JP2005164387A - Dnaチップおよびそれを用いたバイオセンサー - Google Patents
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Abstract
蛍光物質等の標識をすることなく、特定のDNAを迅速、簡便に検出することが可能で、かつ、小型化された高感度のバイオセンサーを提供する。
【解決手段】
微細加工技術によって1または複数の微小ウェルを電極表面上に配列させ、これら1または複数の微小ウェルの各々にプローブDNAを固定化したバイオ分子アレイチップを作製し、このプローブDNAにターゲットDNAが相互作用したときの酸化還元電流値の変化を高感度で測定することによって、ターゲットDNA中の単一塩基の変異を検出する。
【選択図】 図3
Description
バイオチップとは、固体表面上(固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など)にDNA等の核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子等のプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである。特に、微量のサンプルを用いて大量にハイスループットな検出および解析ができるところから、大量かつ同時並行的な処理を要求されるポストゲノム時代のバイオ分子の機能解析技術にはバイオチップ関連技術が必須となっている。
また、微細加工技術を利用してシリコン、ガラス等の基板表面上に流路、回路を成形し、微小空間上で反応、分離、検出等を行う装置、器具(ラボ・オン・チップ、μTAS(micro-total analysis system)、バイオMEMS(micro-electro-mechanical systems)等)が実用化され、それらをバイオチップと称することもある。
SNPの解析には、安定性の微妙に異なった多種類のDNA二重らせんを同時に測定することが必要であり、所定の温度条件下、特定の溶液中で測定することが必要であるが、乾燥下で測定する従来のDNAマイクロアレイ技術ではこの測定は不可能であった。
電気化学的な手法は、蛍光標識等を標識せずに非標識でDNAのハイブリダイゼーションを検出できることから、遺伝子解析の迅速化、解析装置の簡略化および低コスト化が図れるという利点を有している。
したがって、これらの方法には、それぞれ、酸化還元物質を修飾するのでコストが上昇したり、DNAに特異的に結合するインターカレーターを選ばなければならないことや塩基対にインターカレーターが挿入して二重らせん構造に影響を与えるため、SNPの検出には適当ではないという問題がある。また、インジケータフリーな方法では塩基配列中にグアニン(G)の存在が必須であるので、測定可能範囲が限定されるといった問題がある。
また電気化学的に遺伝子の発現解析を行うことを目的とする場合、数千ないし数万もの微小電極アレイを同時に測定する手法や装置が必要であるが、ケイ・カマン(K. Cammann)らによって報告された手法を応用することにより(非特許文献8および10)、高度に集積化された微小電極アレイ型DNAチップを開発することも可能であると考えられる。
今までに報告された集積型電極チップによる遺伝子検出の例では、微小電極アレイ上へのプローブDNAの固定化法として電気化学的手法を用いているが、最終的には蛍光測定によって遺伝子の検出を行っている。
そこで、本発明者らは、プローブDNAを電極上に固定化する方法を検討し、微小電極アレイ型DNAチップを作製し、一切の標識分子修飾を行うことなく同時に複数のターゲットDNAを電気化学的に検出する新しい「次世代DNAチップ電極アレイシステム」の構築を行った。
そして、本発明の最終的な目的は、本発明によるDNAチップを、迅速かつ簡便な臨床遺伝子検査に応用することにある。
また、該一本鎖DNAがレプチンをコードするDNAの断片である。
ここに、該作用電極は、1または複数のプローブ一本鎖DNAが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に1または複数の電極配線が形成され、該1または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該1または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する1または複数の孔を設けることによって1または複数のウェルが形成され、該1または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖DNAが固定化されているバイオチップであり、
処理前に、該バイオチップの第1の電気的信号を測定し;
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第2の電気的信号を測定し;次いで、
第1の電気的信号と第2の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該1または複数のプローブ一本鎖DNAとハイブリダイズする非標識ターゲットDNAを検出することを特徴とするバイオセンサーを提供する。
すなわち、プローブDNAにターゲットDNAがハイブリダイズしていない系で測定した電気的信号とプローブDNAにターゲットDNAがハイブリダイズした系で測定した電気的信号との間に統計学的に有意な変化があった場合、当該有意な変化をターゲットDNAとプローブDNAとのハイブリダイゼーションに関連付けることができる。
すなわち、本発明によれば、非標識ターゲットDNAのプローブDNAへのハイブリダイゼーションの有無をバイオチップのバイオ分子アレイ上の酸化還元状態の変化から検出する。したがって、ターゲットDNAに蛍光物質等を標識することなく、酸化還元電流値を測定するだけでハイブリダイゼーションを検出できるので、迅速かつ簡便な測定が可能となる。
また、本発明によるバイオチップには、複数の電極上に各自異なるプローブDNAを固定化することができるので、複数の遺伝子を同時に検出することができる。
さらに、本発明によるバイオセンサーは非常に高感度であり、SNPを検出することができるので、種々の疾患に関連するSNP遺伝変異の検出から、従来、長時間をかけて培養しなければならなかった病原菌の検出等、さまざまな可能性を秘めている。
本発明によるDNAチップの上面図を図1に示す。この実施例では、ガラス基板10上に8本の電極配線13を形成し、一度に8点測定が可能なDNAチップ1を形成した。
電極配線13の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域131が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド132が形成されている。
図2にバイオ分子アレイ領域131の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域131上には絶縁性レジスト膜14が形成され、この絶縁膜に1または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための1または複数のウェル131aが形成されている。
バイオ分子アレイ領域131には、ウェル131aの直径が5μm以上の場合、図2aに示すように単一のウェルを形成することができ、ウェル131aの直径がサブミクロン以下20nm程度までの場合、図2bに示すように複数のウェルを配列させることができる。
この構成を用いて、図3bに示すように、ウェル131aの底部の露出した電極表面上にのみプローブ2となるバイオ分子を固定化する。
フォトファブリケーション技術はすでにICやLSI製造技術の1つとして確立されているため、従来のDNAチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。
まず、直径5μm以上の単一ウェル(第1の具体例)を作製する工程について説明する。基板10上にスピンコーターを用いて感光性材料であるフォトレジスト11を塗布し、90℃にて2分間ベーキングする(図4a,4b)。この実施例ではガラス基板を用いたが、アルミナ基板、シリコン基板、または、シリコーン樹脂のごとき樹脂製基板等のいずれの材質の基板も用いることができる。
次いで、フォトマスクを用いて紫外線12aで20秒間露光し(図4c)、フォトレジスト11を現像して電極配線13用の配線パターンを形成する(図4d)。フォトレジストには、露光によって結合が分解して現像液に溶解するもの(ポジ型)と、逆に重合して溶解しないもの(ネガ型)があるが、ここではフォトレジスト11としてポジ型レジスト(AZ1500:クラリアントジャパン株式会社)を用いた。
さらに、これをアセトンのごとき有機溶媒中に浸漬して、レジスト11を剥離することによって、ガラス基板10上に電極配線13を形成した(図4f)。電極配線13が形成されたチップの概略上面図を図6aに示す。図6において、一方の端部に円形のバイオ分子アレイ領域131が形成され、他方の端部には電気的信号を取り出すための角型パッド132が形成された電極配線が示されているが、これは電極配線の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。
また、電極配線の本数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。
したがって、ウェル底部の電極表面にのみストレプトアビジンが固定化されるように、前記のレジスト14はDTDPの−S−S−基が結合しない材料であることが必要である。
最後に、予めビオチン化したプローブDNA22のPBS溶液にストレプトアビジン固定化チップを浸漬することによって、ストレプトアビジン−ビオチンの特異的結合を介してプローブDNAをウェル底部に固定化した(図9c)。
この人工核酸の5’末端に、よく知られている方法によってビオチンを結合させて、ビオチン化プローブDNA22を作製した。
ストレプトアビジン−ビオチン間の特異的結合を利用して、ストレプトアビジンを修飾した分子と、ビオチンを修飾したもう一つの分子とを結合させる手法が一般的に用いられている。したがって、様々なタンパク質にビオチンを修飾する技術がすでに確立され、そのためのキットも市販されている。また、ビオチン修飾したDNAも商業的に入手可能である。
図10aは、実施例1に記載された方法によりSNOM観察用のマイカ基板上にストレプトアビジンを固定化し、このストレプトアビジンにビオチン化プローブDNAを結合したときのSNOM像である。このプローブDNAには、イソチオシアン酸フロオレセイン(FITC)が標識してある。この図から分かるように、5×5μm角の観察視野全体から蛍光発光が観察された。すなわち、均一にストレプトアビジンが配列されたことが確認された。
図10bは、FITCを標識していないプローブDNAをストレプトアビジンに結合させ、FITC標識ターゲットDNAをハイブリダイズさせたときのSNOM像である。この図から分かるように、観察視野全体から蛍光発光が観察され、ほぼ均一にハイブリダイゼーションが発生したことが確認された。
また、図10cは、FITCを標識していないプローブDNAをストレプトアビジンに結合させ、ターゲットとしてプローブDNAと同一の配列を有するDNAにFITCを標識したものを用いたときのSNOM像である。この図から分かるように、観察視野全体から蛍光発光は全く観察されなかった。これは、ターゲットDNAがプローブDNAと同一の配列を有するので、静電反発によってハイブリダイゼーションが全く発生しないからであるが、さらに、ターゲットDNAがウェル以外のレジスト膜に非特異的に結合しないことを示している。
かくして、本発明の方法によれば、電極表面に均一にプローブを固定化できることが確認された。
実施例1に記載された方法により作製された第1の具体例のDNAチップ1(バイオ分子アレイ領域上、直径200μmの単一ウェル)を用いてバイオセンサーを構築し、ターゲットDNA3の検出実験を行った。
具体的には、5mMのK3[Fe(CN)6]および100mM KClの混合水溶液中、DNAチップ1を作用電極とし、白金を対極とし、銀/塩化銀を参照電極として電気化学セルを構成して、サイクリックボルタンメトリーによって、DNAチップ1の酸化還元電位を測定した。また、測定は25℃にて行い、電位の掃引速度は50V/秒とした。
次に、PBS(pH7.4)中のターゲットDNA3溶液(DNA濃度:1μM)に、前記のハイブリダイズしていないDNAチップを30℃にて24時間浸漬し、その後、PBSで数回洗浄して未結合のターゲットDNA3を十分に除去して、プローブDNA22にターゲットDNA3がハイブリダイズしたDNAチップを作製した。このDNAチップを用いて電流電位曲線Bを得た(図11)。
図11に示す電流電位曲線において、ピーク電流値が酸化還元電流値を示している。
(1)人工核酸を用いた性能評価
次に、配列番号:2で示されるターゲットDNAに対して、一塩基のみ異なる人工SNP−DNAを用いて、第1の具体例のDNAチップ(バイオ分子アレイ領域上、直径200μmの単一ウェル)を作製し、本発明のDNAチップの検出性能を評価した。
このSNP−DNAは、配列番号:3:
酸化還元電流値の変化率を比較した結果の一例を図13に示す。本発明のDNAチップは、8本の電極を有しているので、一度に8点の測定を行うことができる。図13には、1回の測定で得られた8点の測定値のうち5点を示している。
プローブDNAに完全に相補的なターゲットDNAでの酸化還元電流の平均変化率−40%に対して、SNP−DNAでは−7%であった。すなわち、本発明のバイオチップを用いれば、DNA配列中単一の塩基が異なるだけで、酸化還元電流値に有意な差を示し、本発明のDNAチップがSNP検出に非常に有用であることが示された。
レプチンは、脂肪細胞で生合成、分泌され、摂食抑制とエネルギー消費高進をもたらすペプチドホルモンとして知られている。このレプチンに異常があると摂食抑制が正常に機能せず、過食と肥満を引き起こすことが知られている。したがって、レプチンをコードするDNAのSNPを簡便に検出できる手段が確立されれば、肥満の原因解明に役立つものと考えられる。
そこで、生体由来DNAとしてヒトレプチンDNAを用いて、同様の酸化還元測定を行った。ヒトレプチンDNAは、第7染色体長腕に約20kbの領域に広がる遺伝子であるが、この実験では、プローブDNAとして配列番号:4:
この実験において、完全に相補的なターゲットレプチンDNA(配列番号:5)に対する酸化還元電流値の平均変化率−40%に対して、SNP−DNA(配列番号:6)に対する酸化還元電流値の平均変化率は−9%であった。この測定結果から、本発明のDNAチップは実際の生体由来DNAにおけるSNP検出にも有効であることが示された。
バイオ分子アレイ領域上に200×200個の配列で直径100nmのウェルを形成した第2の具体例のDNAチップを作製し、実施例2(第1の具体例のDNAチップ)と同様の測定を行って、ウェル径がDNAチップの検出感度に与える影響を調べた。
このAFM像から、各ウェル(黒色円形に示される領域)にストレプトアビジン(ウェル内、白色で示される物質)が固定化されているのが確認された。また、観察視野全体にわたって、均一にウェル内にストレプトアビジンの存在が確認された。
直径200μmの単一ウェルが形成された第1の具体例のDNAチップを用いた場合、ターゲットDNA(配列番号:2)がプローブDNA22(配列番号:1)にハイブリダイズする前後での酸化還元電流の平均変化率が−40%であったのに対して、直径100nmウェルアレイ(200×200個)が形成された第2の具体例のDNAチップを用いた場合、ハイブリダイズ前後での酸化還元電流値の平均変化率が−60%となり、検出感度が向上した。
一方、ウェル径が200μmであれば、1つのウェル内に計算上約1018個のストレプトアビジンが存在すると考えられる。
Claims (6)
- 1または複数のプローブ一本鎖DNAが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に1または複数の電極配線が形成され、該1または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該1または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する1または複数の孔を設けることによって1または複数のウェルが形成され、該1または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖DNAが固定化されている該バイオチップ。
- 該プローブ一本鎖DNAの1の端部に第1の分子が結合され、該第1の分子と特異的結合する第2の分子が該ウェルの底部に固定化され、該第1の分子と該第2の分子との間の特異的結合によって該1または複数のウェル底部に該プローブ一本鎖DNAが固定化されている請求項1記載のバイオチップ。
- 該第1の分子がビオチンであって、該第2の分子がストレプトアビジンである請求項2記載のバイオチップ。
- 該一本鎖DNAがレプチンをコードするDNAの断片である請求項1記載のバイオチップ。
- 少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、該作用電極は、1または複数のプローブ一本鎖DNAが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に1または複数の電極配線が形成され、該1または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該1または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する1または複数の孔を設けることによって1または複数のウェルが形成され、該1または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖DNAが固定化されているバイオチップであり、
処理前に、該バイオチップの第1の電気的信号を測定し;
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第2の電気的信号を測定し;次いで、
第1の電気的信号と第2の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該1または複数のプローブ一本鎖DNAとハイブリダイズする非標識ターゲットDNAを検出することを特徴とするバイオセンサー。 - 該電気的信号が、酸化還元電流値である請求項5記載のバイオセンサー。
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