TW201310016A - 生物檢測晶片及其製造方法 - Google Patents

Abstract

本案係關於一種生物檢測晶片及其製造方法，該生物檢測晶片包括：一基材；一光阻圖案層，係形成於該基材之一表面；一阻斷層，係形成於該基材之該表面未被該光阻圖案層覆蓋之區域；一鍵結層，係以共價鍵結方式形成於該光阻圖案層上；一銜接分子，係以共價鍵結方式與該鍵結層結合；以及一探針分子，係以共價鍵結方式與該銜接分子結合，用以與一待測分子進行反應。

Description

生物檢測晶片及其製造方法

本案係關於一種生物檢測晶片及其製造方法，尤指一種微陣列之生物檢測晶片及其製造方法。

生物檢測晶片（biochip）是一種微型裝置，利用微電子技術將儀器微小化，然後在微小化後的裝置上放置特定的生物材料（例如核酸或蛋白質），這些生物材料可以與其他預測生物樣品發生特異性的生化反應，反應後的訊號可經各種感應器或感應物質定量，進而得知生物反應。此種利用微電子、微流體及生物技術所製出的微型裝置稱之為生物檢測晶片，它結合了各層面的專業領域，如醫學診斷、基因探針、製藥、生物技術、微機電、半導體及電腦等領域發展而成的。

生物檢測晶片通常以矽晶片、玻璃或高分子為基材（substrate），以微小化技術整合生物有機分子如核酸或蛋白質為生化探針，用來檢測或分析生物性分子。生物檢測晶片的體積小、反應快速並且能夠平行分析大量生物資訊，因此適用於生化處理、分析、檢驗、新藥開發及環境監測等用途上。生物晶片大致上可分為兩大類，一為著眼於功能整合的處理型晶片（lab-on-a-chip)，二為能獲得大量資訊的微陣列晶片（microarray)。微陣列晶片因其探針種類不同又可分為基因晶片（gene chip）及蛋白質晶片（protein chip）兩種，主要是將不同的DNA或蛋白質分子，以數百微米的間距，密集地固定排列在數平方公分的面積上做為探針，待檢測的生物樣品經過處理後與晶片上的探針進行反應，產生的訊號由掃瞄儀器與分析儀器判讀，如此便可以在短時間內一次提供大量的基因序列或蛋白質表現之相關訊息。

生物檢測晶片是半導體積體電路製程技術應用在生物醫學科學研究非常成功的實例。傳統的生物檢測晶片在基材上形成一層光阻圖案層後，便直接在其表面結合生物材料用以檢測待測物，但此種作法可能因生物材料與光阻之結合力不足，導致檢測上的不精準及穩定性不足等問題，因此，如何發展一種可改善習知技術缺失的生物檢測晶片，實為目前迫切需解決之問題。

本案之主要目的在於提供一生物檢測晶片及其製造方法，俾解決習用生物檢測晶片檢測不精準及穩定性不足之問題，並同時達到成本降低及製程方便快速之目的，使生物檢測晶片之應用更加廣泛。

為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種生物檢測晶片，至少包括：一基材；一光阻圖案層，係形成於該基材之一表面；一阻斷層，係形成於該基材之該表面未被該光阻圖案層覆蓋之區域；一鍵結層，係以共價鍵結方式形成於該光阻圖案層上；至少一銜接分子，係以共價鍵結方式與該鍵結層結合；以及一探針分子，係以共價鍵結方式與該銜接分子結合，用以與一待測分子進行反應。

根據本案之構想，該基材係為玻璃、矽晶片或塑膠。該光阻圖案層成分較佳為SU-8光阻，該光阻圖案層每一點之直徑大小為10至300μm，且該光阻圖案層較佳係利用無光罩微影技術所形成。該阻斷層成分較佳為二甲基二氯矽烷（dimethyldichlorosilane），該鍵結層成分較佳為3-[雙(2-羥乙基)氨基]丙基三乙氧基矽烷（3-[Bis(2-hydroxyethyl)amino] propyl-triethoxysilane），該銜接分子成分較佳為1,4-苯二異硫氰酸（1,4-phenylene diisothiocyanate），而該探針分子係為蛋白質或核酸。

為達上述目的，本案之另一較廣義實施態樣為提供一種生物檢測晶片製造方法，至少包括步驟：(a)提供一基材；(b)形成一光阻圖案層於該基材之一表面；(c)形成一阻斷層於該基材表面未覆蓋該光阻圖案層之區域；(d)形成一鍵結層於該光阻圖案層上，其中該鍵結層係以共價鍵結方式與該光阻圖案層結合；(e)形成至少一銜接分子於該鍵結層上，其中該銜接分子係以共價鍵結方式與該鍵結層結合；以及(f)形成一探針分子於該銜接分子上，其中該探針分子係以共價鍵結方式與該銜接分子結合。

體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。

請參閱第1圖，其係為本案較佳實施例之生物檢測晶片結構示意圖。如圖所示，本案之生物檢測晶片1至少包括基材10、光阻圖案層11、阻斷層12、鍵結層13、銜接分子14及探針分子15。其中，光阻圖案層11係形成於基材10之表面，阻隔層12係形成於基材10表面未被光阻圖案層11覆蓋之區域，鍵結層13係以共價鍵結方式形成於光阻圖案層11上，銜接分子14係以共價鍵結方式與鍵結層13結合，探針分子15係以共價鍵結方式與銜接分子14結合，用以與一待測分子進行特異性之反應。以下則進一步說明本案生物檢測晶片之製造方法。

請同時參閱第2圖及第3A至3F圖，其中第2圖為本案較佳實施例之生物檢測晶片製造方法流程圖，第3A至3F圖為本案較佳實施例之生物檢測晶片製造方法之結構示意圖。如第3A圖所示，製造生物檢測晶片1首先必須提供一基材10（步驟S10），其中基材10可為但不限於玻璃、矽晶片、塑膠、或其他高分子材料。接著，如第3B圖所示，使用微影技術於基材10之表面上形成一光阻圖案層11（步驟S11），其係首先於基材10之表面上形成一光阻層，並於光阻層之特定區域上照光，使光阻產生聚合反應，再利用顯影液將未產生聚合反應的光阻洗掉，以形成光阻圖案層11。該光阻圖案層11即定義出微陣列結構，其中每一點之直徑大小約為10至300μm，高度約為1-5μm，且該光阻較佳為環氧樹脂類的SU-8光阻，但不以此為限。

傳統的微影技術係藉由一光罩進行圖案轉移。使用該技術前，須將預先設計好的微結構圖形製作在光罩上，並將基材10表面清潔乾淨，以增加基材10與光阻的附著性。接著以光阻塗佈機將光阻均勻塗佈在基材10上，經過軟烤，再以UV光照射光罩上的圖形，使得光阻能呈現出光罩上所設計的圖形，最後再以顯影液將圖形顯影呈現出來，經過硬烤後，便能製作出經設計的光阻塗案層11。

另外，也可使用無光罩微影技術進行光阻圖案層11的製作。此技術係由一數位化微鏡面取代傳統的光罩，以數位化微鏡面元件之晶片控制聚合反應的光阻圖案形狀。UV光源通過聚光鏡、數位化微鏡面、光圈、準直鏡以及反射鏡等光路架設系統直接投影於倒立式螢光顯微鏡的樣品平台，再經由自行撰寫設計的電腦程式控制數位化微鏡面的方向及入射光的曝光圖形影像成像，以於基材10之表面上形成光阻圖案層11。

然後，如第3C圖所示，再於基材10表面未覆蓋光阻圖案層11之區域形成一阻斷層12（步驟S12），其中阻斷層12之表面不具有活性官能基，可阻斷待測分子以非特異性反應附著於此，使得後續之生物檢測反應可精確地發生於由光阻圖案層11所定義之微陣列結構上。在一較佳實施例中，阻斷層12可藉由矽烷化反應（silanization）來形成，例如以二甲基二氯矽烷（dimethyldichlorosilane）與基材10進行反應而形成阻斷層12，且可形成於微結構之微小間隔（例如約50-150μm）中。在另一些實施例中，阻斷層12成分亦可為氧化矽（silicon oxide）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP）、小牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）或脫脂奶粉，但不以此為限。

之後，如第3D圖所示，以共價鍵結方式形成一鍵結層13於光阻圖案層11上（步驟S13），且鍵結層13具有至少一活性官能基，例如氫氧基或胺基，可用來連接銜接分子14。在一較佳實施例中，鍵結層13成分可為但不限於3-氨丙基三乙氧基矽烷（3-aminopropyltriethoxysilane, APTES），例如3-[雙(2-羥乙基)氨基]丙基三乙氧基矽烷（3-[Bis(2-hydroxyethyl)amino] propyl-triethoxysilane），其可與光阻圖案層11表面之氧原子形成共價鍵結，並具有氫氧基作為活性官能基，用以連接銜接分子14。在另一些實施例中，鍵結層13成分亦可為環氧丙氧丙基三甲氧基矽烷（glycidoxypropyltrimethoxysilane）、正十八烷基三氯矽烷（n-octadecyltrichlorosilane）或氯二甲基辛矽烷（chlorodimethyloctylsilane），但不以此為限。

接著，如第3E圖所示，形成至少一銜接分子14於鍵結層13上（步驟S14），其中銜接分子14係以共價鍵結方式與鍵結層13之活性官能基結合。在一較佳實施例中，銜接分子14成分可為但不限於1,4-苯二異硫氰酸（1,4-phenylene diisothiocyanate, PDITC），其所含之一異硫氰酸官能基可與鍵結層13之活性官能基結合，另一異硫氰酸官能基則可與探針分子15之活性官能基結合，例如與蛋白質分子N端之胺基結合。在另一些實施例中，銜接分子14成分亦可為戊二醛（glutaraldehyde）、1-甲基咪唑（1-methylimidazole）、4-羥基苯甲醛（4-hydroxybenaldehyde）或4-氨基苄胺（4-aminobenzylamine），但不以此為限。

最後，如第3F圖所示，形成一探針分子15於銜接分子14上（步驟S15），便完成本案生物檢測晶片之製作，其中探針分子15係以共價鍵結方式與銜接分子14結合，用以與待測分子進行特異性之反應，達到生物檢測之目的。而根據不同之生物檢測標的，探針分子15可為核酸或蛋白質，俾用於基因檢測、抗體抗原（antibody-antigen）反應檢測、酵素受質（enzyme-substrate）反應檢測、受體配體（receptor-ligand）反應檢測、適體（aptamer）與標的物的反應檢測、細胞反應檢測、或其他蛋白質與蛋白質反應檢測。因此，探針分子15係因應待測分子而選擇與待測分子具有特異性反應的生物材料作為探針分子15。

因此，本案之生物檢測晶片主要包含基材10、光阻圖案層11、阻斷層12、鍵結層13、銜接分子14及探針分子15，其中鍵結層13以共價鍵結方式形成於光阻圖案層11上，銜接分子14以共價鍵結方式與鍵結層13結合，探針分子15以共價鍵結方式與銜接分子14結合，因此，本案之探針分子15係經由銜接分子14及鍵結層13而共價鍵結於光阻圖案層11上，相較於習知探針分子與光阻之非共價結合方式而言，本案之探針分子15係以較強之結合力固定於晶片上，故本案之生物檢測晶片具有較佳之穩定性。

再者，本案之生物檢測晶片具有一阻斷層12，係形成於基材10表面未覆蓋光阻圖案層11之區域，可阻斷待測分子以非特異性反應附著於此，故可增加生物檢測晶片之精準度。此外，本案之光阻圖案層11可利用無光罩微影技術形成，不但可免除傳統光罩之高成本，且可有效微小化生物檢測晶片之微陣列結構，使單點直徑可小於300μm，進而有助於生物檢測晶片之微量化，且具有製程方便快速之優點。

以下將以實例說明本案之生物檢測晶片及其製造方法。

實例一：生物檢測晶片之製造

取一玻璃晶片作為基材，利用旋轉塗佈機於玻璃晶片上塗佈一層厚度約5μm的SU-8光阻（溶於環戊烷溶劑中）。對晶片進行軟烤以去除過多的溶劑後，將SU-8光阻經由無光罩微影技術之數位化微鏡面光學光路系統進行曝光活化，依據所使用的數位化微鏡面元件之微鏡面數在一特定的空間成像，並經由曝後烤後，以SU-8顯影液進行顯影，之後以異丙醇潤洗並以氮氣槍乾燥後，得到具有SU-8微結構陣列（光阻圖案層）之晶片，且每一點之直徑大小約為300μm。

將晶片放置在玻璃培養皿中，於室溫下放置數分鐘後，以二甲基二氯矽烷（dimethyldichlorosilane）當做阻斷劑（blocking reagent），平均佈滿整個晶片約30分鐘至1小時，由於SU-8微結構陣列具有約5μm之高度，使得阻斷劑會流至不具SU-8微結構陣列之晶片表面，故可於不具SU-8微結構陣列之晶片表面形成阻斷層。之後，在含有SU-8微結構陣列之反應區域滴加鍵結劑，其係為溶於95%(v/v)乙醇之20%(v/v) 3-[雙(2-羥乙基)氨基]丙基三乙氧基矽烷（3-[Bis(2-hydroxyethyl)amino] propyl-triethoxysilane），並於室溫下反應約1至2小時，以形成鍵結層於SU-8微結構陣列上，然後以95% (v/v)乙醇洗去沒有共價鍵結的鍵結劑，並在室溫下乾燥後即可保存在4°C備用。

之後，於SU-8微結構陣列之反應區域上滴加銜接分子溶液，其係為溶於二甲基甲醯胺（dimethylformamide, DMF）之0.2% 1,4-苯二異硫氰酸（1,4-phenylene diisothiocyanate, PDITC），並於室溫下反應約1至2小時，然後再加入探針分子。以檢測抗生物素蛋白（avidin）及生物素（biotin）反應為例，可於SU-8微結構陣列之反應區域上加入卵白素磁珠（streptavidin magnetic particle），並於室溫下反應約30分鐘至1小時，使卵白素磁珠共價鍵結於1,4-苯二異硫氰酸上（分子反應結構示意圖如第4A圖所示），並以PBST緩衝液流洗三次後，即完成生物檢測晶片之製作。

為測試前述生物檢測晶片之檢測效果，分別於不同晶片上加入五個不同濃度的螢光標示生物素（biotin-4-fluorescein），並於室溫下反應約10至25分鐘，使其與光阻上的卵白素磁珠進行特異性反應而結合（分子反應結構示意圖如第4B圖所示），之後再以微陣列掃瞄，即可得螢光強度對濃度的定量分析圖。由結果可知，螢光強度確實與生物素濃度成正相關，顯見本案之生物檢測晶片具有良好之檢測效果。

綜上所述，本案之生物檢測晶片係藉由鍵結層及銜接分子之設計，使探針分子以共價鍵結方式結合於光阻圖案層上，故具有較強之結合力，使本案之生物檢測晶片具有較佳之穩定性。再者，本案之生物檢測晶片具有形成於基材表面未覆蓋光阻圖案層之區域之阻斷層，可阻斷待測分子以非特異性反應附著於此，故可增加生物檢測晶片之精準度。此外，本案之光阻圖案層可利用無光罩微影技術形成，不但可免除傳統光罩之高成本，且可有效微小化生物檢測晶片之微陣列結構，使單點直徑可小於300μm，進而有助於生物檢測晶片之微量化，且具有製程方便快速之優點。因此，本案之生物檢測晶片可解決習用生物檢測晶片檢測不精準及穩定性不足之問題，並同時達到成本降低及製程方便快速之目的，使生物檢測晶片之應用更加廣泛。

本發明已由上述之實施例詳細敘述而可由熟悉本技藝之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

1．．．生物檢測晶片

10．．．基材

11．．．光阻圖案層

12．．．阻斷層

13．．．鍵結層

14．．．銜接分子

15．．．探針分子

第1圖係為本案較佳實施例之生物檢測晶片結構示意圖。

第2圖係為本案較佳實施例之生物檢測晶片製造方法流程圖。

第3A至3F圖係為本案較佳實施例之生物檢測晶片製造方法之結構示意圖。

第4A至4B圖係為本案較佳實施例之生物檢測晶片之分子反應結構示意圖。

1．．．生物檢測晶片

10．．．基材

11．．．光阻圖案層

12．．．阻斷層

13．．．鍵結層

14．．．銜接分子

15．．．探針分子

Claims (10)

1. 一種生物檢測晶片，至少包括：
       一基材；
       一光阻圖案層，係形成於該基材之一表面；
       一阻斷層，係形成於該基材之該表面未被該光阻圖案層覆蓋之區域；
       一鍵結層，係以共價鍵結方式形成於該光阻圖案層上；
       至少一銜接分子，係以共價鍵結方式與該鍵結層結合；以及
       一探針分子，係以共價鍵結方式與該銜接分子結合，用以與一待測分子進行反應。
2. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該基材係為玻璃、矽晶片或塑膠。
3. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該光阻圖案層成分係為SU-8光阻。
4. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該光阻圖案層每一點之直徑大小為10至300μm。
5. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該光阻圖案層係利用無光罩微影技術所形成。
6. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該阻斷層成分係為二甲基二氯矽烷（dimethyldichlorosilane）。
7. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該鍵結層成分係為3-[雙(2-羥乙基)氨基]丙基三乙氧基矽烷（3-[Bis(2-hydroxyethyl)amino] propyl-triethoxysilane）。
8. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該銜接分子成分係為1,4-苯二異硫氰酸（1,4-phenylene diisothiocyanate）。
9. 如申請專利範圍第1項所述之生物檢測晶片，其中該探針分子係為蛋白質或核酸。
10. 一種生物檢測晶片製造方法，至少包括步驟：
        (a)提供一基材；
        (b)形成一光阻圖案層於該基材之一表面；
        (c)形成一阻斷層於該基材表面未覆蓋該光阻圖案層之區域；
        (d)形成一鍵結層於該光阻圖案層上，其中該鍵結層係以共價鍵結方式與該光阻圖案層結合；
        (e)形成至少一銜接分子於該鍵結層上，其中該銜接分子係以共價鍵結方式與該鍵結層結合；以及
        (f)形成一探針分子於該銜接分子上，其中該探針分子係以共價鍵結方式與該銜接分子結合。