JP2003172737A - 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法 - Google Patents
固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水晶振動子の表面に炭素系物質からなる表面
処理層を形成させ、次いで表面処理層を化学修飾した化
学修飾層にオリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を優
れた付着強度と高い付着密度で担持させてバイオセンサ
とし、このバイオセンサを用いて高精度でかつ迅速に遺
伝子、蛋白質、ペプチドなどの生体物質を解析する。 【解決手段】 水晶振動子の表面にＤＬＣなどの炭素系
物質からなる表面処理層を形成させてなる固体支持体の
表面処理層を化学修飾してなる基体に、オリゴヌクレオ
チドを強力にかつ高密度に固定して、これにハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドやハイブリダイズしないオ
リゴヌクレオチドの反応を共振周波数の変化として検出
して定量化し、ハイブリッド形成量の相違からＳＮＰｓ
を解析するか、または上記素子に蛋白質やペプチドなど
の生理活性物質を固定化して、相互作用により結合する
生理活性物質や相互作用により結合しない生理活性物質
の反応を共振周波数の変化として検出して定量化し、相
互作用した量の相違から生理活性物質を解析する。
処理層を形成させ、次いで表面処理層を化学修飾した化
学修飾層にオリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を優
れた付着強度と高い付着密度で担持させてバイオセンサ
とし、このバイオセンサを用いて高精度でかつ迅速に遺
伝子、蛋白質、ペプチドなどの生体物質を解析する。 【解決手段】 水晶振動子の表面にＤＬＣなどの炭素系
物質からなる表面処理層を形成させてなる固体支持体の
表面処理層を化学修飾してなる基体に、オリゴヌクレオ
チドを強力にかつ高密度に固定して、これにハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドやハイブリダイズしないオ
リゴヌクレオチドの反応を共振周波数の変化として検出
して定量化し、ハイブリッド形成量の相違からＳＮＰｓ
を解析するか、または上記素子に蛋白質やペプチドなど
の生理活性物質を固定化して、相互作用により結合する
生理活性物質や相互作用により結合しない生理活性物質
の反応を共振周波数の変化として検出して定量化し、相
互作用した量の相違から生理活性物質を解析する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子解析、診
断、治療などに使用される遺伝子、あるいは蛋白質やペ
プチドなどの生体物質の解析に用いられる、固体支持
体、その固体支持体に化学修飾を施した基体、その基体
にオリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を固定してな
るバイオセンサ、およびそのバイオセンサを用いる生体
物質の解析方法に関する。
断、治療などに使用される遺伝子、あるいは蛋白質やペ
プチドなどの生体物質の解析に用いられる、固体支持
体、その固体支持体に化学修飾を施した基体、その基体
にオリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を固定してな
るバイオセンサ、およびそのバイオセンサを用いる生体
物質の解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、水晶振動子の共振周波数や共振抵
抗の変化を検出することによって、免疫測定などが行わ
れている。免疫測定では、水晶振動子の表面に抗原とな
る生体高分子や微生物を固定して、抗体や病原性微生物
などを測定することなどが行われている。また、ＤＮＡ
の検出を行うバイオセンサとしては、近年ＤＮＡチップ
が注目されている。ＤＮＡチップは、表面処理を施した
ガラスチップのスライドグラスの表面に、１万以上のＤ
ＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）などの遺伝子を載せたバイ
オセンサが、分子生物学、生化学の分野はもとより、病
気の発見など、医療分野でも広く利用されている。そし
て近年、ＤＮＡを固定化したバイオセンサが開発され、
遺伝子解析における解析速度が著しく速くなり、これを
応用して、医療分野においては疾病診断等も行われるよ
うになっている。
抗の変化を検出することによって、免疫測定などが行わ
れている。免疫測定では、水晶振動子の表面に抗原とな
る生体高分子や微生物を固定して、抗体や病原性微生物
などを測定することなどが行われている。また、ＤＮＡ
の検出を行うバイオセンサとしては、近年ＤＮＡチップ
が注目されている。ＤＮＡチップは、表面処理を施した
ガラスチップのスライドグラスの表面に、１万以上のＤ
ＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）などの遺伝子を載せたバイ
オセンサが、分子生物学、生化学の分野はもとより、病
気の発見など、医療分野でも広く利用されている。そし
て近年、ＤＮＡを固定化したバイオセンサが開発され、
遺伝子解析における解析速度が著しく速くなり、これを
応用して、医療分野においては疾病診断等も行われるよ
うになっている。
【０００３】このようなバイオセンサを用いて、例えば
あるＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、バ
イオセンサ上に、塩基配列が予め解明されており、互い
に異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置
が分かるように結合させておいたものを用意し、これに
蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片はバ
イオセンサ上に付けたＤＮＡ断片（プローブ）のうちの
相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズする。
ハイブリダイズ部分はバイオセンサを蛍光測定すること
により、スポットとして識別可能であり、ＤＮＡサンプ
ル中に含まれるＤＮＡ断片の配列を解明することができ
る。
あるＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、バ
イオセンサ上に、塩基配列が予め解明されており、互い
に異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置
が分かるように結合させておいたものを用意し、これに
蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片はバ
イオセンサ上に付けたＤＮＡ断片（プローブ）のうちの
相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズする。
ハイブリダイズ部分はバイオセンサを蛍光測定すること
により、スポットとして識別可能であり、ＤＮＡサンプ
ル中に含まれるＤＮＡ断片の配列を解明することができ
る。
【０００４】基板上にＤＮＡを固定する方法としては、
スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等
の高分子を塗布した後に固定する方法、フォトリソグラ
フ等の半導体技術を用いて基板上にＤＮＡを合成する方
法等があるが、ポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡ
を固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定なた
め、ハイブリッド形成工程に加えて洗浄工程や乾燥工程
を経るため、解析に時間を要し、またこれらの工程にお
いてＤＮＡが剥離するといった問題が生じていた。
スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等
の高分子を塗布した後に固定する方法、フォトリソグラ
フ等の半導体技術を用いて基板上にＤＮＡを合成する方
法等があるが、ポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡ
を固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定なた
め、ハイブリッド形成工程に加えて洗浄工程や乾燥工程
を経るため、解析に時間を要し、またこれらの工程にお
いてＤＮＡが剥離するといった問題が生じていた。
【０００５】この問題を解決するため、本発明者らは化
学修飾を施す基体として、化学的に安定でかつ熱伝導性
に優れたダイヤモンド、ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカ
ーボン、Diamond Like carbon）、グラファイトまたは
それらの混合体などを用いるとＤＮＡが安定して強力に
固定化され、ＰＣＲ等の加熱冷却を繰り返すヒートサイ
クル時間を効果的に短縮できることを既に見出していた
（特開２０００−１３９５３２号公報）。しかし、ハイ
ブリッド形成後に洗浄工程や乾燥工程を経るため、解析
に時間を要することや、これらの工程においてＤＮＡが
剥離する可能性は依然として残されていた。
学修飾を施す基体として、化学的に安定でかつ熱伝導性
に優れたダイヤモンド、ＤＬＣ（ダイヤモンドライクカ
ーボン、Diamond Like carbon）、グラファイトまたは
それらの混合体などを用いるとＤＮＡが安定して強力に
固定化され、ＰＣＲ等の加熱冷却を繰り返すヒートサイ
クル時間を効果的に短縮できることを既に見出していた
（特開２０００−１３９５３２号公報）。しかし、ハイ
ブリッド形成後に洗浄工程や乾燥工程を経るため、解析
に時間を要することや、これらの工程においてＤＮＡが
剥離する可能性は依然として残されていた。
【０００６】一方、水晶振動子などの電気−機械変換機
能を有する素子に既知のオリゴヌクレオチドを固定し、
これに検出目的とするＤＮＡをハイブリダイズさせ、そ
れによって生じる周波数の変化を検出してＤＮＡ配列を
検出する試みが行われている（特開平６−２４５７５４
号公報）。これらの方法によれば、ハイブリッド形成後
の洗浄行程や乾燥行程を経ることなく解析可能であり、
解析時間を短縮できる。また、より高い振動数の水晶振
動子を用いることにより、解析感度を高めることも可能
である。しかしながら、水晶振動子にオリゴヌクレオチ
ドを直接固定化すると、強い付着強度、および高い付着
密度が得られない。
能を有する素子に既知のオリゴヌクレオチドを固定し、
これに検出目的とするＤＮＡをハイブリダイズさせ、そ
れによって生じる周波数の変化を検出してＤＮＡ配列を
検出する試みが行われている（特開平６−２４５７５４
号公報）。これらの方法によれば、ハイブリッド形成後
の洗浄行程や乾燥行程を経ることなく解析可能であり、
解析時間を短縮できる。また、より高い振動数の水晶振
動子を用いることにより、解析感度を高めることも可能
である。しかしながら、水晶振動子にオリゴヌクレオチ
ドを直接固定化すると、強い付着強度、および高い付着
密度が得られない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明においては、水
晶振動子の表面に炭素系物質からなる表面処理層を形成
して固体支持体とし、次いで基体の表面処理層を化学修
飾して基体とし、その基体の化学修飾層にオリゴヌクレ
オチドまたは生理活性物質を優れた付着強度と高い付着
密度で担持させてバイオセンサとし、このバイオセンサ
を用いて高精度でかつ迅速に遺伝子、蛋白質、ペプチド
などの生理活性物質を解析することを目的とする。
晶振動子の表面に炭素系物質からなる表面処理層を形成
して固体支持体とし、次いで基体の表面処理層を化学修
飾して基体とし、その基体の化学修飾層にオリゴヌクレ
オチドまたは生理活性物質を優れた付着強度と高い付着
密度で担持させてバイオセンサとし、このバイオセンサ
を用いて高精度でかつ迅速に遺伝子、蛋白質、ペプチド
などの生理活性物質を解析することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の固体支持体は水
晶振動子上に表面処理層が形成されてなる固体支持体で
あり、前記表面処理層が、ダイヤモンド、ＤＬＣ、グラ
ファイト、炭化物のいずれか、それらの混合物、または
これらを積層してなるものであることを特徴とし、ま
た、本発明の基体は上記の固体支持体表面に化学修飾を
施してなる基体であり、前記固体支持体の表面に、一方
の末端に活性化エステル基が結合した炭化水素基の他方
の末端をアミド結合を介して固定化させたことを特徴と
し、さらに活性化エステル基がＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル基、またはｐ−ニトロフェノールエステ
ル基であることを特徴とする。
晶振動子上に表面処理層が形成されてなる固体支持体で
あり、前記表面処理層が、ダイヤモンド、ＤＬＣ、グラ
ファイト、炭化物のいずれか、それらの混合物、または
これらを積層してなるものであることを特徴とし、ま
た、本発明の基体は上記の固体支持体表面に化学修飾を
施してなる基体であり、前記固体支持体の表面に、一方
の末端に活性化エステル基が結合した炭化水素基の他方
の末端をアミド結合を介して固定化させたことを特徴と
し、さらに活性化エステル基がＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル基、またはｐ−ニトロフェノールエステ
ル基であることを特徴とする。
【０００９】また本発明のバイオセンサは、上記のいず
れかの化学修飾を施した基体上にオリゴヌクレオチドを
固定化してなるバイオセンサ、または上記のいずれかの
化学修飾を施した基体上に生理活性物質を固定化してな
るバイオセンサであり、生理活性物質が蛋白質またはペ
プチドであることを特徴とする。
れかの化学修飾を施した基体上にオリゴヌクレオチドを
固定化してなるバイオセンサ、または上記のいずれかの
化学修飾を施した基体上に生理活性物質を固定化してな
るバイオセンサであり、生理活性物質が蛋白質またはペ
プチドであることを特徴とする。
【００１０】さらに本発明の生体物質を解析する方法
は、上記のいずれかのバイオセンサを用いて、遺伝子、
蛋白質、ペプチドなどの生体物質を解析する方法であり
上記のバイオセンサに、該バイオセンサに担持させたオ
リゴヌクレオチドとは異なるヌクレオチドをハイブリダ
イズさせ、そのハイブリダイズの反応を共振周波数の変
化として検出して定量化し、ハイブリッド形成量の相違
から塩基配列を解析する方法、または上記のバイオセン
サに、バイオセンサに担持させた生理活性物質とは異な
る生理活性物質を相互結合させ、その相互結合の反応を
共振周波数の変化として検出して定量化し、相互結合形
成量の相違から生理活性物質を解析する方法である。
は、上記のいずれかのバイオセンサを用いて、遺伝子、
蛋白質、ペプチドなどの生体物質を解析する方法であり
上記のバイオセンサに、該バイオセンサに担持させたオ
リゴヌクレオチドとは異なるヌクレオチドをハイブリダ
イズさせ、そのハイブリダイズの反応を共振周波数の変
化として検出して定量化し、ハイブリッド形成量の相違
から塩基配列を解析する方法、または上記のバイオセン
サに、バイオセンサに担持させた生理活性物質とは異な
る生理活性物質を相互結合させ、その相互結合の反応を
共振周波数の変化として検出して定量化し、相互結合形
成量の相違から生理活性物質を解析する方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明においては、化学的に安定
でかつ熱伝導性に優れたダイヤモンド、ＤＬＣ、グラフ
ァイトまたはそれらの混合体などの炭素系物質からなる
表面処理層を形成させた水晶振動子からなる固体支持体
の表面処理層を化学修飾してなる基体に、オリゴヌクレ
オチドを強力にかつ高密度に固定して、これにハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドやハイブリダイズしない
オリゴヌクレオチドの反応を、共振周波数の変化として
検出して定量化し、ハイブリッド形成量の相違からＳＮ
Ｐｓ(一塩基多型、Single Nucleotide Polymorphism)を
解析したり、また上記素子に蛋白質やペプチドなどの生
理活性物質を固定化して、相互作用により結合する生理
活性物質や相互作用により結合しない生理活性物質の反
応を、共振周波数の変化として検出して定量化し、相互
作用した量の相違から生理活性物質を解析する。
でかつ熱伝導性に優れたダイヤモンド、ＤＬＣ、グラフ
ァイトまたはそれらの混合体などの炭素系物質からなる
表面処理層を形成させた水晶振動子からなる固体支持体
の表面処理層を化学修飾してなる基体に、オリゴヌクレ
オチドを強力にかつ高密度に固定して、これにハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドやハイブリダイズしない
オリゴヌクレオチドの反応を、共振周波数の変化として
検出して定量化し、ハイブリッド形成量の相違からＳＮ
Ｐｓ(一塩基多型、Single Nucleotide Polymorphism)を
解析したり、また上記素子に蛋白質やペプチドなどの生
理活性物質を固定化して、相互作用により結合する生理
活性物質や相互作用により結合しない生理活性物質の反
応を、共振周波数の変化として検出して定量化し、相互
作用した量の相違から生理活性物質を解析する。
【００１２】水晶振動子の表面に形成する表面処理層と
しては、ダイヤモンド、ＤＬＣ、グラファイト等の炭素
系物質のいずれか、それらの混合物、又はこれらを積層
させたものが好ましい。これらの表面処理層を形成させ
た固体支持体は、ＤＮＡプローブを多量に、強固に固定
化させることができる。すなわち、炭素系物質は化学安
定性に優れており、その後の化学修飾や、ＤＮＡプロー
ブ等を載せる際の反応等により変化することがないの
で、炭素系物質上に化学修飾を施しＤＮＡなどのプロー
ブを固定化させた際に、図１に示すように炭素原子との
共有結合の状態を示し、ＤＮＡプローブを固体支持体表
面に強固に固定化することができる。また、上記のＤＬ
Ｃ、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の
物質との混合体や積層体、例えば金属やセラミックス等
との混合体や積層体も表面処理層として用いることがで
きる。さらに、ＤＮＡなどが固定化されたプローブにお
いては、例えば図１に示すように固体支持体上にＤＮＡ
を垂直に林立させることができるので、固体支持体表面
の単位面積あたりのＤＮＡの固定化密度を増大させるこ
とができる。以下、本発明について詳細に説明する。
しては、ダイヤモンド、ＤＬＣ、グラファイト等の炭素
系物質のいずれか、それらの混合物、又はこれらを積層
させたものが好ましい。これらの表面処理層を形成させ
た固体支持体は、ＤＮＡプローブを多量に、強固に固定
化させることができる。すなわち、炭素系物質は化学安
定性に優れており、その後の化学修飾や、ＤＮＡプロー
ブ等を載せる際の反応等により変化することがないの
で、炭素系物質上に化学修飾を施しＤＮＡなどのプロー
ブを固定化させた際に、図１に示すように炭素原子との
共有結合の状態を示し、ＤＮＡプローブを固体支持体表
面に強固に固定化することができる。また、上記のＤＬ
Ｃ、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他の
物質との混合体や積層体、例えば金属やセラミックス等
との混合体や積層体も表面処理層として用いることがで
きる。さらに、ＤＮＡなどが固定化されたプローブにお
いては、例えば図１に示すように固体支持体上にＤＮＡ
を垂直に林立させることができるので、固体支持体表面
の単位面積あたりのＤＮＡの固定化密度を増大させるこ
とができる。以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】（１）水晶振動子上の表面処理層の形成
本発明において用いる水晶振動子は、基準周波数が１〜
１００ＭＨｚであり、ＡＴ切断した板状のものを用いる
ことが好ましい。この板状の水晶振動子の側面に金の電
極を形成させ、その上に表面処理層を形成させて固体支
持体とする。表面処理層としては、ダイヤモンド、ＤＬ
Ｃ、グラファイト、炭化物のいずれか、それらの混合
物、またはそれらを積層させたものであることが望まし
い。ＤＬＣは、ダイヤモンドやグラファイトと同様に炭
素原子から構成され、ダイヤモンドに類似した特性を有
することからＤＬＣ(Diamond like carbon)と呼ばれて
いる。ＤＬＣ膜の構造はアモルファスである。これらの
表面処理層において、前記のＤＬＣは、メタンガス１０
０〜１体積％、残り水素ガス０〜９９体積％を含んだ混
合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものである
ことが好ましい。また、これらの表面処理層の厚みは１
ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましい。
１００ＭＨｚであり、ＡＴ切断した板状のものを用いる
ことが好ましい。この板状の水晶振動子の側面に金の電
極を形成させ、その上に表面処理層を形成させて固体支
持体とする。表面処理層としては、ダイヤモンド、ＤＬ
Ｃ、グラファイト、炭化物のいずれか、それらの混合
物、またはそれらを積層させたものであることが望まし
い。ＤＬＣは、ダイヤモンドやグラファイトと同様に炭
素原子から構成され、ダイヤモンドに類似した特性を有
することからＤＬＣ(Diamond like carbon)と呼ばれて
いる。ＤＬＣ膜の構造はアモルファスである。これらの
表面処理層において、前記のＤＬＣは、メタンガス１０
０〜１体積％、残り水素ガス０〜９９体積％を含んだ混
合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものである
ことが好ましい。また、これらの表面処理層の厚みは１
ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましい。
【００１４】表面処理層の形成方法としては、公知の方
法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical Vap
or Deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric Cyclotron R
esounance Chemical Vapor Deposit）法、ＩＰＣ（Indu
ctively Coupled Plasma）法、直流スパッタリング法、
ＥＣＲ（Electric Cyclotron Resounance）スパッタリ
ング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレー
ティング法、ＥＢ（electron Beam）蒸着法、抵抗加熱
蒸着法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着
法などによることができる。このようにして本発明の化
学修飾を施す基体に用いる固体支持体が得られる。
法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical Vap
or Deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric Cyclotron R
esounance Chemical Vapor Deposit）法、ＩＰＣ（Indu
ctively Coupled Plasma）法、直流スパッタリング法、
ＥＣＲ（Electric Cyclotron Resounance）スパッタリ
ング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレー
ティング法、ＥＢ（electron Beam）蒸着法、抵抗加熱
蒸着法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着
法などによることができる。このようにして本発明の化
学修飾を施す基体に用いる固体支持体が得られる。
【００１５】（２）表面処理層の化学修飾
上記のようにして形成させた固体支持体の表面処理層に
さらに化学修飾を施して基体とする。化学修飾の一例と
しては、炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合し
た基を、固体支持体の表面処理層にアミド結合を介して
固定化することをいう。このような化学修飾によって、
オリゴヌクレオチドを固体支持体の表面に固定化しやす
くする。その他の化学修飾は、末端に極性基、例えば、
水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、チオ
ール基、イソシアネート基等を有する炭化水素基で固体
支持体表面を置換することによる。前記炭化水素基とし
ては、炭素数が1〜１２のもの、中でも1〜６のものが好
ましい。例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノ
カルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン
酸、フマル酸などのジカルボン酸、トリメリト酸等の多
価カルボン酸が挙げられる。中でも、シュウ酸、コハク
酸が好ましい。炭化水素基の末端に結合する活性エステ
ル基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
あるいはｐ−ニトロフェノールエステルが好ましい。化
学修飾方法としては、例えば、塩素ガス中で固体支持体
に紫外線を照射して表面を塩素化し、次いでアンモニア
ガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロ
ライドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。
次いで、トリメリト酸、ポリアクリル酸等の多価カルボ
ン酸溶液に浸漬することにより、カルボキシル化処理を
施した表面のカルボキシル化してないアミノ基をマスキ
ングする。また、多価カルボン酸溶液に浸漬することに
よって、基板の親水性を向上させ、ＤＮＡサンプルの基
板へのなじみを良好にすることができる。その後、カル
ボジイミドなどの脱水縮合剤を用いて活性化し、この化
学修飾を施した基体にオリゴヌクレオチドや生理活性物
質を固定化してバイオセンサとする。
さらに化学修飾を施して基体とする。化学修飾の一例と
しては、炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合し
た基を、固体支持体の表面処理層にアミド結合を介して
固定化することをいう。このような化学修飾によって、
オリゴヌクレオチドを固体支持体の表面に固定化しやす
くする。その他の化学修飾は、末端に極性基、例えば、
水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、チオ
ール基、イソシアネート基等を有する炭化水素基で固体
支持体表面を置換することによる。前記炭化水素基とし
ては、炭素数が1〜１２のもの、中でも1〜６のものが好
ましい。例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノ
カルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン
酸、フマル酸などのジカルボン酸、トリメリト酸等の多
価カルボン酸が挙げられる。中でも、シュウ酸、コハク
酸が好ましい。炭化水素基の末端に結合する活性エステ
ル基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
あるいはｐ−ニトロフェノールエステルが好ましい。化
学修飾方法としては、例えば、塩素ガス中で固体支持体
に紫外線を照射して表面を塩素化し、次いでアンモニア
ガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸クロ
ライドあるいは酸無水物を用いてカルボキシル化する。
次いで、トリメリト酸、ポリアクリル酸等の多価カルボ
ン酸溶液に浸漬することにより、カルボキシル化処理を
施した表面のカルボキシル化してないアミノ基をマスキ
ングする。また、多価カルボン酸溶液に浸漬することに
よって、基板の親水性を向上させ、ＤＮＡサンプルの基
板へのなじみを良好にすることができる。その後、カル
ボジイミドなどの脱水縮合剤を用いて活性化し、この化
学修飾を施した基体にオリゴヌクレオチドや生理活性物
質を固定化してバイオセンサとする。
【００１６】固体支持体を化学修飾する方法のもう一つ
の例として、ＤＬＣからなる表面処理層をプラズマ法で
形成した後、アンモニアガス雰囲気中でプラズマを照射
することにより、ＤＬＣからなる表面処理層の表面をア
ミノ化する化学修飾を行うことも可能である。このよう
に、アミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水
物を用いてカルボキシル化する。次いで、多価カルボン
酸溶液に浸漬することにより、表面のカルボキシル化し
ていないアミノ基をマスキングする。この後、上記と同
様に脱水縮合剤を用いて活性化する。
の例として、ＤＬＣからなる表面処理層をプラズマ法で
形成した後、アンモニアガス雰囲気中でプラズマを照射
することにより、ＤＬＣからなる表面処理層の表面をア
ミノ化する化学修飾を行うことも可能である。このよう
に、アミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは酸無水
物を用いてカルボキシル化する。次いで、多価カルボン
酸溶液に浸漬することにより、表面のカルボキシル化し
ていないアミノ基をマスキングする。この後、上記と同
様に脱水縮合剤を用いて活性化する。
【００１７】（３）オリゴヌクレオチドまたは生理活性
物質の固定 オリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を固定する場合
は、オリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を含有する
水溶液に浸漬してアミド結合により固定化する。このよ
うにして本発明のバイオセンサが得られる。
物質の固定 オリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を固定する場合
は、オリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を含有する
水溶液に浸漬してアミド結合により固定化する。このよ
うにして本発明のバイオセンサが得られる。
【００１８】（４）生体物質の解析方法
以上のようにして得られたバイオセンサを用いて、解析
を目的とするＳＮＰｓ、ＤＮＡ、遺伝子、抗体（免疫グ
ロブリン）、蛋白質などを次のようにして解析する。例
としてまずＳＮＰｓを検出する場合を説明する。 [ＳＮＰｓの検出]オリゴヌクレオチドＡ（以下、オリゴ
Ａという。配列表の配列番号１参照。）とオリゴヌクレ
オチドＢ（以下、オリゴＢという。配列表の配列番号２
参照。）はハイブリッドを形成（ハイブリダイズ）し、
オリゴA同士はハイブリダイズしない。この反応を本発
明のバイオセンサを用いて検出し、定量化する。 i) 固体支持体の作成 直径５ｍｍの円状の金電極が形成された９ｍｍ角の水晶
板（基準周波数：９ＭＨｚ）に、イオン化蒸着法によ
り、メタンガス９５体積％、水素ガスを５体積％を混合
したガスを原料として、ＤＬＣ膜を5ｎｍ厚みに形成し
た固体支持体を作成した。 ii) 固体支持体の化学修飾 次に、この固体支持体表面を化学修飾し、活性化させ
た。すなわち、ＤＬＣ膜形成後、アンモニアガス雰囲気
中でプラズマを１０分間照射して表面をアミノ化し、次
いで無水コハク酸溶液に２０分間浸漬した。無水コハク
酸溶液は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンに無水コハク酸
を１４０ｍＭ／Ｌ、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８）を０．
１Ｍ／Ｌを溶解させて作成した。水洗後、引き続き０．
１％ポリアクリル酸溶液に浸漬しマスキングた。次に、
活性化液に浸漬して直接活性化を行った。活性化液は、
２００ｍＬ入りのビーカーに、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドを１１５ｍｇと１−［３−（ジメチルアミノ）プ
ロピル］３−エチルカルボジイミドを９５９ｍｇを０．
１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６）５０ｍＬに溶解させ
て作成した。この活性化液に浸漬して反応させ、洗浄し
た。
を目的とするＳＮＰｓ、ＤＮＡ、遺伝子、抗体（免疫グ
ロブリン）、蛋白質などを次のようにして解析する。例
としてまずＳＮＰｓを検出する場合を説明する。 [ＳＮＰｓの検出]オリゴヌクレオチドＡ（以下、オリゴ
Ａという。配列表の配列番号１参照。）とオリゴヌクレ
オチドＢ（以下、オリゴＢという。配列表の配列番号２
参照。）はハイブリッドを形成（ハイブリダイズ）し、
オリゴA同士はハイブリダイズしない。この反応を本発
明のバイオセンサを用いて検出し、定量化する。 i) 固体支持体の作成 直径５ｍｍの円状の金電極が形成された９ｍｍ角の水晶
板（基準周波数：９ＭＨｚ）に、イオン化蒸着法によ
り、メタンガス９５体積％、水素ガスを５体積％を混合
したガスを原料として、ＤＬＣ膜を5ｎｍ厚みに形成し
た固体支持体を作成した。 ii) 固体支持体の化学修飾 次に、この固体支持体表面を化学修飾し、活性化させ
た。すなわち、ＤＬＣ膜形成後、アンモニアガス雰囲気
中でプラズマを１０分間照射して表面をアミノ化し、次
いで無水コハク酸溶液に２０分間浸漬した。無水コハク
酸溶液は、Ｎ−メチル−２−ピロリドンに無水コハク酸
を１４０ｍＭ／Ｌ、ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８）を０．
１Ｍ／Ｌを溶解させて作成した。水洗後、引き続き０．
１％ポリアクリル酸溶液に浸漬しマスキングた。次に、
活性化液に浸漬して直接活性化を行った。活性化液は、
２００ｍＬ入りのビーカーに、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドを１１５ｍｇと１−［３−（ジメチルアミノ）プ
ロピル］３−エチルカルボジイミドを９５９ｍｇを０．
１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６）５０ｍＬに溶解させ
て作成した。この活性化液に浸漬して反応させ、洗浄し
た。
【００１９】iii) バイオセンサの作成（オリゴＡの基
体への固定化） 上記のようにして得られた化学修飾を施した基体を、１
０ｎｇ／μＬに調整した２００μＬのオリゴＡ溶液に６
０分間浸漬した後、超純水中で３回洗浄し、バイオセン
サとした。 iv) オリゴＢとのハイブリダイズ 上記のバイオセンサを、水晶振動子化学計測装置に電気
的に接続した状態で１０ｎｇ／μＬに調整した２００μ
ｌのオリゴＢ溶液に６０分間浸漬しハイブリダイズさせ
た。 v) ハイブリダイズしたオリゴＢの定量 バイオセンサをオリゴＢ溶液に浸漬した直後からの共振
周波数の変化の測定値から、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏ
ｌｅｆの式により質量変化に換算し、２００ｎｇ／枚程
度のオリゴＡとハイブリダイズしたオリゴＢの量が定量
された。
体への固定化） 上記のようにして得られた化学修飾を施した基体を、１
０ｎｇ／μＬに調整した２００μＬのオリゴＡ溶液に６
０分間浸漬した後、超純水中で３回洗浄し、バイオセン
サとした。 iv) オリゴＢとのハイブリダイズ 上記のバイオセンサを、水晶振動子化学計測装置に電気
的に接続した状態で１０ｎｇ／μＬに調整した２００μ
ｌのオリゴＢ溶液に６０分間浸漬しハイブリダイズさせ
た。 v) ハイブリダイズしたオリゴＢの定量 バイオセンサをオリゴＢ溶液に浸漬した直後からの共振
周波数の変化の測定値から、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏ
ｌｅｆの式により質量変化に換算し、２００ｎｇ／枚程
度のオリゴＡとハイブリダイズしたオリゴＢの量が定量
された。
【００２０】vi) ハイブリダイズしたオリゴＢの除去
上記のようにしてオリゴＢをハイブリダイズしたバイオ
センサを８０℃に加熱した洗浄液（２×ＳＳＣ、０．２
％ＳＤＳ）中に浸漬してハイブリダイズしたオリゴＢを
除去した。 vii) オリゴAとのハイブリダイズ 上記のようにしてオリゴＢを除去したバイオセンサを水
晶振動子化学計測装置に電気的に接続した状態で１０ｎ
ｇ／μＬに調整した２００μＬのオリゴＡ溶液に６０分
間浸漬しハイブリダイズさせた。 viii) ハイブリダイズしたオリゴAの定量 v)と同様にして、バイオセンサをオリゴＡ溶液に浸漬し
た直後からの共振周波数の変化の測定値から、Ｍｉｌｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｂｏｌｅｆの式により質量変化に換算し、
０ｎｇ／枚程度の値が定量され、オリゴＡ同士はハイブ
リダイズしないことが確認された。 ix) ハイブリダイズしたオリゴＡの除去 vi)と同様にして、オリゴＡをハイブリダイズしたバイ
オセンサを洗浄液中に浸漬してハイブリダイズしたオリ
ゴＢを除去した。
センサを８０℃に加熱した洗浄液（２×ＳＳＣ、０．２
％ＳＤＳ）中に浸漬してハイブリダイズしたオリゴＢを
除去した。 vii) オリゴAとのハイブリダイズ 上記のようにしてオリゴＢを除去したバイオセンサを水
晶振動子化学計測装置に電気的に接続した状態で１０ｎ
ｇ／μＬに調整した２００μＬのオリゴＡ溶液に６０分
間浸漬しハイブリダイズさせた。 viii) ハイブリダイズしたオリゴAの定量 v)と同様にして、バイオセンサをオリゴＡ溶液に浸漬し
た直後からの共振周波数の変化の測定値から、Ｍｉｌｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｂｏｌｅｆの式により質量変化に換算し、
０ｎｇ／枚程度の値が定量され、オリゴＡ同士はハイブ
リダイズしないことが確認された。 ix) ハイブリダイズしたオリゴＡの除去 vi)と同様にして、オリゴＡをハイブリダイズしたバイ
オセンサを洗浄液中に浸漬してハイブリダイズしたオリ
ゴＢを除去した。
【００２１】上記のiv)〜ix)の反応において、例えばオ
リゴＢの配列の１つのＡがＴに変わった、オリゴＣ（配
列表の配列番号３参照。）を上記と同様にしてハイブリ
ダイズさせると、１００ｎｇ／枚程度のオリゴＡとハイ
ブリダイズしたオリゴＣの量が定量された。さらに、オ
リゴＢの配列の２つのＡがＴに変わった、オリゴＤ（配
列表の配列番号３参照。）を上記と同様にしてハイブリ
ダイズさせると、５０ｎｇ／枚程度のオリゴＡとハイブ
リダイズしたオリゴＣの量を定量され、さらにハイブリ
ッドの形成量が減少した。このようにしてＳＮＰｓを検
出することができ、同様の手法を用いて、ＤＮＡや遺伝
子などを検出することができる。
リゴＢの配列の１つのＡがＴに変わった、オリゴＣ（配
列表の配列番号３参照。）を上記と同様にしてハイブリ
ダイズさせると、１００ｎｇ／枚程度のオリゴＡとハイ
ブリダイズしたオリゴＣの量が定量された。さらに、オ
リゴＢの配列の２つのＡがＴに変わった、オリゴＤ（配
列表の配列番号３参照。）を上記と同様にしてハイブリ
ダイズさせると、５０ｎｇ／枚程度のオリゴＡとハイブ
リダイズしたオリゴＣの量を定量され、さらにハイブリ
ッドの形成量が減少した。このようにしてＳＮＰｓを検
出することができ、同様の手法を用いて、ＤＮＡや遺伝
子などを検出することができる。
【００２２】[免疫グロブリンの検出]免疫グロブリンＧ
（以下簡略のため、ＩｇＧという）とプロテインＡは相
互作用により結合するが、免疫グロブリンＡ（以下簡略
のため、ＩｇＡという）とプロテインＡは相互作用によ
り結合しない。この反応を本発明のバイオセンサを用い
て検出し、定量化する。 i) バイオセンサの作成（ＩｇＧまたはＩｇＡの基体へ
の固定化） 上記のＳＮＰｓの検出におけるi)〜ii)の操作をそのま
ま用い、化学修飾を施した基体を作成した。次いで、
０．５μｇ／μＬに調整したＩｇＧ溶液に６０分間浸漬
した後、超純水中で３回洗浄し、バイオセンサＩとし
た。同様にして０．５μｇ／μＬに調整したＩｇＡ溶液
に６０分間浸漬した後、超純水中で３回洗浄し、バイオ
センサIIとした。
（以下簡略のため、ＩｇＧという）とプロテインＡは相
互作用により結合するが、免疫グロブリンＡ（以下簡略
のため、ＩｇＡという）とプロテインＡは相互作用によ
り結合しない。この反応を本発明のバイオセンサを用い
て検出し、定量化する。 i) バイオセンサの作成（ＩｇＧまたはＩｇＡの基体へ
の固定化） 上記のＳＮＰｓの検出におけるi)〜ii)の操作をそのま
ま用い、化学修飾を施した基体を作成した。次いで、
０．５μｇ／μＬに調整したＩｇＧ溶液に６０分間浸漬
した後、超純水中で３回洗浄し、バイオセンサＩとし
た。同様にして０．５μｇ／μＬに調整したＩｇＡ溶液
に６０分間浸漬した後、超純水中で３回洗浄し、バイオ
センサIIとした。
【００２３】ii) プロテインＡとの相互作用による結合
上記のバイオセンサＩまたはバイオセンサIIを、それぞ
れ水晶振動子化学計測装置に電気的に接続した状態で
０．５μｇ／μＬに調整した２００μＬのプロテインＡ
溶液に浸漬して反応させて固定化した。 iii) ＩｇＧまたはＩｇＡと相互作用したプロテインＡ
の定量 バイオセンサＩおよびバイオセンサIIをプロテインＡ溶
液に浸漬した直後からのそれぞれの共振周波数の変化の
測定値から、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｌｅｆの式によ
り質量変化に換算し、２００ｎｇ／枚程度のＩｇＧと相
互作用したプロテインＡの量、およびが５５ｎｇ／枚程
度のＩｇＡと相互作用したプロテインＡの量定量され
た。このようにして抗体（免疫グロブリン）を検出する
ことができ、同様の手法を用いて、蛋白質、ペプチドな
どの生体物質を検出することができる。
れ水晶振動子化学計測装置に電気的に接続した状態で
０．５μｇ／μＬに調整した２００μＬのプロテインＡ
溶液に浸漬して反応させて固定化した。 iii) ＩｇＧまたはＩｇＡと相互作用したプロテインＡ
の定量 バイオセンサＩおよびバイオセンサIIをプロテインＡ溶
液に浸漬した直後からのそれぞれの共振周波数の変化の
測定値から、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｌｅｆの式によ
り質量変化に換算し、２００ｎｇ／枚程度のＩｇＧと相
互作用したプロテインＡの量、およびが５５ｎｇ／枚程
度のＩｇＡと相互作用したプロテインＡの量定量され
た。このようにして抗体（免疫グロブリン）を検出する
ことができ、同様の手法を用いて、蛋白質、ペプチドな
どの生体物質を検出することができる。
【００２４】
【発明の効果】本発明においては、水晶振動子の表面に
炭素系物質からなる表面処理層を形成して固体支持体と
し、次いで基体の表面処理層を化学修飾して基体とし、
その基体の化学修飾層にオリゴヌクレオチドまたは生理
活性物質を優れた付着強度と高い付着密度で担持させて
バイオセンサとすることができる。即ち、炭素系物質か
らなる表面処理層を形成させた水晶振動子を化学修飾し
てなる基体に、オリゴヌクレオチドを強力にかつ高密度
に固定して、これにハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドやハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの反応
を、共振周波数の変化として検出して定量化し、ハイブ
リッド形成量の相違からＳＮＰｓを解析したり、また基
体に蛋白質やペプチドなどの生理活性物質を固定化し
て、相互作用により結合する生理活性物質や相互作用に
より結合しない生理活性物質の反応を、共振周波数の変
化として検出して定量化し、相互作用した量の相違から
生体物質を解析したりすることにより、ハイブリッド形
成後または相互作用後の洗浄行程や乾燥行程を経ること
なく、高い解析感度で塩基配列や生体物質を解析するこ
とが可能となった。
炭素系物質からなる表面処理層を形成して固体支持体と
し、次いで基体の表面処理層を化学修飾して基体とし、
その基体の化学修飾層にオリゴヌクレオチドまたは生理
活性物質を優れた付着強度と高い付着密度で担持させて
バイオセンサとすることができる。即ち、炭素系物質か
らなる表面処理層を形成させた水晶振動子を化学修飾し
てなる基体に、オリゴヌクレオチドを強力にかつ高密度
に固定して、これにハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドやハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの反応
を、共振周波数の変化として検出して定量化し、ハイブ
リッド形成量の相違からＳＮＰｓを解析したり、また基
体に蛋白質やペプチドなどの生理活性物質を固定化し
て、相互作用により結合する生理活性物質や相互作用に
より結合しない生理活性物質の反応を、共振周波数の変
化として検出して定量化し、相互作用した量の相違から
生体物質を解析したりすることにより、ハイブリッド形
成後または相互作用後の洗浄行程や乾燥行程を経ること
なく、高い解析感度で塩基配列や生体物質を解析するこ
とが可能となった。
【００２５】
「配列表」
SEQUENCE LISTING
<110>Toyo Kohan Co., Ltd.
<120>固体支持体、その固体支持体の表面に化学修飾を施した基体、その基体に
オリゴヌクレオチドまたは生理活性物質を固定してなるバイオセンサ、およびそ
れらを用いた生体物質の解析方法
<130>P3024
<160>4
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>1
aaa ggt ttt ttt ttt ttt ttt ttg 24
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>2
aat tca aaa aaa aaa aaa aaa aac ctt 27
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>3
aat tca aaa aaa ata aaa aaa aac ctt 27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>4
aat tca aaa aaa ata aat aaa aac ctt 27
【図１】本発明の化学修飾を施した固体支持体にＤＮＡ
プローブを固定化した結合状態を示す概念図。
プローブを固定化した結合状態を示す概念図。
【符号の説明】
１：化学修飾を施した固体支持体
２：ＤＬＣ層
３：ＤＮＡ
４：ＤＮＡプローブ固定化固体支持体
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ
33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
(72)発明者 田代 康介
福岡県福岡市名島４丁目40番27号
Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 CA11 HA19
4B029 AA07 FA12
4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR35
QR55 QS34
Claims (12)
- 【請求項１】 水晶振動子上に表面処理層が形成されて
なることを特徴とする固体支持体。 - 【請求項２】 前記表面処理層が、ダイヤモンド、ダイ
ヤモンドライクカーボン、グラファイト、炭化物のいず
れか、それらの混合物、またはこれらを積層してなるも
のであることを特徴とする請求項１に記載の固体支持
体。 - 【請求項３】 請求項１または２の固体支持体の表面に
化学修飾を施したことを特徴とする基体。 - 【請求項４】 前記固体支持体の表面に、一方の末端に
活性化エステル基が結合した炭化水素基の他方の末端を
アミド結合を介して固定化させたことを特徴とする請求
項３に記載の固体支持体の表面に化学修飾を施した基
体。 - 【請求項５】 前記活性化エステル基がＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル基であることを特徴とする請求
項４に記載の固体支持体の表面に化学修飾を施した基
体。 - 【請求項６】 前記活性化エステル基がｐ−ニトロフェ
ノールエステル基であることを特徴とする請求項４に記
載の固体支持体の表面に化学修飾を施した基体。 - 【請求項７】 請求項３〜６のいずれかに記載の固体支
持体の表面に化学修飾を施した基体上にオリゴヌクレオ
チドを固定化してなることを特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項８】 請求項３〜６のいずれかに記載の固体支
持体の表面に化学修飾を施した基体上に生理活性物質を
固定化してなることを特徴とするバイオセンサ。 - 【請求項９】 前記生理活性物質が蛋白質またはペプチ
ドであることを特徴とする、請求項８に記載のバイオセ
ンサ。 - 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれかに記載のバイ
オセンサを用いて、遺伝子、蛋白質、ペプチドなどの生
体物質を解析することを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 請求項７に記載のバイオセンサに、該
バイオセンサに担持させたオリゴヌクレオチドとは異な
るヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そのハイブリダ
イズの反応を共振周波数の変化として検出して定量化
し、ハイブリッド形成量の相違から塩基配列を解析する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 請求項８または９のバイオセンサに、
該バイオセンサに担持させた生理活性物質とは異なる生
理活性物質を相互結合させ、その相互結合の反応を共振
周波数の変化として検出して定量化し、相互結合形成量
の相違から生理活性物質を解析することを特徴とする方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001374764A JP2003172737A (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001374764A JP2003172737A (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003172737A true JP2003172737A (ja) | 2003-06-20 |
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ID=19183279
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| JP2001374764A Pending JP2003172737A (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003172737A (ja) |
Cited By (10)
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| JP2006049814A (ja) * | 2004-06-28 | 2006-02-16 | Kyocera Corp | 発光装置および照明装置 |
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2001
- 2001-12-07 JP JP2001374764A patent/JP2003172737A/ja active Pending
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