JP2007047024A - 生体関連物質の定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 基板上に固定化されたプローブに、生体関連物質を特異的に結合させて該生体関連物質を定量するに際し、定量を正確におこなう方法を提供する。
【解決手段】 生体関連物質を、基板に固定化されたプローブに特異的に結合させて、基板に結合された該生体関連物質の量を測定する生体関連物質の定量方法であって、基板上の、異なる量のプローブが固定化されている互いに異なるスポットに、あるいは、固定化されたプローブ量が連続的に変化しているひとつのスポットに、生体関連物質を含む試料を添加した時に、プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、基板上に固定化されたプローブに、特異的に結合した生体関連物質の定量方法に関する。

約３０億ｂｐという巨大なヒトゲノムの全塩基配列を決定し、それらを解析しようというヒトゲノム計画は、システマティックな塩基配列からシステマティックな機能解析へと焦点が移ってきている。遺伝情報の具体的内容は、生体内においていかなるタンパク質がいかなる条件で合成されるかという点につきるものであるが、前者すなわちいかなるタンパク質が合成されているかという点についての解析には、従来より、ウエスタン・ブロット法、ノーザン・ブロット法およびサザン・ブロット法等の解析方法が広く用いられている。しかしながら、これらの解析方法は、取り出された特定のタンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡなどがいかなるものであるかという点については解析できても、細胞から抽出されたすべてのタンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡを一度に解析するには必ずしも適したものではなかった。
一方、後者すなわちタンパク質がいかなる条件で合成されるかという点についての解析には、タンパク質合成が転写のレベルで制御されているために従来の解析方法では充分な解析ができず、その最大の原因は、ＤＮＡにおける制御配列と対応する制御内容の双方のデータが不足していたためであった。

しかしここにきて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイと呼ばれる、１センチ四方程度の担体表面上に、高密度に任意のオリゴヌクレオチドを固定化する技術の進歩によって、遺伝子の発現情報の解析が飛躍的に進歩することが期待されている。
ＤＮＡチップは、シリコンチップをフォトリソグラフィー技術によって多くの区画に分割し、それぞれの区画上に特定の塩基配列を持った一本鎖ＤＮＡを直接合成したものである。また、ＤＮＡマイクロアレイは、従来、メンブレン上にプロットされたスポットサイズが約３００μmあるいはそれ以上であったものが、スポットサイズが約２００μmあるいはそれ以下のものをスライドガラス上にプロットしたものへと、高機能化されてきている。

これらＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイは、通常、信号読取装置とコンピュータシステムにつながれ、チップ上あるいはマイクロアレイ上に配置されたＤＮＡがどのプローブとハイブリダイゼーションしたかを知ることができるようになっている。これらＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、チップ上あるいはマイクロアレイ上に配置されるＤＮＡの種類とその配置次第で、遺伝子ＤＮＡの変異解析、多型解析、塩基配列解析、発現解析などさまざまな用途に用いることが可能なものである。

しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析に関しては、マイクロアレイの作製やその検出装置の詳細な検討がなされ始めたばかりであり、まだ多くの問題点を抱えている。
例えば、従来のＤＮＡマイクロアレイは、一定濃度に調製されたプローブ溶液を、スポッターを用いて基板上に吐出することで、プローブを基板に固定化したものである（特許文献１参照）。
特開２００２−３６５３０２号公報

しかしながら、特許文献１に記載の方法で作製されたＤＮＡマイクロアレイにおいては、基板上に固定化されているプローブの量が一定でないと、生体関連物質の正確な定量が困難となる。
また、このようなＤＮＡマイクロアレイの作製に際しては、基板上に固定化されたプローブの量が一定であるかどうかを確認することは非常に困難であり、もし、基板の化学処理にばらつきが生じて、基板上に固定化されたプローブの量にばらつきが生じると、生体関連物質の定量を正確に行うことができないという問題点がある。

したがって、本発明の目的は、基板上に固定化されたプローブに、生体関連物質を特異的に結合させて該生体関連物質を定量するに際し、定量を正確におこなう方法を提供することにある。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された該生体関連物質を定量する方法であって、試料が添加されるスポットは、添加する生体関連物質の量よりも過剰なプローブを含むものであることを特徴とする生体関連物質の定量方法である。

請求項２に記載の発明は、生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された生体関連物質を定量する方法であって、基板上の互いに異なるスポットには、異なる量のプローブが固定化されており、該プローブの固定化量に関わらず、該生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することを特徴とする生体関連物質の定量方法である。

請求項３に記載の発明は、前記互いに異なるスポットのうちの少なくとも一部が、添加する生体関連物質の量よりも過剰なプローブを含むスポットであることを特徴とする請求項２に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項４に記載の発明は、前記互いに異なるスポットを、プローブ濃度の異なる溶液を用いて作製することを特徴とする請求項２または３に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項５に記載の発明は、前記互いに異なるスポットを、プローブ溶液の基板上への付着回数を変化させて、作製することを特徴とする請求項２または３に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項６に記載の発明は、生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された生体関連物質を定量する方法であって、当該スポット内においては、固定化されたプローブ量が連続的に変化しており、該プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することを特徴とする生体関連物質の定量方法である。

請求項７に記載の発明は、前記スポット内において、スポットの中心からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少していることを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項８に記載の発明は、中心からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを、基板上の同一箇所にプローブ溶液を複数回付着させることにより作製することを特徴とする請求項７に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項９に記載の発明は、前記スポット内において、スポットの周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少していることを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質の定量方法である。

請求項１０に記載の発明は、周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを、乾燥雰囲気中でプローブ溶液を二次元基板上へ付着させることにより作製することを特徴とする請求項９に記載の生体関連物質の定量方法である。

本発明によれば、マイクロアレイ等、プローブが固定化された基板を用いた生体関連物質の定量を、より正確に行うことができる。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明において、プローブの基板への固定化は、スポッター装置を用いる従来公知の方法を適用できる。例えば、ピンを用いて、プローブ溶液を基板上に直接接触させてプローブを固定化する接触プリンティング法や、インクジェット技術を用いて、基板上にプローブ溶液を吐出してプローブを固定化する非接触プリンティング法等を挙げることができるが、非接触プリンティング法が好ましい。

本発明において、基板上のプローブに結合された生体関連物質の量を測定する手法としては、従来公知の方法を適用できる。例えば、生体関連物質に蛍光性物質を結合させておき、基板上のプローブに結合させた後、該基板に前記蛍光性物質を励起することができる波長の光を照射して、蛍光強度を測定する手法等が挙げられる。また、この時用いる蛍光性物質としては、フルオレセイン、ローダミン、アクリフラビン等従来公知のものを挙げることができる。

本発明で用いる基板とは、プローブを固定化するものであり、該プローブを安定に結合あるいは点着できるものであれば特に制限はなく、例えば、多孔質体、メンブレンフィルターあるいはスライドガラス板等を挙げることができる。また、これらの基板は、プローブを安定に結合あるいは点着するために、化学的な前処理がなされているものであってもよい。

本発明で用いるプローブとは、生体関連物質と特異的に結合可能な物質のことであり、例えば、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、あるいはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸等を挙げることができ、タンパク質であればそのアミノ酸組成等が判っているもの、核酸であればその塩基配列や塩基の長さ等が判っているものを指す。
また、これらプローブは、一つのスポットに対しては、一種類のみが固定化される。

また、本発明で用いる生体関連物質とは、生体から抽出、単離等された物質であり、担体上の所定の位置に固定化されたプローブと特異的に結合する物質のことであるが、生体から直接抽出されたものだけでなく、これらを化学処理あるいは化学修飾等したものも含まれる。例えば、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、あるいはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸等を挙げることができ、さらにこれらを化学処理あるいは化学修飾したもの等を挙げることができる。

さらに、前記プローブと前記生体関連物質との特異的な結合とは、例えば、ＤＮＡやＲＮＡの相補的なヌクレオチド配列間の安定な二重鎖の形成（ハイブリダイゼーション）や、抗原と抗体あるいはビオチンとアビジン等のように、特定の物質間で選択的に形成される、特異性の高い分子間力に基づく結合を意味する。

ここで、例えば、プローブ量が、添加される生体関連物質の量よりも少ないスポットと、プローブ量が、添加される生体関連物質の量よりも過剰であるスポットを有する、プローブ固定化量が段階的に変化している複数のスポットを考える。
今、生体関連物質を含む一定量の試料を各スポットに添加する。プローブ量が、添加される生体関連物質の量よりも少ないスポット群においては、プローブへの生体関連物質の結合量は、プローブ量に依存する。すなわち、プローブ量の増加に伴って増加する。したがって、このようなスポット群において算出された生体関連物質の量は、正確な生体関連物質の量以下の量しか表していないことになる。
これに対して、プローブ量が、添加される生体関連物質の量よりも過剰であるスポット群においては、プローブへの生体関連物質の結合量は、プローブ量に依存せず一定となる。したがって、このようなスポット群においては算出された生体関連物質の量は、正確な生体関連物質の量を表していることになる。

したがって、本発明においては、プローブ固定化量にかかわらず、生体関連物質の結合量が一定となっている値を測定する。
もし、プローブ固定化量が、添加される生体関連物質の量よりも少ない場合には、プローブと特異的に結合することができない余剰分の生体関連物質が生じ、生体関連物質の定量を正確に行うことができない。

本発明の第一の実施形態においては、基板上の、異なる量のプローブが固定化されている互いに異なるスポットに、生体関連物質を含む試料を添加した時に、プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することで、生体関連物質を定量する。この時、前記スポットのうちの少なくとも一部が、添加する生体関連物質よりも過剰なプローブを含むものであることが好ましい。
また、プローブ固定化量の異なるスポットは、例えば、プローブ濃度の異なる溶液を基板上に付着させることで、あるいは、プローブ濃度が同じ溶液を、異なる回数だけ基板上に付着させることで、作製することができる。プローブ濃度が同じ溶液を、異なる回数だけ基板上に付着させてスポットを作製させた場合は、生体関連物質の定量は、該スポットの中心付近において行うことが好ましい。これは、付着回数にもよるが、第二の実施形態で述べるように、中心付近のプローブの量が、該スポット内で最も多くなるからである。

また、本発明の第二の実施形態においては、基板上の、固定化されたプローブ量が連続的に変化しているひとつのスポットに、生体関連物質を含む試料を添加した時に、プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することで、生体関連物質を定量する。ここでは、前記スポット内において、スポットの中心からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを用いることが好ましい。
また、中心からの距離に応じて固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットは、例えば、基板上の同一箇所にプローブ溶液を複数回付着させることで、作製することができる。
この時の付着させるプローブ溶液の量は３００ｐｌであることが好ましい。また、プローブ溶液を付着させる回数は、３回以上が好ましく、５回が特に好ましい。さらに、スポットの内径は、２００μｍ以下とすることが好ましい。

また、本発明の第三の実施形態においては、基板上の、固定化されたプローブ量が連続的に変化しているひとつのスポットに、生体関連物質を含む試料を添加した時に、プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することで、生体関連物質を定量する。この時、前記スポット内において、スポットの周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを用いることが好ましい。
また、スポットの周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットは、例えば、乾燥雰囲気中でプローブ溶液を二次元基板上へ付着させることで、作製することができる。この時の乾燥雰囲気としては、温度が１５〜３０℃で、絶対湿度が１５％以下であることが好ましく、絶対湿度が８％以下であることがより好ましい。また、この時用いる二次元基板は、多孔質体でなければ特に限定されず、スライドガラス等を好ましく用いることができる。
一方、この時の付着させるプローブ溶液の量は３００ｐｌであることが好ましい。さらに、スポットの内径は、２００μｍ以下とすることが好ましい。

以下、具体的実施例を挙げて、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例においてはいずれも、基板としてはポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたスライドガラスを、プローブとしては５’位をアミノ基で修飾した５０量体のオリゴＤＮＡの水溶液をそれぞれ用いた。

（実施例１）
インクジェット式スポッターを用いて、１０枚のスライドガラス上に４種類の濃度、すなわち、５０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１０００μＭのプローブオリゴＤＮＡ水溶液をそれぞれ１滴（３００ｐｌ）ずつ吐出して、該スライドガラス上にプローブオリゴＤＮＡを固定化した。固定化操作後に、スライドガラスを３×ＳＳＰＥ緩衝液で洗浄し、スライドガラスに固定化されなかったプローブをスライドガラスより除去した。
次に一本鎖核酸を染色する試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、プローブを固定化した１０枚のスライドガラスのうち、５枚を染色した。蛍光顕微鏡を用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩを励起させ、ＣＣＤカメラでスライドガラスを撮影し、スポットの中心部分におけるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの蛍光強度を測定した。その結果を図１に示す。なおここでは、蛍光強度を測定した５枚のスライドガラスにおける全てのスポットにおいて、同様の結果が観察された。

図１より、用いたプローブオリゴＤＮＡ水溶液の濃度とＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの蛍光強度とは比例関係にあり、したがって、スライドガラス上に、固定化されたプローブの量が異なる複数のスポットが形成されていることが確認された。

次に、固定化したプローブと特異的に結合する生体関連物質として、該プローブに対して相補的な塩基配列を有する、５’末端部位をＦＩＴＣで標識したカウンターオリゴＤＮＡの３０量体を、３×ＳＳＰＥ緩衝液に５種類の濃度（１００pＭ、１５０pＭ、２００pＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ）となるように溶解させたものを用意した。
それぞれの濃度ごとに、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液を前記１０枚のスライドガラスのうち、プローブを固定化した未使用の５枚のスライドガラスと、４２℃で３時間接触させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、３×ＳＳＰＥ緩衝液でスライドガラスを洗浄し、未反応のカウンターオリゴＤＮＡをスライドガラスから除去した。続いて、蛍光顕微鏡を用いて励起光をスライドガラスに照射し、スポットの中心部分について、カウンターオリゴＤＮＡに結合しているＦＩＴＣの蛍光強度を測定した。
この時の各スポットにおけるＦＩＴＣの蛍光強度を、スライドガラス撮影時の露光時間が１秒に相当するように換算した結果を図２に示す。

カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１００pＭ、１５０pＭ、２００pＭの場合は、プローブオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が５００μＭ以上となると、露光時間１秒相当の蛍光強度は、前記プローブオリゴＤＮＡ水溶液の濃度に依存せずに一定となっている。すなわち、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量は、固定化されたプローブの量に依存せずに一定であり、水溶液中のカウンターオリゴＤＮＡの量に依存していることを示している。
一方、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１ｎＭ、１０ｎＭの場合は、露光時間１秒相当の蛍光強度は、プローブオリゴＤＮＡ水溶液の濃度に依存して変化していることが判る。すなわち、固定化されたプローブの量が多いほどプローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量が多くなっていることを示している。

また、プローブオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１０００μＭの場合について、各濃度のカウンターオリゴＤＮＡ水溶液をスポットした時の露光時間１秒相当の蛍光強度を、表１に示す。
さらに、表１の結果から、該露光時間１秒相当の蛍光強度およびカウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度を、１００ｐＭの水溶液をそれぞれ１として、それ以外の濃度の水溶液について換算し直した結果を表２に示す。

表２の結果より、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が２００pＭ以下の場合は、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度換算値と露光時間１秒相当の蛍光強度とは比例関係にあることが判る。これは、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量が、固定化されたプローブの量に依存せずに一定であり、水溶液中のカウンターオリゴＤＮＡの量に依存していることを示しており、したがって、カウンターオリゴＤＮＡの定量が正確になされていることを示すものである。

以上、本発明により、マイクロアレイの製造に際して、基板上の互いに異なる位置に異なる量のプローブを固定化し、該プローブに生体関連物質を特異的に結合させた時の該結合量が一定値となる値を測定することによって、生体関連物質の定量が正確に行えることが確認された。

（実施例２）
インクジェット式スポッターを用いて、スライドガラス上に１００μＭプローブオリゴＤＮＡ水溶液を吐出して、該スライドガラス上にプローブオリゴＤＮＡを固定化した。この時、該水溶液の１回の吐出量は３００ｐｌとして、スライドガラス上の同じ位置に５回吐出することにより、スライドガラス上に円形のスポットが得られた。この操作を１枚のスライドガラスに対して１００箇所行い、このようにして１０枚のスライドガラスに対してそれぞれプローブの固定化を行った。固定化操作後に、スライドガラスを３×ＳＳＰＥ緩衝液で洗浄し、スライドガラスに固定化されなかったプローブをスライドガラスより除去した。

次に、一本鎖核酸を染色する試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、プローブを固定化した１０枚のスライドガラスのうち、５枚を染色した。蛍光顕微鏡を用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩを励起させ、ＣＣＤカメラでスライドガラスを撮影し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの蛍光強度を測定した。
プローブを固定化したスポット内の各部分について、スポットの中心部分におけるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの蛍光強度を１００％とした場合の蛍光強度比と、スポットの中心部分からの距離との関係を、図３に示す。なおここでは、蛍光強度を測定した５枚のスライドガラスにおける全てのスポットにおいて、同様の結果が観察された。

図３より、スポットの中心部分から１００μｍ以内の領域では、蛍光強度比とスポットの中心部分からの距離とが反比例の関係にあり、蛍光強度比が連続的に変化していることが確認された。これはすなわち、固定化されたプローブの量は、スポットの中心部分が最も多く、中心部分から外周方向へ遠ざかるにつれて少なくなっていることを示すものである。なお、スポットの中心部分から１００μｍ以上の部分は、プローブが固定化されていないスライドガラス部分に相当する。

以上の結果から、基板上の同一箇所にプローブオリゴＤＮＡ水溶液を５回吐出することにより、基板上に半径１００μｍの円形のスポットが形成され、基板に固定化されたプローブオリゴＤＮＡは、該スポット内において、中心部分から外周方向へ向けて連続的に減少していることが確認された。

次に、固定化したプローブと特異的に結合する生体関連物質として、該プローブに対して相補的な塩基配列を有する、５’末端部位をフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略記）で標識したカウンターオリゴＤＮＡの３０量体を、３×ＳＳＰＥ緩衝液に５種類の濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ）となるように溶解させたものを用意した。
それぞれの濃度ごとに、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液を、前記１０枚のスライドガラスのうち、プローブを固定化した未使用の５枚のスライドガラスと、４２℃で３時間接触させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、３×ＳＳＰＥ緩衝液でスライドガラスを洗浄し、未反応のカウンターオリゴＤＮＡをスライドガラスから除去した。続いて、蛍光顕微鏡を用いて励起光をスライドガラスに照射し、カウンターオリゴＤＮＡに結合しているＦＩＴＣの蛍光強度を測定した。
スポット内の各部分について、スポットの中心部分におけるＦＩＴＣの蛍光強度を１００％とした場合の蛍光強度比と、スポットの中心部分からの距離との関係を、図４に示す。なおここでは、用いた各々のスライドガラスにおいて、該スライドガラス上のすべてのスポットについて、同様の結果が観察された。

用いたカウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭの場合は、ＦＩＴＣの蛍光強度比は、スポット内の中心部分からの距離が５０μｍ以内の領域では一定であり、５０μｍ〜１００μｍの領域では、中心部分からの距離に反比例して低下した。すなわち、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量は、スポット内の中心部分からの距離が５０μｍ以内の領域までは、固定化されたプローブの量が変化しても一定となっている。
一方、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１００ｎＭ、１０ｎＭの場合は、ＦＩＴＣの蛍光強度比は、スポット内の中心部分からの距離が１００μｍ以内の全領域に渡って、中心部分からの距離に反比例して低下した。すなわち、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量は、固定化されたプローブの量に依存している。

次に、各スポットについて、その中心部分におけるＦＩＴＣの蛍光強度を、スライドガラス撮影時の露光時間が１秒に相当するように換算した数値を表３に示す。
さらに、表３の結果から、該露光時間１秒相当の蛍光強度およびカウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度を、１０ｐＭの水溶液をそれぞれ１として、それ以外の濃度の水溶液について換算し直した結果を表４に示す。

表４の結果より、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１nＭ以下の場合は、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度換算値と露光時間１秒相当の蛍光強度とは比例関係にあることが判る。これは、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量が、固定化されたプローブの量に依存せずに一定であり、水溶液中のカウンターオリゴＤＮＡの量に依存していることを示しており、したがって、カウンターオリゴＤＮＡの定量が正確になされていることを示すものである。

（実施例３）
インクジェット式スポッターを用いて、スライドガラス上に１００μＭプローブオリゴＤＮＡ水溶液を吐出して、該スライドガラス上にプローブオリゴＤＮＡを固定化した。この時、室温２５℃、相対湿度３５％（絶対湿度８％）の環境下で作業を行い、該水溶液の吐出量は３００ｐｌとして、スライドガラスに１回吐出した。この操作を１枚のスライドガラスに対して１００箇所行い、このようにして１０枚のスライドガラスに対してそれぞれプローブの固定化を行った。固定化操作後に、スライドガラスを３×ＳＳＰＥ緩衝液で洗浄し、スライドガラスに固定化されなかったプローブをスライドガラスより除去した。

次に、一本鎖核酸を染色する試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、プローブを固定化した１０枚のスライドガラスのうち、５枚を染色した。蛍光顕微鏡を用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩを励起させ、ＣＣＤカメラでスライドガラスを撮影し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの蛍光強度を測定した。
プローブを固定化したスポット内の各部分について、スポットの周辺部分におけるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩの最大蛍光強度を１００％とした場合の蛍光強度比と、スポットの中心部分からの距離との関係を、図５に示す。なおここでは、蛍光強度を測定した５枚のスライドガラスにおける全てのスポットにおいて、同様の結果が観察された。

図５より、スポットの周辺部分から中心部分に向けて蛍光強度比が連続的に減少していることが確認された。これはすなわち、固定化されたプローブの量は、スポットの周辺部分が最も多く、周辺部分から中心方向へ遠ざかるにつれて少なくなっていることを示すものである。なお、スポットの中心部分から７０μｍ以上の部分は、プローブが固定化されていないスライドガラス部分に相当する。

以上の結果から、室温２５℃、相対湿度３５％（絶対湿度８％）の環境下で基板上にプローブオリゴＤＮＡ水溶液を吐出することにより、基板上に半径６０μｍの円形のスポットが形成され、基板に固定化されたプローブオリゴＤＮＡは、該スポット内において、周辺部分から中心方向へ向けて連続的に減少していることが確認された。

次に、固定化したプローブと特異的に結合する生体関連物質として、該プローブに対して相補的な塩基配列を有する、５’末端部位をフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略記）で標識したカウンターオリゴＤＮＡの３０量体を、３×ＳＳＰＥ緩衝液に５種類の濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ）となるように溶解させたものを用意した。
それぞれの濃度ごとに、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液を、前記１０枚のスライドガラスのうち、プローブを固定化した未使用の５枚のスライドガラスと、４２℃で３時間接触させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、３×ＳＳＰＥ緩衝液でスライドガラスを洗浄し、未反応のカウンターオリゴＤＮＡをスライドガラスから除去した。続いて、蛍光顕微鏡を用いて励起光をスライドガラスに照射し、カウンターオリゴＤＮＡに結合しているＦＩＴＣの蛍光強度を測定した。
スポット内の各部分について、スポットの周辺部分におけるＦＩＴＣの蛍光強度を１００％とした場合の蛍光強度比と、スポットの中心部分からの距離との関係を、図６に示す。なおここでは、用いた各々のスライドガラスにおいて、該スライドガラス上のすべてのスポットについて、同様の結果が観察された。

用いたカウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭの場合は、ＦＩＴＣの蛍光強度比はスポット内の中心部分から周辺部まで一定である。すなわち、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量は、スポット内の中心部分から周辺部まで、固定化されたプローブの量が変化しても一定となっている。
一方、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１００ｎＭ、１０ｎＭの場合は、ＦＩＴＣの蛍光強度比は、スポット内の中心部分から周辺部に渡って中心部分からの距離に比例して増加した。すなわち、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量は、固定化されたプローブの量に依存している。

次に、各スポットについて、その中心部分におけるＦＩＴＣの蛍光強度を、スライドガラス撮影時の露光時間が１秒に相当するように換算した数値を表５に示す。
さらに、表５の結果から、該露光時間１秒相当の蛍光強度およびカウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度を、１０ｐＭの水溶液をそれぞれ１として、それ以外の濃度の水溶液について換算し直した結果を表６に示す。

表６の結果より、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度が１nＭ以下の場合は、カウンターオリゴＤＮＡ水溶液の濃度換算値と露光時間１秒相当の蛍光強度とは比例関係にあることが判る。これは、プローブに結合したカウンターオリゴＤＮＡの量が、固定化されたプローブの量に依存せずに一定であり、水溶液中のカウンターオリゴＤＮＡの量に依存していることを示しており、したがって、カウンターオリゴＤＮＡの定量が正確になされていることを示すものである。

この時、固定化されたプローブの量に依存しているハイブリダイゼーション画像は、周辺部分が中心部分よりも明るくリング状に観察されるので、定量性の可否をハイブリダイゼーションしたスポットの画像から容易に判断することも可能である。

本発明により、生体関連物質の定量をより高い精度で行うことができ、定量に際しては、特殊な設備等を必要としないため、遺伝子の発現情報の解析等を低コストで迅速かつ正確に行うことできる。よって、本発明は、広く化学、医薬、医療産業等に有用なものである。

本発明の実施例１におけるスライドガラス上へのプローブ固定化の結果を示すグラフである。 本発明の実施例１におけるプローブへのカウンターオリゴＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。 本発明の実施例２におけるスライドガラス上へのプローブ固定化の結果を示すグラフである。 本発明の実施例２におけるプローブへのカウンターオリゴＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。 本発明の実施例３におけるスライドガラス上へのプローブ固定化の結果を示すグラフである。 本発明の実施例３におけるプローブへのカウンターオリゴＤＮＡのハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。

Claims (10)

1. 生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された該生体関連物質を定量する方法であって、
   試料が添加されるスポットは、添加する生体関連物質の量よりも過剰なプローブを含むものであることを特徴とする生体関連物質の定量方法。
2. 生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された生体関連物質を定量する方法であって、
   基板上の互いに異なるスポットには、異なる量のプローブが固定化されており、該プローブの固定化量に関わらず、該生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することを特徴とする生体関連物質の定量方法。
3. 前記互いに異なるスポットのうちの少なくとも一部が、添加する生体関連物質の量よりも過剰なプローブを含むスポットであることを特徴とする請求項２に記載の生体関連物質の定量方法。
4. 前記互いに異なるスポットを、プローブ濃度の異なる溶液を用いて作製することを特徴とする請求項２または３に記載の生体関連物質の定量方法。
5. 前記互いに異なるスポットを、プローブ溶液の基板上への付着回数を変化させて、作製することを特徴とする請求項２または３に記載の生体関連物質の定量方法。
6. 生体関連物質を含む試料を、プローブが固定化された基板上のスポットに添加し、該プローブに特異的に結合された生体関連物質を定量する方法であって、
   当該スポット内においては、固定化されたプローブ量が連続的に変化しており、該プローブの固定化量に関わらず、生体関連物質のプローブへの結合量が一定となっている値を測定することを特徴とする生体関連物質の定量方法。
7. 前記スポット内において、スポットの中心からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少していることを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質の定量方法。
8. 中心からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを、基板上の同一箇所にプローブ溶液を複数回付着させることにより作製することを特徴とする請求項７に記載の生体関連物質の定量方法。
9. 前記スポット内において、スポットの周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少していることを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質の定量方法。
10. 周辺部分からの距離に応じて、固定化されたプローブ量が連続的に減少しているスポットを、乾燥雰囲気中でプローブ溶液を二次元基板上へ付着させることにより作製することを特徴とする請求項９に記載の生体関連物質の定量方法。
    
    

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