JP2009524819A - 表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及びそのスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009524819A JP2009524819A JP2008552223A JP2008552223A JP2009524819A JP 2009524819 A JP2009524819 A JP 2009524819A JP 2008552223 A JP2008552223 A JP 2008552223A JP 2008552223 A JP2008552223 A JP 2008552223A JP 2009524819 A JP2009524819 A JP 2009524819A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- weight
- parts
- sol
- probe
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 166
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 57
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 30
- LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N tetramethyl orthosilicate Chemical compound CO[Si](OC)(OC)OC LFQCEHFDDXELDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 26
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 21
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 16
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XDJICGGEEMYEQS-UHFFFAOYSA-N 3-(2,3-dihydroxypropylsilyl)propane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)C[SiH2]CC(O)CO XDJICGGEEMYEQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004820 Pressure-sensitive adhesive Substances 0.000 claims description 7
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 7
- BFXIKLCIZHOAAZ-UHFFFAOYSA-N methyltrimethoxysilane Chemical compound CO[Si](C)(OC)OC BFXIKLCIZHOAAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- YUYCVXFAYWRXLS-UHFFFAOYSA-N trimethoxysilane Chemical compound CO[SiH](OC)OC YUYCVXFAYWRXLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- DENFJSAFJTVPJR-UHFFFAOYSA-N triethoxy(ethyl)silane Chemical compound CCO[Si](CC)(OCC)OCC DENFJSAFJTVPJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- ARYZCSRUUPFYMY-UHFFFAOYSA-N methoxysilane Chemical compound CO[SiH3] ARYZCSRUUPFYMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 abstract description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 abstract description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 84
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 48
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 10
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241001598984 Bromius obscurus Species 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000003891 environmental analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000011 protein activity measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002094 self assembled monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N trimethoxy-[3-(oxiran-2-ylmethoxy)propyl]silane Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCOCC1CO1 BPSIOYPQMFLKFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
- A47G—HOUSEHOLD OR TABLE EQUIPMENT
- A47G1/00—Mirrors; Picture frames or the like, e.g. provided with heating, lighting or ventilating means
- A47G1/02—Mirrors used as equipment
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F21—LIGHTING
- F21S—NON-PORTABLE LIGHTING DEVICES; SYSTEMS THEREOF; VEHICLE LIGHTING DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR VEHICLE EXTERIORS
- F21S2/00—Systems of lighting devices, not provided for in main groups F21S4/00 - F21S10/00 or F21S19/00, e.g. of modular construction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A47—FURNITURE; DOMESTIC ARTICLES OR APPLIANCES; COFFEE MILLS; SPICE MILLS; SUCTION CLEANERS IN GENERAL
- A47G—HOUSEHOLD OR TABLE EQUIPMENT
- A47G2200/00—Details not otherwise provided for in A47G
- A47G2200/08—Illumination
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/0061—The surface being organic
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00623—Immobilisation or binding
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00725—Peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/00756—Compositions, e.g. coatings, crystals, formulations
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Silicon Compounds (AREA)
Abstract
本発明は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法、前記方法によりスクリーニングされたゾル組成物及び前記ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップに関する。本発明によりスクリーニングされたゾル組成物はプローブと混合して既存のバイオアッセイに広く用いられる９６ウェルプレートに表面処理なしに集積することができ、固定されたプローブの変形が少なくて優れた分析結果が得られる。
Description
本発明は表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法、該方法によりスクリーニングされたゾル組成物及び該ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップに関する。
バイオチップは、ナノテクノロジー（ＮＴ）などの物質技術と、その技術のコンテンツ及び応用分野であるバイオテクノロジー（ＢＴ）と、結果を解析し且つ多量の結果を分析する情報テクノロジー（ＩＴ）と、が融合された代表的な技術である。バイオチップは様々な種類の生体物質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列（High-Density Microarraying）したものである。バイオチップの細部技術としては、生体物質を固定化する技術、固体状支持体を生体物質に馴染ませる技術、生体物質を微細配列する技術、製作されたチップ上において種々の生体反応を行うアッセイ技術、反応された結果を感知する技術、固定対象となる生体物質を製作するタンパク質工学、遺伝子組換え技術などが挙げられ、バイオチップはこれらの技術が集積された産物である。
バイオチップのうち代表的なプロテインチップは、種々のタンパク質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列したものである。プロテインチップを用いると、少量の試料により疾病の診断、高効率スクリーニング（ＨＴＳ）、酵素活性測定など様々な目的の実験を大規模で簡単に行うことができる。
既に商用化しているＤＮＡチップと同じ原理と技術要素を導入してプロテインチップを製作しようとする努力がなされている。一般に、商用化しているＤＮＡチップのほとんどは、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にＤＮＡを固定化して製作したものである。ＤＮＡチップの製作とほとんど同様な方法によりプロテインチップを製造する場合、すなわち、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にタンパク質を固定化してプロテインチップを製造する場合、固定される標的タンパク質の物理化学的な特性差により種々の問題が発生している。
初期のプロテインチップは、表面処理されたガラス基板の上にタンパク質をそのまま付着した後、簡単な結合分析を行うものであったが、固定化されたタンパク質の活性によって実際の性能が左右されて、本来の目的を達成するのに多くの難点があった(MacBeath and Schreiber, Science,289:1760, 2000)。このような問題点は、タンパク質が有する固有の物理化学的な特性差により発生するタンパク質の変性、不活性化、及び分解などにより引き起こされるものである。
このような問題点を克服するために、ＤＮＡとは区別されるタンパク質の特性に適するタンパク質付着表面処理技術及びタンパク質固定物質などへの研究がなされている。このような研究は、プロテインチップ表面の上に固定反応を引き起こすと同時に、タンパク質の活性を維持する方法を提供するのに焦点が合わせられている。その例として、パーキンエルマーのヒドロゲルコーティングスライド、プロリンクスのベルサリンクスチップ及びジオミックスのバイオチップであるＰＤＣチップなどが挙げられる。
特に、ヒドロゲルコーティングスライドは、３次元ポリアクリルアミドゲルを用いた技術であり、光学的に平らなシラン処理されたスイスガラスを基本支持物質として用い、その上に表面を変形させたアクリルアミド重合体を載置してタンパク質の結合力及び構造的な安定性を高めたものである。このとき、タンパク質はポリアクリルアミドゲル官能基との共有結合形成によって固定化されている。また、プロリンクスのベルサリンクチップはＴｉＯ３表面上にビオチン誘導体化されたポリ（Ｌ−リシン）−ｇ−ポリ（エチレングリコール）の自己組立単層を形成し、前記形成された単層にタンパク質を固定してタンパク質の活性を増大したものである。これらの方法は３次元微細構造を作って、変形された表面にタンパク質を共有結合などにより固定してスポット上のタンパク質活性を維持するのに有利である。このような方法の他に、微細加工を用いたマイクロウェル状のチップを作って、溶液状態のチップを製作することもある。
一方、ゾル−ゲル工程は、微細加工によって微細構造を作るのに用いられてきた技術であり、特に、無機物質に生体分子を化学的に付着する代わりに、穏やかな工程によって結合網を形成し、この結合網内に生体分子を共有結合以外の方法により固定化する技術である(Gill, I. and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000)。酵素をはじめとする多くの生体分子を塊状ゾル−ゲルマトリックス内に固定して、生体触媒やバイオセンサーの製作に用いられている(Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997)。特に、ゾル−ゲルの透明な光学的な性質のため、光学的な発色検出にも用いられている(Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994)。さらに、生体分子は、ゾル−ゲルに固定化されると、化学的及び熱的に極めて安定化されることが知られている(Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994)。
バイオセンサーの場合、ゾル−ゲル反応は単なる固定だけではなく、固体支持体の上に微細構造を形成してパターン化する方法として用いられている。このとき、パターン化方法は、流体力学を用いて液状であるゾル状態においてモールドにより成形してゲル化した後、モールドを除去してパターンを作ることである。例えば、毛細管内マイクロモジューリング（micro-moduling in-capillaries；ＭＩＭＩＣ）技法(Kim et al., J. Ferment.Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics, 38:5799, 1999)と呼ばれる技術は、メゾスコピックシリカをパターン化する技術であり、微視流体工学の基本的なパターン化に利用可能である。
しかしながら、タンパク質の活性はｐＨなどの種々の因子により影響されるため、ゾル−ゲル過程においてはゾル状態からタンパク質を添加して活性を維持する条件を設定することが重要である。このために、中性ｐＨなど種々の穏やかな条件を用いてタンパク質とゾルを予め混合してタンパク質をパターン化するなどの技術(Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 73:331, 2001)が発表されているが、中性ｐＨにおいてはゾル−ゲル過程が急激に進んでゲルとなるだけではなく、添加剤の選択によって亀裂が生じたり不透明になったりするなどの不都合がある。
本発明者らは上記の如きプロテインチップの短所を補完して、ゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを開発している（大韓民国公開特許１０−２００４−００２４５１０）。すなわち、従来は、タンパク質をはじめとする生体物質入りのゾル−ゲルマトリックスをスポット状にチップ基質の上に固定可能な技術が存在していなかったため、生体物質の固定されたゾル−ゲルマトリックスをスポット状に集積したバイオチップが存在していなかった。前記先行特許においては、チップ基質を特有のコーティング成分により表面処理する技術を開発することにより、チップ基質上におけるゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを最初に製造することができた。前記先行特許によるチップ基質表面処理技術によれば、生体物質入りのゾル混合物をスポット状にチップ基質の上に集積することができ、前記ゾル混合物をゲル化するゾル−ゲル反応がチップ基質上において誘起でき、ゾル−ゲルマトリックスをチップ基質の上に固定化することができる。特に、前記先行技術においては、チップ基質の表面に生体物質が共有結合により固定されている従来のバイオチップと異なり、生体物質が内部の気孔に捕集されてカプセル化されているゲル状のスポットがチップ基質の上に集積及び固定されているバイオチップを開発している。
しかしながら、前記バイオチップは生体物質入りのゲルスポットを基質の上に固定するために、ポリビニールアセテートなどのコーティング剤により基質を表面処理し、前記表面処理された基質の上にゾル混合物をスポッティングしなければならないため、費用面や大量生産の面から不利であり、コーティングできない表面や形状のバイオチップには適用することができないという限界がある。
そこで、本発明者らは、バイオチップの商用化のために従来の技術において必須とされていた表面処理をしていない基質の上にも強く結合可能なゾル−ゲルカプセル化に用いられる物質組成を見出すために鋭意努力した結果、効率よいゾル組成物スクリーニング方法を考案し、基質表面に強く結合してバイオチップの分析過程中の激しい洗浄に耐え、且つ、良好なアッセイ結果が得られるゾル組成物を見出し、本発明を完成するに至った。
《技術的課題》
従って、本発明の目的は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供するところにある。
従って、本発明の目的は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記方法によりスクリーニングされた、ＰＭＭＡ基質、ゴールドまたはシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップを提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップと、を含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、ＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
さらに、本発明は、ＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
本発明は、一観点において、次のステップを含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法に関する：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定してプローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定してプローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
本発明において、プローブは、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とし、前記表面処理されていない基質は、高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴としている。
本発明は、他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関するものである：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
前記組成物において、前記プローブはタンパク質であることを特徴とし、前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とし、前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴としている。
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
前記組成物において、前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とし、前記プローブはタンパク質であることを特徴としている。
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；
プローブ溶液 １２．５重量部。
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；
プローブ溶液 １２．５重量部。
本発明において、「表面処理」とは、本発明者らの先行特許（大韓民国特許公開１０−２００４−００２４５１０）に開示された用語であり、ゾル−ゲルバイオチップに用いられる基質の表面をポリビニールアセテートなどの高分子量の合成コーティング剤を塩化メチレン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒に溶解させたコーティング液によりコーティングすることを言う。
本発明によるバイオチップに固定可能な生体物質は標的物質と特異的に結合することができて、これらの間の結合を分析可能にするあらゆる物質が使用可能である。好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む核酸、タンパク質またはオリゴペプチドなどがある。なお、低分子物質及び天然物など種々の化合物質を固定化することもできる。
本発明を通じてチップ基質の表面に高密度で集積可能な生体物質のうちタンパク質の非制限的な例としては、HIV p24、Combo、RgpIII、HCV core、NS5、NS3、E1/E2、HBV surface antigen、antibody、IgG-Cy3をはじめとして、感染性疾病診断用の抗原若しくは抗体、またはＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１−１、glypecanをはじめとする癌診断用の抗原若しくは抗体、活性測定に用いられる酵素がある。また、タンパク質、抗原、抗体だけではなく、新薬開発に用いられる低分子物質及び自生植物、微生物、カビ、漢方薬などの天然物もゾル組成物に入れて固定化可能である。
本発明はスクリーニングにより選択された組成により製造されたゾル混合物を９６ウェルプレートタイプ基板を用いてコーティングなしにスポットを固定化するものであり、前記固定化されたバイオチップを新たな機器の導入なしに既存の免疫検査自動化機器を用いて診断検査することができ、その過程を図１に示す。９６ウェルプレートの場合にはいかなる製造社製の高分子プレートを用いてもかまわないが、非制限的に、ＮＵＮＣ、ＳＰＬ社の９６ウェルプレートを用いてスポットを固定してチップを製作した。また、自動化機器は、図１に示すように、Ａｂｏｔｔ社製のＡｘｙｍ、Ｒｏｃｈｅ社製の機器などと互換的に使用可能である。
プロテインチップの場合、スポットの直径は約１００〜５００μｍであることが好ましく、ウェル当たりに１〜１０００本のスポットを集積することが好ましい。下記の実施例においては、１００スポット／ｃｍ２のチップを製作しているが、高集積時には１，０００スポット／ｃｍ２まで製作可能である。
本発明においてゾル−ゲル反応により製造されたバイオチップの場合、反応時間が長かった免疫診断方法や既存のバイオチップ診断方法に比べて、３０分から２時間内に反応結果を得ることができる。
本発明により製造されたプロテインチップは、免疫診断方法によるサンドイッチアッセイ方法と同様に抗原を蛍光染色体により標識して診断に用いることができる。このとき、結果を測定するステップにおいて蛍光スキャナーを用い、プログラムによって診断結果を分析して定量化することができる。本発明により製作されたプロテインチップは、非制限的なＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどの酵素免疫診断方法に代えうるものである。
本発明のゾル組成物は溶液状態において生体物質を添加することができるため、タンパク質または低分子物質を高集積することができ、これにより、製造されたバイオチップを用いて高効率のスクリーニング（ＨＴＳ）が行える。また、ゾル混合物にタンパク質活性測定に用いられる酵素の集積が可能であるため、これにより製造されたバイオチップは酵素活性測定に用いることができる。前記活性測定用の酵素には毒性分析、環境分析、食品菌分析に用いられる酵素がある。このため、本発明による９６ウェル型バイオチップは疾病診断に応用することができ、新薬開発の基盤技術だけではなく、環境及び毒性分析に使用可能である。
図１は、本発明による９６ウェルプレート型バイオチップを用いた分析方法を示すものである。本発明においては、用いられる９６ウェルプレートに表面処理なしに安定してゾル組成物を固定化して既存の免疫学的な診断機器を同様に用いて分析することができる。
また、本発明によるゾル組成物は既に開発されているバイオセンサーに適用して感度を高めることができる。高分子だけではなく、金をはじめとする金属表面、シリコンをはじめとする半導体表面、透明な高分子表面、鏡をはじめとするガラス表面などに固定化して感度を高めることができる。検出をし易くするために、標的物質には蛍光染料などの信号誘発物質を付着することが好ましい。生体物質と標的物質との間の結合に対する検出は標的物質に付ける信号誘発物質を付着する基板の性質によって、蛍光検出法、電気化学的検出法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法または光学的な性質差を用いた検出法など種々の方法により行うことができる。
本発明のゲル組成物を用いると、１ウェルの上に最大１０００個以上のスポットに種々のタンパク質、抗原及び抗体だけではなく、低分子物質、バクテリアなどを集積することができる。本発明は代表的に採血時に輸血適合性（感染疾患マーカー、例、ＨＩＶＩ、ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、マラリア、H.pylori、Syphillisなど）をスクリーニングする血液銀行スクリーニングに利用できるだけではなく、通常の癌の診断マーカーと特定癌の診断マーカーを一括して集積して診断することができる。更に、各種の金属、半導体基板を用いて既存の蛍光ラベルなしに疾病及び菌を検出可能なＰＯＣＴなどの製品群を開発することができる。また、環境汚染、特に、水質汚染などに敏感なマーカーを一括して集積して水質汚染を一度に見出すこともできる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
＜実施例１：基質及び生体物質に特異的であり、且つ、基質上に直接的に固定可能なゾル組成物のスクリーニング＞
表面処理していない基質に直接的に固定しても強い洗浄に耐えながらバイオチップとして製作時に優れた物理的特性を有するゾル−ゲル組成物を本発明のスクリーニング方法（図２）により素早く選別した。図２は、表面処理していない基質上にスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートであり、図３は、前記スクリーニングにおいて選択された組成と脱落された組成の例を示すものである。脱落された組成は表面処理なしではタンパク質などバイオ物質を固定化することができず、洗浄過程において全て脱落していることが分かる。
表面処理していない基質に直接的に固定しても強い洗浄に耐えながらバイオチップとして製作時に優れた物理的特性を有するゾル−ゲル組成物を本発明のスクリーニング方法（図２）により素早く選別した。図２は、表面処理していない基質上にスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートであり、図３は、前記スクリーニングにおいて選択された組成と脱落された組成の例を示すものである。脱落された組成は表面処理なしではタンパク質などバイオ物質を固定化することができず、洗浄過程において全て脱落していることが分かる。
まず、シリケート単量体をベースとする約１００，０００の組成のゾル組成物のうち前記ゾル組成物を基質にスポッティングしたとき、分析過程の洗浄に耐えうる強い接着性、スポットの形状を一定に維持可能な物性、ゲル化にかかる時間、光学的透明性、低い自己蛍光性を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット直径を有しながら元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する、合計で７００種類のゾル組成物を１次スクリーニングした。
前記７００種類のゾル組成物のうち、生体物質の固定化収率、免疫判読時の感度などを考慮して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上である組成物を選択した。
最終的に、生体物質が低分子物質、タンパク質及び抗体である場合、それぞれ組成２種類、組成７種類の及び組成８種類の組成物を得た。
本発明によるゾル組成物のスクリーニング方法をより具体的に説明する。
ゾル組成物の１次スクリーニング
シリケート単量体（ＴＭＯＳ、ＭＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、ＴｒＥＯＳ、ＴＭＳ、ＭＴＭＳ及び３−ＡＴＭＳ）、中間体（ＰＧＳ及びＤＧＳ）及び添加剤（ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵ、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００及びＰＥＧ８０００）を１０ｍＭＨＣｌ溶液に種々の組成により添加した。最終的に、各組成に他のｐＨ（４−９）、濃度（０−５００ｍＭ）及び塩（カリウム及びアンモニウム）を有するバッファを添加した。その結果、１００，０００個以上の組成が得られ、これらの組成を市販中のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）プレートに集積し、接着性、スポットの外観、ゲル化時間、透過度及びバックグラウンドなどを試験した。
シリケート単量体（ＴＭＯＳ、ＭＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、ＴｒＥＯＳ、ＴＭＳ、ＭＴＭＳ及び３−ＡＴＭＳ）、中間体（ＰＧＳ及びＤＧＳ）及び添加剤（ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵ、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００及びＰＥＧ８０００）を１０ｍＭＨＣｌ溶液に種々の組成により添加した。最終的に、各組成に他のｐＨ（４−９）、濃度（０−５００ｍＭ）及び塩（カリウム及びアンモニウム）を有するバッファを添加した。その結果、１００，０００個以上の組成が得られ、これらの組成を市販中のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）プレートに集積し、接着性、スポットの外観、ゲル化時間、透過度及びバックグラウンドなどを試験した。
接着性は、洗浄後のスポットの激しいスクラッチにより試験し、激しい洗浄（１０％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍにおいて５分間３回洗浄）後、チップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落しない組成を選択した。スポットの外観は光学顕微鏡により直接的に観察して円形を維持し、スポット直径が１００〜８００μｍであるものを選択した。ゲル化にかかる時間はチューブ及びスポット上の両方において測定し、チューブ内において４時間以上、スポットにおいて１時間以上のゲル化時間を示す組成を選択した。光学透過率はレーザースキャナーを用いてバックグラウンドよりも低い自己蛍光性を有すると認められた組成を選択した（GenePix 4100, Axon Instrument）。
最適組成の選択
前記１次スクリーニング組成物を用いて、洗浄過程の前後に各組成のスポット固定化率をＣｙ−３により標識された固定化されたペプチド、ＢＳＡタンパク質及び抗体の信号を比較して測定した。活性分析のために、前記１次スクリーニング組成物にＢＳＡタンパク質（５００ｎｇ／μＬ）を添加し、最終混合液をタンパク質と共にＰＭＭＡスライド型プレートに集積した。前記スライドをＣｙ−３により標識されたＢＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）と３０分間反応させた後、反応の終わったスライドを洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ））により激しく洗浄した後に乾燥した。シグナルの感度を分析するために、前記スライドのスポットをスキャンし、GenePix Pro４．０ソフトウェア（Axon Instrument）を用いてシグナル値に対するバックグラウンド値を定量してシグナルの感度を分析した。
前記１次スクリーニング組成物を用いて、洗浄過程の前後に各組成のスポット固定化率をＣｙ−３により標識された固定化されたペプチド、ＢＳＡタンパク質及び抗体の信号を比較して測定した。活性分析のために、前記１次スクリーニング組成物にＢＳＡタンパク質（５００ｎｇ／μＬ）を添加し、最終混合液をタンパク質と共にＰＭＭＡスライド型プレートに集積した。前記スライドをＣｙ−３により標識されたＢＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）と３０分間反応させた後、反応の終わったスライドを洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ））により激しく洗浄した後に乾燥した。シグナルの感度を分析するために、前記スライドのスポットをスキャンし、GenePix Pro４．０ソフトウェア（Axon Instrument）を用いてシグナル値に対するバックグラウンド値を定量してシグナルの感度を分析した。
その結果、表１に示すように、前記１次スクリーニングゾル組成物のうち２つの組成物において混合された低分子物質に対して７０％以上の固定化率を示し、７個の組成物において混合されたタンパク質に対して８０％以上の固定化率を示し、８個の組成物において抗体に対して約９０％の固定化率を示している。
表面分析
スポットの表面はＳＥＭ（Ｓ−４８００ＳＥＭ、Hitachi Co.）を用いて観察した。ＳＥＭ観察のために伝導性コーティングはスポットが完全にゲル化された後、イリジウムターゲット（〜２０ｎｍの厚さ）によりイオンビームスパッターコーターを用いて行った。気孔の孔径はイメージ分析ソフトウェア（Image-Pro Plus, MediaCybernetics）を用いて測定した。気孔の数は９個の異なるエリア（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）を測定し、平均気孔密度は［Σ気孔面積］／［全体の面積（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）］として計算した。
スポットの表面はＳＥＭ（Ｓ−４８００ＳＥＭ、Hitachi Co.）を用いて観察した。ＳＥＭ観察のために伝導性コーティングはスポットが完全にゲル化された後、イリジウムターゲット（〜２０ｎｍの厚さ）によりイオンビームスパッターコーターを用いて行った。気孔の孔径はイメージ分析ソフトウェア（Image-Pro Plus, MediaCybernetics）を用いて測定した。気孔の数は９個の異なるエリア（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）を測定し、平均気孔密度は［Σ気孔面積］／［全体の面積（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）］として計算した。
溶液内における内部スポットの分析
内部スポットイメージはTappingModeTM AFM(MultiMode SPM, Nanoscope IIIa, Vecco Instrument)を用いて大気中において測定した。スポットの切断は垂直マイクロトームを用いて行った。
内部スポットイメージはTappingModeTM AFM(MultiMode SPM, Nanoscope IIIa, Vecco Instrument)を用いて大気中において測定した。スポットの切断は垂直マイクロトームを用いて行った。
スポットスキャンプロファイルの分析
スポットイメージは共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）を用いて標準反射形態を通じて測定した。スポットの中央に対するスキャンプロファイルは厚さが６３μｍ以下、直径が３８０μｍ以下と測定された。
スポットイメージは共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）を用いて標準反射形態を通じて測定した。スポットの中央に対するスキャンプロファイルは厚さが６３μｍ以下、直径が３８０μｍ以下と測定された。
免疫分析後のスポット内部のタンパク質と抗体の分布を測定するために、ＣＬＳＭ（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）により内部スポットの垂直断層撮影イメージを撮影した。ステッピングモーターを用いたｚ軸の最大解像度は５０ｎｍであり、スキャンモジュールを用いたｘｙ軸の最大解像度は×１００及び×４０であった。ＣＬＳＭを撮影するために、まず、ｐ２４タンパク質を含むマイクロスポットをガラススライドに集積し、前記ｐ２４タンパク質を含むスポットが集積されたスライドをｐ２４抗体と１時間かけて反応させた後、激しく洗浄した。その後、Ｃｙ３により標識された２次抗体と３０分かけて反応させた後、洗浄し且つ乾燥して、ＣＬＳＭイメージを撮影した。
プローブと目的物質との間の特異性及び活性測定
ゾル−ゲル基質上においてタンパク質−タンパク質相互作用の特異性と活性を測定するために、ＨＩＶ抗原タンパク質であるｐ２４タンパク質を表２の組成ＩＶのゾル組成物と混合して固定化した。ｐ２４タンパク質に対応するＨＩＶ抗体を含む血清の順次的希釈液により免疫分析を行った。同時に、ＨＩＶ抗体の非特異吸着を確認するために、ＢＳＡタンパク質はゾル−ゲル基質内において同じチップに固定した。タンパク質が添加されていないゾル組成物のスポットと関連性のないタンパク質（４−１ＢＢ）を反応させたときに発生する非特異的な相互作用は極めて低く現れた。しかしながら、ＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗原に対するＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗体とは正確なスポットにおいて特異的な相互作用を示した。
ゾル−ゲル基質上においてタンパク質−タンパク質相互作用の特異性と活性を測定するために、ＨＩＶ抗原タンパク質であるｐ２４タンパク質を表２の組成ＩＶのゾル組成物と混合して固定化した。ｐ２４タンパク質に対応するＨＩＶ抗体を含む血清の順次的希釈液により免疫分析を行った。同時に、ＨＩＶ抗体の非特異吸着を確認するために、ＢＳＡタンパク質はゾル−ゲル基質内において同じチップに固定した。タンパク質が添加されていないゾル組成物のスポットと関連性のないタンパク質（４−１ＢＢ）を反応させたときに発生する非特異的な相互作用は極めて低く現れた。しかしながら、ＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗原に対するＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗体とは正確なスポットにおいて特異的な相互作用を示した。
表２には、本発明によりスクリーニングされた７種類のタンパク質固定化用のゾル組成物の性質を示す。組成０はＴＭＯＳとＭＴＭＳのみよりなる比較組成物である。
タンパク質固定化に用いられる前記７種類の組成のうち、組成ＩＶがシグナル及びシグナル／バックグラウンドの割合において最も良好な結果を示した。前記組成ＩＶは他の組成と比較したとき、低いＴＭＯＳ比を有し、高い分子量のＰＥＧが添加された組成であり、高い気孔密度と非特異的な抗体含有率が低かった。
＜実施例２：９６ウェルプレート上に固定されたゾル−ゲルプロテインチップスポットの固定化を通じての酵素免疫学的疾病の診断＞
この実施例においては実施例１において選定されたゾル組成物を肝炎診断に用いて現在用いられている肝炎診断用のＥＬＩＳＡ自動診断プロセスを用いて測定した。前記自動診断プロセスは激しい洗浄過程を含んでいるため、前記スクリーニングされた組成のうちスポットが強い接着性を示し、洗浄後にもスポット特有の円形を維持可能な組成を用いた。この実施例において用いたゾル組成は形成されたスポットがAbbott Axsym及びRoche Elecsys機構を用いた物理的なスクラッチにも耐えうるように最適化した。
この実施例においては実施例１において選定されたゾル組成物を肝炎診断に用いて現在用いられている肝炎診断用のＥＬＩＳＡ自動診断プロセスを用いて測定した。前記自動診断プロセスは激しい洗浄過程を含んでいるため、前記スクリーニングされた組成のうちスポットが強い接着性を示し、洗浄後にもスポット特有の円形を維持可能な組成を用いた。この実施例において用いたゾル組成は形成されたスポットがAbbott Axsym及びRoche Elecsys機構を用いた物理的なスクラッチにも耐えうるように最適化した。
この実施例においては、このような過程によって選択された組成のうち、９６ウェルプレートの材質がプラズマ処理されたＰＭＭＡである場合に、固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合はＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
１７．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。５〜１５重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜１５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
タンパク質溶液としては、ＨＩＶ抗原であるＰ２４タンパク質を用いて９６ウェルプレート上にゾル−ゲルスポットを集積した。その結果、図４に示すように、ＨＩＶｐ２４タンパク質にのみ特異的に反応することが分かり、図示の４個のサンプルは全てＨＩＶ陽性であった。前記ゾル−ゲル混合物を用いて前記プラズマ処理されたＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレート上にタンパク質を強く３次元的に固定化することができ、前記バイオチップを用いて既存の診断の自動化機器及びアッセイ方法を活用して抗原−抗体反応の結果を確認することができた。
また、プラズマ処理していない市販中のＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合は全体の混合物のうちＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
２２．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。７．５〜１０重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
前記最適化された組成物とＨＣＶ抗原を混合してプラズマ処理していないＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに集積させたバイオチップを用いてＲｏｃｈｅ ＨＣＶ ＥＩＡキットにより７９名の患者（陰性２５名、陽性５４名）を対象として試験した。図５は、患者１２名の血液分析結果を示すものである。その結果、既存のＥＬＩＳＡ方法を用いた結果と１００％一致し、本発明のバイオチップが高い結果の再生性を有することが分かった。本発明によるバイオチップは高い遂行能力、高い感度、多い処理量及び高い正確性を有し、安価で測定可能であるために既存のＥＬＩＳＡ診断方法に代えうるものであることが分かった。また、既存の免疫診断よりも多量のタンパク質を固定化することにより既存の診断法よりも偽陽性を低減することができ、正確な肝炎診断を行うことができた。
また、本発明のバイオチップを用いて定量的な分析を行うことができるかどうかを調べるために、患者検体の連続した希釈によって検出限界及び定量範囲実験を行った（図６）。その結果、定量的な分布を示すことを確認した。この結果から、本発明によるバイオチップを用いる場合、既存の免疫診断法において測定できなかった定量的な分析も行うことができるということを確認することができた。
＜実施例３：ゴールドチップ基質を用いたバイオチップの製作及び分析＞
この実施例においてはＳＰＲｉシステムに用いられるゴールド（Ａｕ）チップを用いて実施例１の方法と同様にしてゴールドチップ基質に固定化されるゾル組成を見出した。ゴールドチップの場合、固定化されるゾル組成に添加剤として粘着剤（１０１０、１０２０；ＬＧ化学、大韓民国）を添加した。ゾル混合物はスポッティングされた後、ガラスのように透明で且つ気孔を有する物質から変形されるが、Ａｕにより表面がコーティングされたゴールドチップの上には固定化が起こらなかった。この実施例においては、ゴールドチップの表面にゾルスポットを固定するために添加剤を用い、用いたゾル混合物の組成はＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤（１０１０、１０２０など）、０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
この実施例においてはＳＰＲｉシステムに用いられるゴールド（Ａｕ）チップを用いて実施例１の方法と同様にしてゴールドチップ基質に固定化されるゾル組成を見出した。ゴールドチップの場合、固定化されるゾル組成に添加剤として粘着剤（１０１０、１０２０；ＬＧ化学、大韓民国）を添加した。ゾル混合物はスポッティングされた後、ガラスのように透明で且つ気孔を有する物質から変形されるが、Ａｕにより表面がコーティングされたゴールドチップの上には固定化が起こらなかった。この実施例においては、ゴールドチップの表面にゾルスポットを固定するために添加剤を用い、用いたゾル混合物の組成はＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤（１０１０、１０２０など）、０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
１６．２〜１８．７重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。３．７〜６．２重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。１３．７〜１６．２重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
前記混合物をゴールドチップの上に実施例２及び３の方法と同様にしてスポッティングした後、ｐ２４タンパク質に対するアッセイを行った。ゴールドチップアッセイと前記９６ウェルプレートに固定されたバイオチップのアッセイとの相違点は、抗体反応時に１次抗体反応を行い、蛍光標識された２次反応なしに結果を検出することができるということである。１次反応させたゴールドチップの結果はＳＰＲシステムを用いて反応時に発生する共鳴変化により測定してイメージ化することにより判読することができた（図７）。前記ゴールドチップは多量のタンパク質を固定化することができ、化学標識なしに直接的にタンパク質−タンパク質の結合を検出することができて高い感度を有する。
＜実施例４：半導体チップ上におけるスポットの固定化及び電気化学的検出＞
この実施例は電気化学的測定に用いられる半導体チップの両極の間に伝導性を有するゾル混合物を固定化してその間にできた反応前後の電気的な抵抗差を測定して反応をモニターリングするシステムに関する。用いた金属表面はシリコンウェーハであって電極に最も多用されるものであるが、表面が極めて均一で且つ平滑であるために従来は、表面処理なしに高分子物質を付着することが困難であった。しかしながら、実施例１の方法により電極に固定化されるゾル組成物をスクリーニングし、前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４を混合して半導体ウェーハの上に固定化した。
この実施例は電気化学的測定に用いられる半導体チップの両極の間に伝導性を有するゾル混合物を固定化してその間にできた反応前後の電気的な抵抗差を測定して反応をモニターリングするシステムに関する。用いた金属表面はシリコンウェーハであって電極に最も多用されるものであるが、表面が極めて均一で且つ平滑であるために従来は、表面処理なしに高分子物質を付着することが困難であった。しかしながら、実施例１の方法により電極に固定化されるゾル組成物をスクリーニングし、前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４を混合して半導体ウェーハの上に固定化した。
この実施例において用いられた半導体チップ用のゾル組成物の組成は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部であった。
前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４が固定されている半導体チップを用いて反応前後の電気的な抵抗差を電気化学的な測定法により測定した結果、図８に示すように、感度がかなり向上しただけではなく、バックグラウンドのノイズの割合を低減できることを確認することができた。このため、この実施例による半導体チップは安価で且つ小型のバイオチップ分析システムの製作に有用である。
以上述べたように、本発明は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する効果がある。また、本発明は、前記方法によりスクリーニングされたＰＭＭＡ基質、ゴールド及びシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物を用いて製造されたゾル−ゲルバイオチップを提供する効果がある。本発明によるバイオチップはバイオアッセイに広く用いられる９６ウェルプレートに生体物質が含有されたゲル状のスポットを直接的に固定して既存の反応システム及び分析システムを利用することができ、便利で且つ経済的であり、固定された生体物質の変形が少なくて優れた分析結果が得られる。特に、蛍光分析の他にプローブのない分析方法を用いる場合、既存の分析方法の問題であった感度問題を３次元ゾル−ゲルスポットを強く結合することにより解決することができ、ＰＯＣＴなどの技術開発に有用であることが期待される。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
Claims (18)
- 次のステップを含む表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップ；
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップ；
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップ；及び
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップ；及び
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。 - 前記標識物質は抗原、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記表面処理されていない基質は高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。 - 前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載のゾル組成物。
- ＰＭＭＡ基質に請求項４又は５に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
- 次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。 - 前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載のゾル組成物。
- 前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とする請求項８に記載のゾル組成物。
- ＰＭＭＡ基質に請求項７又は８に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
- 前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴とする請求項１０に記載のゾル−ゲルバイオチップ。
- 次の成分を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。 - 前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
- 前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
- 表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
- 次の成分を含む、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；及び
プローブ溶液 １２．５重量部。 - 前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載のゾル組成物。
- 表面処理されていないシリコンウェーハに請求項１６又は１７に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060008926A KR100784437B1 (ko) | 2006-01-27 | 2006-01-27 | 표면처리 되지 않은 기질에 표지물질을 고정하기 위한졸-겔 바이오칩용 졸 조성물 및 그의 스크리닝 방법 |
| KR10-2006-0008926 | 2006-01-27 | ||
| PCT/KR2007/000390 WO2007086671A1 (en) | 2006-01-27 | 2007-01-23 | Sol composition for sol-gel biochip to immobilize probe on substrate without surface treatment and method for screening thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009524819A true JP2009524819A (ja) | 2009-07-02 |
| JP5538726B2 JP5538726B2 (ja) | 2014-07-02 |
Family
ID=38309417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008552223A Active JP5538726B2 (ja) | 2006-01-27 | 2007-01-23 | 表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及びそのスクリーニング方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9476876B2 (ja) |
| EP (1) | EP1982184B1 (ja) |
| JP (1) | JP5538726B2 (ja) |
| KR (1) | KR100784437B1 (ja) |
| DK (1) | DK1982184T3 (ja) |
| ES (1) | ES2462549T3 (ja) |
| PT (1) | PT1982184E (ja) |
| WO (1) | WO2007086671A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012121394A1 (ja) * | 2011-03-10 | 2012-09-13 | 国立大学法人静岡大学 | 置換芳香族化合物、ヒドロゲル化剤、ヒドロゲル、及び水系試料のゲル化方法 |
| JP2014513797A (ja) * | 2011-04-27 | 2014-06-05 | ピーシーエル インコーポレイテッド | バイオチップ製造用ゾル−ゲルキット及びこれを利用したバイオチップの製造方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100866524B1 (ko) | 2007-05-23 | 2008-11-03 | 전남대학교산학협력단 | 형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를이용한 검출키트 및 방법 |
| JP5649073B2 (ja) * | 2009-03-03 | 2015-01-07 | 国立大学法人静岡大学 | ヒドロゲル化剤 |
| KR100984735B1 (ko) * | 2009-05-28 | 2010-10-01 | 동국대학교 산학협력단 | 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법 |
| KR101274765B1 (ko) * | 2011-04-27 | 2013-06-14 | 피씨엘 (주) | 바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법 |
| PL2518503T3 (pl) * | 2011-04-28 | 2016-09-30 | Zestaw zol-żel do otrzymywania biochipa i sposób otrzymywania biochipa z jego zastosowaniem | |
| US9140633B2 (en) | 2011-06-03 | 2015-09-22 | Ut-Battelle, Llc | Enhanced spot preparation for liquid extractive sampling and analysis |
| KR101569891B1 (ko) | 2012-02-13 | 2015-11-27 | 동국대학교 산학협력단 | 다공성 지지체를 이용한 저분자 포집용 졸-겔 칩 및 이를 이용한 저분자 특이적 물질의 스크리닝 방법 |
| US20210164871A1 (en) * | 2018-05-03 | 2021-06-03 | Noul Co., Ltd. | Specimen inspecting method |
| KR102131844B1 (ko) * | 2018-10-22 | 2020-07-08 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | 인플루엔자와 중동호흡기증후군을 동시에 검출하는 방법 및 키트 |
| JP2023551327A (ja) | 2020-11-30 | 2023-12-07 | ピーシーエル インコーポレイテッド | 血液由来エクソソームから見出した新規アルツハイマー病診断用バイオマーカー及びそれを用いたアルツハイマー病診断方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020028506A1 (en) * | 2000-09-04 | 2002-03-07 | Chih-Wei Ho | High-density functional slide and preparation method thereof |
| WO2004048603A2 (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-10 | University Of Warwick | Coatings |
| WO2004092250A1 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Biogenon Ltd. | Biocompatible material |
| US20050053954A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-03-10 | Brennan John D. | Multicomponent protein microarrays |
| JP2005539215A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | エルジー ケム． エルティーディ． | チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ |
| US20060223167A1 (en) * | 2003-05-06 | 2006-10-05 | Patrick Chaton | Biochip support comprising thin layers of sol-gel material and production method thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6632617B1 (en) * | 1997-05-13 | 2003-10-14 | Incyte Corporation | Tumor-associated antigen |
| KR100577694B1 (ko) | 2003-12-10 | 2006-05-10 | 학교법인 서강대학교 | 졸-겔 법을 이용한 단백질 칩의 제조방법 |
-
2006
- 2006-01-27 KR KR1020060008926A patent/KR100784437B1/ko active IP Right Grant
-
2007
- 2007-01-23 WO PCT/KR2007/000390 patent/WO2007086671A1/en active Application Filing
- 2007-01-23 ES ES07708571.0T patent/ES2462549T3/es active Active
- 2007-01-23 DK DK07708571.0T patent/DK1982184T3/da active
- 2007-01-23 PT PT77085710T patent/PT1982184E/pt unknown
- 2007-01-23 EP EP07708571.0A patent/EP1982184B1/en active Active
- 2007-01-23 US US12/162,412 patent/US9476876B2/en active Active
- 2007-01-23 JP JP2008552223A patent/JP5538726B2/ja active Active
-
2016
- 2016-03-09 US US15/065,494 patent/US10191045B2/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020028506A1 (en) * | 2000-09-04 | 2002-03-07 | Chih-Wei Ho | High-density functional slide and preparation method thereof |
| JP2005539215A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | エルジー ケム． エルティーディ． | チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ |
| US20050053954A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-03-10 | Brennan John D. | Multicomponent protein microarrays |
| WO2004048603A2 (en) * | 2002-11-25 | 2004-06-10 | University Of Warwick | Coatings |
| WO2004092250A1 (en) * | 2003-04-15 | 2004-10-28 | Biogenon Ltd. | Biocompatible material |
| US20060223167A1 (en) * | 2003-05-06 | 2006-10-05 | Patrick Chaton | Biochip support comprising thin layers of sol-gel material and production method thereof |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012121394A1 (ja) * | 2011-03-10 | 2012-09-13 | 国立大学法人静岡大学 | 置換芳香族化合物、ヒドロゲル化剤、ヒドロゲル、及び水系試料のゲル化方法 |
| US9115164B2 (en) | 2011-03-10 | 2015-08-25 | National University Corporation Shizuoka University | Substituted aromatic compound, hydrogelation agent, hydrogel, and method for gelating aqueous sample |
| JP2014513797A (ja) * | 2011-04-27 | 2014-06-05 | ピーシーエル インコーポレイテッド | バイオチップ製造用ゾル−ゲルキット及びこれを利用したバイオチップの製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1982184E (pt) | 2014-07-08 |
| US10191045B2 (en) | 2019-01-29 |
| US9476876B2 (en) | 2016-10-25 |
| DK1982184T3 (da) | 2014-06-23 |
| US20160334400A1 (en) | 2016-11-17 |
| WO2007086671A1 (en) | 2007-08-02 |
| US20090227466A1 (en) | 2009-09-10 |
| JP5538726B2 (ja) | 2014-07-02 |
| EP1982184A4 (en) | 2009-04-29 |
| EP1982184A1 (en) | 2008-10-22 |
| EP1982184B1 (en) | 2014-03-26 |
| ES2462549T3 (es) | 2014-05-23 |
| KR100784437B1 (ko) | 2007-12-11 |
| KR20070078556A (ko) | 2007-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5538726B2 (ja) | 表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及びそのスクリーニング方法 | |
| JP4307380B2 (ja) | チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ | |
| CN1125342C (zh) | 用于生物反应的高度特异性的表面,制备它们的方法及其使用方法 | |
| EP1307743B1 (en) | Colloid compositions for solid phase biomolecular analytical systems | |
| WO2001014425A1 (en) | Multipurpose diagnostic systems using protein chips | |
| CA2338401A1 (en) | Optical disc-based assay devices and methods | |
| US20180327824A1 (en) | Microarrays | |
| Qi et al. | Phage M13KO7 detection with biosensor based on imaging ellipsometry and AFM microscopic confirmation | |
| TW201310016A (zh) | 生物檢測晶片及其製造方法 | |
| CN1343887A (zh) | 基于自身抗体谱抗原微阵列的制作方法 | |
| US20030003480A1 (en) | Reactive solid support and DNA fragment detection tool | |
| JP4230126B2 (ja) | 生物学的素材チップ | |
| CA2804103A1 (en) | A planar support having an ultraflat surface and a device for detecting antigens comprising said planar support | |
| CN1261669A (zh) | 一种蛋白和基因检测板及其制备方法和应用 | |
| JP2005283351A (ja) | 蛋白質固定化方法 | |
| JP2003014742A (ja) | 生物学的素材チップ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100118 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100308 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20110531 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20110601 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110601 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110712 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111012 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111019 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120112 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120626 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121026 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20121213 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20130125 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130821 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130826 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140312 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5538726 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140430 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |