
クリジン系化合物（Ｆ３）、および溝結合型化合物（Ｆ
４）の具体例をこの順に、一つの結合手を有する構造と
して示す。結合手の位置を＊印で示す。
【００５５】
【化７】
【００５６】
【化８】
【００５７】
【化９】
【００５８】
【化１０】
【００５９】
【化１１】
【００６０】
【化１２】
【００６１】
【化１３】
【００６２】
【化１４】
【００６３】
【化１５】
【００６４】上記式中、Ａは、酸素原子あるいはイオウ
原子を示す。
原子を示す。
【００６５】Ｌ1およびＬ2は、互いに独立に、蛍光イン
ターカレータに可溶性を付与する二価の連結基であるこ
とが好ましく、その直鎖部分が炭素原子数が３乃至１０
の炭化水素基に相当する長さを有する基であることが好
ましい。ここで、直鎖部分とは、Ｌ1に関しては、その
一方の端部がコア部分（Ｘ3）と縮合し、かつ他方の端
部がＹと縮合する部分、Ｌ2に関しては、その一方の端
部がコア部分（Ｘ3）と縮合し、かつ他方の端部がＺと
縮合する部分をいう。Ｌ1およびＬ2は、調製の都合上、
互いに同一の基であることが好ましい。Ｌ1は、二価の
連結基中に、アルキレン基と、窒素原子を有する二価の
基とを含む連結基であることがさらに好ましい。窒素原
子を有する二価の基は、Ｌ1の直鎖部分に含むことが好
ましい。窒素原子を有する二価の基としては、イミノ
基、１，４−ピペラジニル基、１，３−イミダゾリジニ
ル基、ピロリジニル基、二価のピラゾリジニル基、ある
いは二価のピペリジニル基であることが好ましく、イミ
ノ基、あるいは１，４−ピペラジニル基であることが特
に好ましい。
ターカレータに可溶性を付与する二価の連結基であるこ
とが好ましく、その直鎖部分が炭素原子数が３乃至１０
の炭化水素基に相当する長さを有する基であることが好
ましい。ここで、直鎖部分とは、Ｌ1に関しては、その
一方の端部がコア部分（Ｘ3）と縮合し、かつ他方の端
部がＹと縮合する部分、Ｌ2に関しては、その一方の端
部がコア部分（Ｘ3）と縮合し、かつ他方の端部がＺと
縮合する部分をいう。Ｌ1およびＬ2は、調製の都合上、
互いに同一の基であることが好ましい。Ｌ1は、二価の
連結基中に、アルキレン基と、窒素原子を有する二価の
基とを含む連結基であることがさらに好ましい。窒素原
子を有する二価の基は、Ｌ1の直鎖部分に含むことが好
ましい。窒素原子を有する二価の基としては、イミノ
基、１，４−ピペラジニル基、１，３−イミダゾリジニ
ル基、ピロリジニル基、二価のピラゾリジニル基、ある
いは二価のピペリジニル基であることが好ましく、イミ
ノ基、あるいは１，４−ピペラジニル基であることが特
に好ましい。
【００６６】窒素原子は、炭素原子数が１乃至３のアル
キル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３
のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラル
キル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよ
い。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチ
ル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基
であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のア
シル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭
素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル
基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル
基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３の
アルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキ
ル基としては、ベンジル基であることが好ましい。イミ
ノ基の置換基としては、メチル基であることが特に好ま
しい。従って、Ｌ1（もしくはＬ2）は、Ｎ−メチル−ジ
（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プロ
ピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好まし
く、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基であ
ることが特に好ましい。
キル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数
が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３
のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラル
キル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよ
い。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチ
ル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基
であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のア
シル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭
素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル
基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル
基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３の
アルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキ
ル基としては、ベンジル基であることが好ましい。イミ
ノ基の置換基としては、メチル基であることが特に好ま
しい。従って、Ｌ1（もしくはＬ2）は、Ｎ−メチル−ジ
（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プロ
ピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好まし
く、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基であ
ることが特に好ましい。
【００６７】Ｙ4は、二価の連結基を表し、イミノ基、
チオエーテル基、カルボニルオキシ基、チオカルボニル
オキシ基もしくはカルボニル基であることがより好まし
く、イミノ基、チオエーテル基もしくはカルボニル基で
あることがさらに好ましく、イミノ基であることが特に
好ましい。
チオエーテル基、カルボニルオキシ基、チオカルボニル
オキシ基もしくはカルボニル基であることがより好まし
く、イミノ基、チオエーテル基もしくはカルボニル基で
あることがさらに好ましく、イミノ基であることが特に
好ましい。
【００６８】Ｑは、非蛍光性基を表し、アミノ基、カル
ボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン
酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ
基およびメルカプト基からなる群より選ばれる基である
ことが好ましく、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸
基あるいはメルカプト基であることがより好ましく、ア
ミノ基であることが特に好ましい。
ボン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基、スルフェン
酸基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、水酸基、イミノ
基およびメルカプト基からなる群より選ばれる基である
ことが好ましく、アミノ基、カルボン酸基、スルホン酸
基あるいはメルカプト基であることがより好ましく、ア
ミノ基であることが特に好ましい。
【００６９】蛍光インターカレータは、水溶性であるこ
とが必要とされるが、インターカレータに水溶性を付与
するために、前記記載のように、Ｌ1やＬ2に可溶性を付
与する基を含めることも好ましいが、インターカレータ
の塩として用いてもよい。塩としては、塩酸塩、硫酸
塩、炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩
等の無機塩との酸付加塩、あるいは酢酸塩、シュウ酸
塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタ
ンスルホン酸塩等の有機酸との付加塩、またはナトリウ
ム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の
無機塩類、あるいはピリジン塩、アンモニウム塩、トリ
エチルアミン塩、エタノールアミン塩等の有機塩類を挙
げることができる。
とが必要とされるが、インターカレータに水溶性を付与
するために、前記記載のように、Ｌ1やＬ2に可溶性を付
与する基を含めることも好ましいが、インターカレータ
の塩として用いてもよい。塩としては、塩酸塩、硫酸
塩、炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩
等の無機塩との酸付加塩、あるいは酢酸塩、シュウ酸
塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタ
ンスルホン酸塩等の有機酸との付加塩、またはナトリウ
ム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の
無機塩類、あるいはピリジン塩、アンモニウム塩、トリ
エチルアミン塩、エタノールアミン塩等の有機塩類を挙
げることができる。
【００７０】蛍光インターカレータは、公知の方法（特
開平９−２８８０８０号公報）によって簡便に製造する
ことができる。この方法では、蛍光性基が二つ導入され
たものも得られるが、反応条件を変えて、あるいは反応
生成物の分離精製を行って本発明の蛍光インターカレー
タのみを得ることができる。
開平９−２８８０８０号公報）によって簡便に製造する
ことができる。この方法では、蛍光性基が二つ導入され
たものも得られるが、反応条件を変えて、あるいは反応
生成物の分離精製を行って本発明の蛍光インターカレー
タのみを得ることができる。
【００７１】［蛍光量の測定］ＤＮＡチップ上の一本鎖
のｃＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリ
ッドの検出は、蛍光発生基を有するインターカレータ
（以下、「蛍光インターカレータ」という。）あるいは
試料核酸断片を標識している蛍光物質から発せられるの
蛍光量を測定することによって行う。蛍光量の測定は、
蛍光レーザースキャナー法や冷却ＣＣＤ（電荷結合素
子）法によって行うことが好ましい。
のｃＤＮＡ断片と試料核酸断片とで形成されるハイブリ
ッドの検出は、蛍光発生基を有するインターカレータ
（以下、「蛍光インターカレータ」という。）あるいは
試料核酸断片を標識している蛍光物質から発せられるの
蛍光量を測定することによって行う。蛍光量の測定は、
蛍光レーザースキャナー法や冷却ＣＣＤ（電荷結合素
子）法によって行うことが好ましい。
【００７２】本発明の試料核酸断片の検出方法は、例え
ば、酵母の野生型株、および酵母のＴＵＰＩ欠損株から
それぞれ抽出したｍＲＮＡを用いて蛍光標識した試料ｃ
ＤＮＡ断片を調製し、次いで、酵母の約数千個の全遺伝
子を配置したＤＮＡチップに対して、各試料ｃＤＮＡ断
片を用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行い、ｍ
ＲＮＡの発現量を解析することに利用できる。実際に、
イオン結合によってＰＣＲ産物が固定されているＤＮＡ
チップを用いて、野生型株から得られた試料ｃＤＮＡ断
片を用いた場合には、ｍＲＮＡの発現量の相違が、ＤＮ
Ａチップ上のスポット間にほとんど認められなかったの
に対し、ＴＵＰＩ欠損株から得られた試料ｃＤＮＡ断片
を用いた場合には、ｍＲＮＡの発現量の増減が認められ
た例が知られている（「実験医学」Vol.17, No.1, 1月
号，1999年）。
ば、酵母の野生型株、および酵母のＴＵＰＩ欠損株から
それぞれ抽出したｍＲＮＡを用いて蛍光標識した試料ｃ
ＤＮＡ断片を調製し、次いで、酵母の約数千個の全遺伝
子を配置したＤＮＡチップに対して、各試料ｃＤＮＡ断
片を用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行い、ｍ
ＲＮＡの発現量を解析することに利用できる。実際に、
イオン結合によってＰＣＲ産物が固定されているＤＮＡ
チップを用いて、野生型株から得られた試料ｃＤＮＡ断
片を用いた場合には、ｍＲＮＡの発現量の相違が、ＤＮ
Ａチップ上のスポット間にほとんど認められなかったの
に対し、ＴＵＰＩ欠損株から得られた試料ｃＤＮＡ断片
を用いた場合には、ｍＲＮＡの発現量の増減が認められ
た例が知られている（「実験医学」Vol.17, No.1, 1月
号，1999年）。
【００７３】
【実施例】［実施例１］ （１）ＤＮＡチップの作製 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライドを作成した。次いで、このシラン化合
物被覆スライドを、５重量％１，２−ビス（ビニルスル
ホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで
洗浄し、１時間減圧下にて乾燥し、ビニルスルホニル基
が導入されたスライドを得た。一本鎖のＤＮＡ断片
（ａ）の５’末端にアミノ基が結合した反応性基を有す
るＤＮＡ断片と、一本鎖のＤＮＡ断片（ｂ）の５’末端
に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５、アマ
シャム・ファルマシア・バイオテク社製）が結合した標
識ＤＮＡ断片とからなる二本鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ法に
よって得、これを滅菌水に分散してなる水溶液（１×１
０-6Ｍ）を上記のスライドに点着した。点着後のスライ
ドの表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した
ところ、２３０００であった。そのスライドを、２５
℃、湿度７０％にて一晩放置した後、４×ＳＳＣ（ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）水溶液で５分間洗浄
し、さらに０．５Ｍグリシン水溶液（ｐＨ８．５）で１
時間洗浄した。次いで、そのスライドを沸騰水に３０分
間浸漬（変性処理）した後、沸騰水から取り出し、解離
しているＤＮＡ断片（ｂ）を除去した。そして、スライ
ドを室温で乾燥させてＤＮＡチップＦ１を得た。ＤＮＡ
チップＦ１の表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で
測定したところ、８００であった。
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライドを作成した。次いで、このシラン化合
物被覆スライドを、５重量％１，２−ビス（ビニルスル
ホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで
洗浄し、１時間減圧下にて乾燥し、ビニルスルホニル基
が導入されたスライドを得た。一本鎖のＤＮＡ断片
（ａ）の５’末端にアミノ基が結合した反応性基を有す
るＤＮＡ断片と、一本鎖のＤＮＡ断片（ｂ）の５’末端
に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５、アマ
シャム・ファルマシア・バイオテク社製）が結合した標
識ＤＮＡ断片とからなる二本鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲ法に
よって得、これを滅菌水に分散してなる水溶液（１×１
０-6Ｍ）を上記のスライドに点着した。点着後のスライ
ドの表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定した
ところ、２３０００であった。そのスライドを、２５
℃、湿度７０％にて一晩放置した後、４×ＳＳＣ（ＳＳ
Ｃ：標準食塩−クエン酸緩衝液）水溶液で５分間洗浄
し、さらに０．５Ｍグリシン水溶液（ｐＨ８．５）で１
時間洗浄した。次いで、そのスライドを沸騰水に３０分
間浸漬（変性処理）した後、沸騰水から取り出し、解離
しているＤＮＡ断片（ｂ）を除去した。そして、スライ
ドを室温で乾燥させてＤＮＡチップＦ１を得た。ＤＮＡ
チップＦ１の表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で
測定したところ、８００であった。
【００７４】（２）試料ＤＮＡ断片の検出 上記（１）で得たＤＮＡチップＦ１の表面に、上記
（１）のＤＮＡ断片（ｂ）と同じ塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片の５’末端に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎ
ｋ Ｃｙ３、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社
製）が結合した標識ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼー
ション用溶液（４×ＳＳＣ溶液と０．２重量％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液の混合溶液）５０μＬ
を点着した。点着後のＤＮＡチップＦ１の表面を顕微鏡
用カバーガラスで覆い、モイスチャーチャンバ内にて６
０℃で２０時間インキュベートし、室温にて０．１重量
％ＳＤＳ水溶液と２×ＳＳＣ水溶液との混合溶液で、５
０℃にて０．１重量％ＳＤＳ水溶液と０．２×ＳＳＣ水
溶液との混合溶液で、および室温にて０．２×ＳＳＣの
水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心
し、室温で乾燥した。乾燥後のＤＮＡチップＦ１の表面
の蛍光強度を測定したところ、１０００であった。
（１）のＤＮＡ断片（ｂ）と同じ塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片の５’末端に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎ
ｋ Ｃｙ３、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社
製）が結合した標識ＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼー
ション用溶液（４×ＳＳＣ溶液と０．２重量％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液の混合溶液）５０μＬ
を点着した。点着後のＤＮＡチップＦ１の表面を顕微鏡
用カバーガラスで覆い、モイスチャーチャンバ内にて６
０℃で２０時間インキュベートし、室温にて０．１重量
％ＳＤＳ水溶液と２×ＳＳＣ水溶液との混合溶液で、５
０℃にて０．１重量％ＳＤＳ水溶液と０．２×ＳＳＣ水
溶液との混合溶液で、および室温にて０．２×ＳＳＣの
水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心
し、室温で乾燥した。乾燥後のＤＮＡチップＦ１の表面
の蛍光強度を測定したところ、１０００であった。
【００７５】沸騰水で処理する時間を長くすることによ
って、ほぼ完全な二本鎖の解離および解離している一方
の鎖のｃＤＮＡ断片の除去が可能となり、アミノ基を有
する他方の鎖のｃＤＮＡ断片のみを共有結合によってス
ライドガラスの表面に固定させたＤＮＡチップを作製す
ることができる。また、このようにして作製されたＤＮ
Ａチップは、試料ｃＤＮＡ断片と効率よくハイブリダイ
ズすることが分かる。
って、ほぼ完全な二本鎖の解離および解離している一方
の鎖のｃＤＮＡ断片の除去が可能となり、アミノ基を有
する他方の鎖のｃＤＮＡ断片のみを共有結合によってス
ライドガラスの表面に固定させたＤＮＡチップを作製す
ることができる。また、このようにして作製されたＤＮ
Ａチップは、試料ｃＤＮＡ断片と効率よくハイブリダイ
ズすることが分かる。
【発明の効果】本発明のＤＮＡチップの製造方法によっ
て、ポリヌクレオチドよりも長鎖の一本鎖のＤＮＡ断片
を基板表面に共有結合によって固定したＤＮＡチップを
得ることができる。即ち、本発明の製造方法は、最初に
固定した二本鎖のＤＮＡ断片をほぼ完全に解離させ、か
つ解離している一方のＤＮＡ断片をチップの外へ排除す
ることに特徴があり、解離している一方のＤＮＡ片がチ
ップ上に共存し、試料核酸断片と競合反応を起こすこと
がないため、ハイブリダイゼーションの効率を上げるこ
とが可能となる。また、塩基数が約１０００００の核酸
断片が固定されてなる本発明のＤＮＡチップは、遺伝子
の発現態様の解析に特に有用である。さらに、本発明の
ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーション後、沸騰水に
供することによって試料核酸断片（または、試料核酸断
片および蛍光発生基を有するインターカレータ）を解離
または除去することができ、一回乃至数回の範囲で再利
用が可能である。
て、ポリヌクレオチドよりも長鎖の一本鎖のＤＮＡ断片
を基板表面に共有結合によって固定したＤＮＡチップを
得ることができる。即ち、本発明の製造方法は、最初に
固定した二本鎖のＤＮＡ断片をほぼ完全に解離させ、か
つ解離している一方のＤＮＡ断片をチップの外へ排除す
ることに特徴があり、解離している一方のＤＮＡ片がチ
ップ上に共存し、試料核酸断片と競合反応を起こすこと
がないため、ハイブリダイゼーションの効率を上げるこ
とが可能となる。また、塩基数が約１０００００の核酸
断片が固定されてなる本発明のＤＮＡチップは、遺伝子
の発現態様の解析に特に有用である。さらに、本発明の
ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーション後、沸騰水に
供することによって試料核酸断片（または、試料核酸断
片および蛍光発生基を有するインターカレータ）を解離
または除去することができ、一回乃至数回の範囲で再利
用が可能である。
【図１】本発明のＤＮＡチップの製造方法の工程、本発
明のＤＮＡチップおよび本発明の試料核酸断片の検出方
法を示す代表的な模式図である。
明のＤＮＡチップおよび本発明の試料核酸断片の検出方
法を示す代表的な模式図である。
【図２】試料核酸断片の競合型検出方法を示す模式図で
ある。
ある。
１ 基板 ２ 二本鎖のＤＮＡ断片 ３ 反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ断片 ４ 反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ断片 ５ 試料核酸断片 ６ 蛍光物質 ａ３ 本発明のＤＮＡチップ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 牧野 快彦 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 瀬志本 修 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 FA11 4B024 AA11 AA20 CA09 HA12 HA14 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 CC11 FA03 FA15 4B063 QA01 QA12 QA17 QA18 QQ42 QR32 QR55 QR84 QS03 QS34 QS36 QS39 QX02
Claims (6)
- 【請求項１】 （１）表面に反応性基が導入された基板
上に、一方の末端部に反応性基を有する一本鎖のＤＮＡ
断片と反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ断片とからな
る二本鎖のＤＮＡ断片を含む水性液を接触させることに
よって、基板表面の反応性基と該二本鎖のＤＮＡ断片の
内の一方のＤＮＡ断片が有する反応性基とを反応させて
共有結合を形成させることにより、該二本鎖のＤＮＡ断
片を基板表面に固定する工程；（２）該二本鎖のＤＮＡ
断片から反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ断片を遊離
させる工程；そして、（３）遊離した一本鎖のＤＮＡ断
片を除去する工程を含む、反応性基を有する一本鎖のＤ
ＮＡ断片をその末端部にて基板表面に固定する方法であ
って、 上記工程（１）において、該二本鎖のＤＮＡ断片を、結
合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ 1ＨＣ−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−ＣＨ
Ｒ1−ＣＲ2Ｒ3−、結合基：−Ｒ3Ｒ2Ｃ−Ｒ1ＨＣ−ＳＯ
2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−、あるいは結合基：−
（Ｒ2Ｒ1Ｃ）n−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−（ＣＲ1Ｒ2）n−
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、互いに独立に、水素原
子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、および炭素原
子数が６乃至２０のアリール基からなる群より選ばれる
原子もしくは基を表し；ｎは、１乃至６の整数を表し；
そして、Ｌは、二価の連結基を表す］を介して基板表面
に結合させることを特徴とする固定方法。 - 【請求項２】 一方の末端部に反応性基を有する一本鎖
のＤＮＡ断片および反応性基を有しない一本鎖のＤＮＡ
断片として、共に、塩基数が５０乃至１０００００の範
囲にあるものを用いることを特徴とする請求項１に記載
の固定方法。 - 【請求項３】 一本鎖のＤＮＡ断片が有する反応性基
が、アミノ基であることを特徴とする請求項１に記載の
固定方法。 - 【請求項４】 請求項１乃至３の内の何れかの項に記載
の固定方法によって作製されたＤＮＡチップ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光物質で標識した核酸断片を含む水性液を付与
し、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と蛍光物質で標識した
試料核酸断片とのハイブリッドを形成させ、そして、蛍
光物質から発生する蛍光を検出することを特徴とする、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する試
料核酸断片を検出する方法。 - 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光発生基を有するインターカレータと試料核酸断
片とを含む水性液を付与し、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片と試料核酸断片とのハイブリッドを形成させ、そし
て、該ハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレ
ータの蛍光発生基から発生する蛍光を検出することを特
徴とする、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性
を有する試料核酸断片の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000156870A JP2001337089A (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000156870A JP2001337089A (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001337089A true JP2001337089A (ja) | 2001-12-07 |
Family
ID=18661588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000156870A Withdrawn JP2001337089A (ja) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001337089A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005345181A (ja) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sony Corp | 物質間の相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに物質間の相互作用の検出方法 |
| US7795006B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-09-14 | Toray Industries, Inc. | Support having selectively bonding substance fixed thereto |
| JP2010256306A (ja) * | 2009-04-28 | 2010-11-11 | Japan Science & Technology Agency | オリゴヌクレオチドの固定方法 |
-
2000
- 2000-05-26 JP JP2000156870A patent/JP2001337089A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7795006B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-09-14 | Toray Industries, Inc. | Support having selectively bonding substance fixed thereto |
| US9333478B2 (en) | 2003-05-19 | 2016-05-10 | Toray Industries, Inc. | Support carrying an immobilized selective binding substance |
| US9358518B2 (en) | 2003-05-19 | 2016-06-07 | Toray Industries, Inc. | Support carrying an immobilized selective binding substance |
| JP2005345181A (ja) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Sony Corp | 物質間の相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに物質間の相互作用の検出方法 |
| JP2010256306A (ja) * | 2009-04-28 | 2010-11-11 | Japan Science & Technology Agency | オリゴヌクレオチドの固定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20060292617A1 (en) | Methods and compositions for analysis of microRNA | |
| JP3883539B2 (ja) | エポキシ基を有する放射状ポリエチレングリコール誘導体を用いたハイドロゲルバイオチップの製造方法 | |
| JP2022061994A (ja) | 核酸アレイ合成のための、支持体、システム、および方法 | |
| JP2001108683A (ja) | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 | |
| JP2002176977A (ja) | プローブ分子が固定された検出具の処理方法及び水性処理液 | |
| JP2003084002A (ja) | 蛍光検出におけるバックグラウンドの低減方法 | |
| JP2001337089A (ja) | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 | |
| JP2001128683A (ja) | Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法 | |
| JP3568197B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| KR100450822B1 (ko) | 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체를이용한 하이드로 젤 바이오칩의 제조방법 | |
| JP3342695B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP4267208B2 (ja) | 蛍光インターカレータおよび相補性核酸断片の検出方法 | |
| JP2001178472A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2005291951A (ja) | 高分子微粒子の固定方法 | |
| JP3857075B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP2000063154A (ja) | 核酸固定用ガラスプレート | |
| JP3975042B2 (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2003194815A (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP4054499B2 (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP4184718B2 (ja) | 反応性固相担体の製造方法 | |
| JP3808389B2 (ja) | 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具 | |
| JP2001017166A (ja) | Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法 | |
| JP2001178474A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ | |
| JP2001128697A (ja) | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 | |
| JP2001183368A (ja) | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20070807 |