KR102512759B1

KR102512759B1 - 재사용 가능한 바이러스 신속 검출용 dna 바이오 센서

Info

Publication number: KR102512759B1
Application number: KR1020200066543A
Authority: KR
Inventors: 김남영; 김은성; 김주희; 박성준; 황철진; 박낙균; 김미란; 이용운
Original assignee: 주식회사 셀앤바이오
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2023-03-23
Also published as: KR20210149468A

Abstract

본 발명은 반복 사용이 가능한, 비표지(label free) 기반의 바이러스 탐지용 인터디지테이티드 전극(interdigitated electrode, IDE) 바이오 센서에 관한 것으로, 바이러스의 유전자 보존 영역인 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 유전자 영역을 검출함으로써 신속하면서도 정확하게 바이러스를 탐지할 수 있다.

Description

재사용 가능한 바이러스 신속 검출용 DNA 바이오 센서{ULTRA-FAST AND RECYCLABLE DNA BIOSENSOR FOR DETECTION OF VIRUS}

본 발명은 반복 사용이 가능한, 비표지(label free) 기반의 바이러스 탐지용 바이오 센서에 관한 것으로, 바이러스의 유전자 보존 영역인 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 유전자 영역을 검출함으로써, 신속 정확하게 바이러스를 탐지할 수 있다.

바이오 센서(biosensor)란 생물체의 특정한 기능을 가지는 표적물질인 효소, 항체, DNA 등을 인식하고 결합하는 리셉터가 신호 변환장치와 결합되어 생화학적 상호작용 및 인식반응을 전기적 신호로 변환함으로써 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 전기 화학적 센서를 의미한다.

바이오 센서는 다양한 생리활성 물질의 농도를 신속하게 정량화 할 수 있어 대상 물질의 종류에 따라 바이오, 화학, 환경 등의 활용 용도로 널리 사용될 것으로 기대되는 소자이다.

전기 화학적 센서를 이용한 표적물질의 검출 및 분석을 위해서는 표적물질이 가지는 미세한 특성에도 신호의 변화가 크게 나타날 수 있도록 높은 감도를 가지고 있어야 하며, 체액의 화학성분에 견딜 수 있는 화학적 안정성과 유체의 흐름에도 영향을 받지 않는 물리적 안정성을 지니고 있어야 한다. 또한 용이한 사용을 위하여 기존의 측정 플랫폼을 이용할 수 있어야 하며 경제성과 실용성을 위하여 대량 생산이 용이한 구조로 제작될 것이 요구된다.

한편, 2003년 9.6% 치사율의 SARS-CoV 출현, 2015년 36%의 높은 치사율을 보인 MERS-CoV에 이어 2019년 12월부터 시작된 신종 바이러스 감염증인 COVID-19는 치사율은 낮지만 돌연변이가 쉽게 일어나고 신종 감염병을 초래할 확률과 전파력이 높아 확진자의 수가 폭증하고 있는 상황이다.

반면, 현재 바이러스를 진단하기 위해 주로 사용되는 RT-PCR 방법은 환자 검체로부터 샘플을 추출하여 단일 가닥 상보 DNA(cDNA)로 역전사 변환한 뒤 바이러스 유전자를 표적으로 하는 특정서열의 프라이머(primer)로 RT-PCR을 행하여 DNA 존재 여부를 판단하는 형태로서, 고가의 검출 장비 및 소모품, 기술인력이 반드시 필요할 뿐 아니라 검사 시간이 24 ~ 72시간으로 현장 검사로 활용하기에 적합하지 않다는 한계점이 존재한다.

또한, 현재 사용되고 있는 현장 검사 진단기기는 저렴하고 간편하다는 장점이 있지만, 낮은 민감도가 한계점으로 지적되고 있어, 고감도의 현장 검사 진단기기의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

Layqah, L. A. & Eissa, S. An electrochemical immunosensor for the corona virus associ- ated with the Middle East respiratory syndrome using an array of gold nanoparticle-modified carbon electrodes. Microchimica Acta 186 (2019). Ilkhani, H. & Farhad, S. A novel electrochemical DNA biosensor for Ebola virus detection. Analytical Biochemistry 557, 151-155 (2018).

본 발명의 목적은 바이러스 진단용 인터디지테이티드 전극(interdigitated electrode, IDE) 바이오 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 센서를 포함하는 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 바이러스 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 바이러스 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은, 기판; 상기 기판의 상층부에 위치하는 포토레지스터층; 상기 포토레지스터층의 상층부에 위치하는 금속층;을 포함하고, 상기 금속층은 티타늄(Ti) 및 백금(Pt)의 두가지 금속층으로 구성된 것인, 바이오 센서를 제공한다.

구체적으로, 상기 바이오 센서는 인터디지테이티드(interdigitated electrode, IDE) 전극 32개를 포함해 채널 너비가 4100μm, 채널 길이는 100μm이고, 총 감지 면적은 약 13.12mm²가 되도록 제조한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 구체적으로 상기 금속층을 구성하는 티타늄(Ti) 및 백금(Pt)의 두가지 금속층은 각각 150nm의 두께로 구성된 것일 수 있으며, 상기 바이오 센서의 표면 중 금속층이 형성되지 않은 기판의 표면에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)이 부착되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 기판은 실리콘(silicon, Si), 실리콘 산화물(silicon oxide, SiO₂), 질화규소(silicon nitride, Si₃N₄), 사파이어(sapphire), 다이아몬드(diamond), 탄화규소(silicon carbide), 질화갈륨(gallium nitride, GaN), 게르마늄(germanium, Ge), 인듐 갈륨 비소화물(indium gallium arsenide, InGaAs), 갈륨 비소화물(gallium arsenide, GaAs), 황화납(lead sulfide) 및/또는 이들의 조합과 같은 어느 적합한 재료를 포함할 수 있으며, 본 실시예에서는 유리(SiO₂)를 이용하여 제조하였으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 바이오 센서는 센서 표면에 부착된 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)에 바이러스 유전체의 상보적 DNA(cDNA)와 혼성화(hybridization) 가능한 DNA가 고정화(immobilized)되어 있는 형태로 제조된 것일 수 있다.

특히, 코로나바이러스(Virus)는 코로나바이러스과(Coronaviridae)의 코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 속하는 RNA 바이러스로, 사람과 동물에게 호흡기 및 소화기계 감염을 유발하는 것으로 알려져 있다.

상기 바이러스는 주로 점막전염, 비말전파로 쉽게 감염되어 사람에게는 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 시작하지만 점차적으로 치명적으로 변화한다.

본 발명의 바이오 센서는 바이러스, 특히 COVID-19 바이러스 유전체의 상보적인 배열을 갖는 DNA를 프로브 DNA로 하여 바이러스의 존재 여부를 신속하게 검출할 수 있는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 검출 대상이 되는 바이러스의 유전자는 COVID-19의 RNA 의존성 RNA중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) 유전자 코딩 영역에 해당한다.

구체적으로, 본 발명의 바이오 센서는 상기 APTES에 고정화 된 프로브 DNA에 대상시료 내 존재하는 바이러스 RNA가 혼성화(hybridization)하는 과정에서 변화하는 캐패시턴스를 측정함으로써, 대상시료 내 바이러스 유전체의 수준을 검출하여 바이러스 감염 여부를 판별할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란, 바이러스의 존재 또는 전이를 검출, 판정 또는 예측하기 위한, 바이러스 관련 마커인 특정한 유전자류 또는 이들을 코드하는 폴리펩티드류와 결합 가능한 핵산, 항체 또는 이들의 균등물을 가리킨다.

본 발명에서 “폴리뉴클레오티드"란, RNA 및 DNA를 모두 포함하는 핵산을 의미하는 것으로 사용되었으며, 상기 DNA에는　cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 모두 포함된다. 또한 상기 RNA에는 전체 RNA, mRNA, rRNA 및 합성 RNA가 모두 포함된다. 또한, 본 명세서에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 "cDNA"란, 유전자의 발현에 의해서 발생한 RNA에 상보적인 서열의 DNA 사슬 전체 길이 및 그 부분 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 의미로 사용되었다.　cDNA는 RNA를 주형으로 하여, 폴리 T 프라이머를 이용하는 RT-PCR(역전사 효소-폴리메라제 연쇄 반응)에 의해서 합성될 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"란, 유전자의 발현에 의해서 발생한 RNA 또는 그것에서 유래하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 인식하고 증폭시키는, 연속하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의미로 사용되었다.

여기서 상보적인 폴리뉴클레오티드(상보쇄 또는 역쇄)란, 서열에 의해서 정의되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 전체 길이 서열, 또는 그 부분 서열(여기서는 편의상, 이것을 정쇄라 함)에 대하여 A:T(U), G:C라는 염기대합에 기초하여, 염기적으로 상보적인 관계에 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단, 이러한 상보쇄는 대상으로 하는 정쇄의 염기 서열과 완전히 상보 서열을 형성하는 경우에 한정되지 않고, 대상으로 하는 정쇄와 엄격한 조건하에서 혼성화(hybridization 또는 하이브리드화)할 수 있는 정도의 상보 관계를 갖는 것일 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 바이오 센서를 포함하는 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.

상기 바이러스 감염 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.

상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른 시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.

본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 바이오 센서를 이용하여 바이러스 관련 바이오마커를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, (a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계; (b) 상기 시료를 바이오 센서에 접촉시키는 단계; (c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오 센서 내 프로브 DNA에 결합됨에 따라 캐패시턴스(capacitance)의 변화를 감지하는 단계; 및 (d) 캐패시턴스의 변화정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 (a) 단계의 대상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 정액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 해당 기술분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 모든 종류의 시료를 사용할 수 있다.

또한, 상기 (c) 단계의 표적물질은 바이러스 유전체일 수 있고, 구체적으로는 바이러스의 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)의 코딩부를 포함하는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 바이러스의 검출이 가능한 모든 종류의 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 바이오 센서를 이용한 질병 진단을 위한 정보 제공 방법은 바이러스 감염에 의한 각종 감염증을 진단할 수 있으나, 상기 질병에 국한되지 않고 질병의 발병 또는 진행정도에 따라 바이러스의 유전체가 검출될 수 있는 모든 질병에 적용 가능하다.

본 발명의 기술분야에 숙련된 자들은 합당한 실험으로 이러한 방법의 다양한 단계들의 순서를 바꾸더라도 사용되는 특정 공정 및 물질에 따라 동일하거나 유사한 결과들이 나올 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 명세서에서 설명되는 다양한 단계들이 수행되는 순서 및 공정은 한정의 의미로 고려되어서는 안되며, 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자들은 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서 이러한 방법을 적절하게 수정하여 적용할 수 있을 것이다. 다양한 실시예에서는, 예시되는 단계들 중 하나 이상의 단계가 생략될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자는 원하는 결과를 여전히 획득하면서도 어떤 단계들이 생략될 수 있는지를 예를 들어, 사용되는 특정 물질, 물질의 품질, 이용가능한 시약(reagents), 이용가능한 장비 등과 같은 인자들에 근거하여 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 바이러스 감염 환자 시료에 바이러스 억제제 또는 치료제를 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 바이러스 억제제 또는 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 바이러스 유전체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제의 모니터링 방법을 제공한다.

본 발명에서 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제는 소분자, 화합물, 항체, 합성 뉴클레오티드 등의 형태일 수 있으며, 바이러스의 증식이나 전이를 억제하거나 바이러스 활성을 억제 또는 감염에 의한 증상을 치료 또는 개선시킬 수 있는 제제이면 제한없이 모두 적용될 수 있다.

본 발명에서는 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제를 처리한 시료에 대하여 바이러스 유전체의 수준 변화를 측정함으로써, 해당 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제의 바이러스 활성 억제 및 감염 증상의 치료 효과를 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제의 처리에 따라 시료 내 바이러스 유전체의 수준이 유의적으로 정상 시료의 범위 내에 포함되는 경우, 해당 바이러스 억제제 또는 바이러스 치료제의 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 바이러스 환자 시료에 바이러스 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 바이러스 유전체 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 바이러스 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 바이러스 치료제 후보물질을 처리한 시료에 대하여 바이러스 유전체 수준 변화를 측정함으로써, 해당 후보물질의 바이러스 억제능 및 바이러스 감염증 치료 효과를 판단할 수 있다. 예를 들어, 후보물질의 처리에 따라 시료 내 바이러스 유전체의 수준이 유의적으로 정상 시료의 범위 내에 포함되는 경우, 해당 후보물질을 바이러스 치료제로 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, (a) 700 μm 두께의 유리 웨이퍼를 초음파 욕조에서 아세톤, 이소프로필 알코올, 탈이온수(DI)의 순서로 5분간 세척하는 단계; (b) 스핀 코팅기를 사용하여 3μm 이상의 네거티브 포토레지스터(photo register, PR) 솔루션을 웨이퍼에 코팅하는 단계; (c) 웨이퍼에 포토레지스터가 잘 디벨로핑 될 수 있도록 섭씨 80 내지 200도에서 어닐링(annealing)하는 단계; (d) O₂및 N₂ 가스를 사용한 드라이 에칭 공정으로 포토레지스터를 디스컴(descum) 하는 단계; (e) 전자빔 증착을 통해 티타늄(Ti)과 백금(Pt)을 150nm 두께로 증착하는 단계; (f) 아세톤, 이소프로필알코올(IPA) 및 탈이온수를 사용하여 90초 내에 리프트 오프 머신을 이용하여 포토레지스터를 제거하는 리프트 오프(lift-off) 단계;를 포함하는, 바이오 센서의 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 (e) 전자빔 증착 단계는 5.0 x 10^-6 mTorr의 압력 하에서 수행되고, 전자 에너지는 10 kV로 고정되며, 0.5Å 의 최소 증착 속도 조건 하에서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 구체적으로 상기 (f) 단계 이후에, (g) 바이오 센서의 표면을 피라나 용액(Piranha solution)으로 80℃에서 세척하고, 10분간 UV/오존 처리하는 단계; (h) 에탄올에 함유된 5%(v/v) APTES를 센서에 떨어뜨린 후 건조하는 단계; 및 (i) 프로브 DNA를 5μM 농도로 현탁시킨 탈이온수 10 마이크로리터를 센서에 떨어뜨린 후, 60 ℃의 밀폐 용기에서 3 시간 동안 방치하는 단계;를 추가로 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바이오 센서는 라벨링이 필요 없고(label free), 간단하며, 매우 높은 민감도를 갖고, 초고속 반응시간(30초이내)으로 실시간 감지가 가능하며, UV 조사를 통한 표면 오존 처리로 재사용 가능한 것을 특징으로 한다.

상기 바이오 센서는 IDE(Interdigitated electrodes) 구조를 기반으로 한 고감도 바이오 센서로, 간단한 측정 원리를 가져 사용이 간편하고 생산 비용이 저렴하며, 제품의 소형화 및 상용화에 용이할 뿐 아니라, 형광물질이나 동위원소를 사용하지 않아 인체에 대한 유해성이 적다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 IDE 바이오센서의 COVID-19 DNA 검출을 위한 개념도를 나타낸 것이다(A: 기준 전극 및 작동 전극과 연결된 임피던스 분석기에 의한 캐패시턴스 측정 시스템의 배치. B: 유리 기판 표면에 퇴적된 인터디지테이티드 전극으로 구성된 바이오센서의 개략도. C: 디지털 카메라와 현미경으로 촬영한 생성 센서의 탑뷰 영상(스케일 바: 500㎛). D: IDE 바이오센서의 등가 회로. E: COVID-19 cDNA 검출용 프로브 DNA와 분석 물질 DNA의 혼합 반응에 따른 APTES 처리된 표면 구성 과정을 보여주는 도식도.)
도 2는 센서 표면처리에 따른 물리화학 및 전기적 검증결과를 나타낸 것이다(A: 표면 처리에 따른 접촉각 변화를 나타낸 것으로, 왼쪽부터 차례대로 맨 유리, UV/오존 처리 후, APTES 처리 후, 프로브 DNA 고정후. B: 맨 표면(상단, 검은색) 및 APTES 처리 후 표면(하단, 빨간색)에 대한 ATR-FT-IR 스펙트럼 결과, 검은색 화살표는 APTES 분자의 (C-H) 및 (N-H) 작용기를 나타냄. C: 프로브 DNA 고정화를 형광 현미경 및 히스토그램 분석한 결과로, 적색 형광의 강한 발현은 APTES와 프로브 DNA 사이의 성공적인 결합을 나타냄. D: 각 실험 단계의 캐패시턴스 측정; 맨 표면(검은색), APTES 처리 후(파란색), 프로브 DNA 고정 후(빨간색).)

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

공간적으로 상대적인 용어인 "아래(below)", "아래(beneath)", "하부(lower)", "위(above)", "상부(upper)" 등은 도면에 도시되어 있는 바와 같이 하나의 소자 또는 구성 요소들과 다른 소자 또는 구성 요소들 과의 상관관계를 용이하게 기술하기 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시되어 있는 방향에 더하여 사용시 또는 동작시 소자의 서로 다른 방향을 포함하는 용어로 이해되어야 한다.

또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

본 발명의 실시예들에 따른 바이오 센서는 바이오 시료에 포함되어 있는 바이오 분자(biomolecule)를 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는데 이용된다. 바이오 센서는 분석하고자 하는 바이오 시료의 대상에 따라 그에 맞는 프로브(probe) 또는 리셉터들을 채용한다. 바이오 센서에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함한다. 칩 형태로 제조된 바이오 센서는 바이오칩으로도 지칭된다. 예를 들어, 각각 채용되는 프로브의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로도 지칭될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 바이오 센서는 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머란, 공유 결합된 두개 이상의 모노머(monmer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 5-30개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다.

올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.

뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.

아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.

펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.

특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 5-30개의 뉴클레오타이드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

준비예 1. IDE 바이오 센서의 제조 및 실험에 필요한 재료의 준비

본 발명의 실험을 위하여, 합성 COVID-19 유전자와 급성 호흡기 증후군(SARS)-CoV의 유전자가 사용되었으며, COVID-19 유전자는 COVID-19의 RNA 의존성 RNA중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) 유전자에서 표적 시퀀스를 선택하였다. 프로브 DNA는 목표 염기서열인 COVID-19의 RdRP와 안정적인 이중가닥을 형성하도록 설계되었다.

양성 대조군은 사스-CoV 유전자를 기반으로, 4개의 염기쌍이 프로브 DNA와 미스매치 되도록 하였다.

구체적으로, 프로브 DNA 서열(5`-인산염-GCA TCT CCT GAT GTT CCA CCT G -3`, 이하 서열번호 1), 표적 분석물질의 상보적 서열(5`-CAG GTA CCT CAT CAGT ATG C -3`, 이하 서열번호 2) 및 비상보적 서열(5`-CCA GGT GGA ACA TCA TCC GGT GAT GC -3`, 이하 서열번호 3)을 바이오닉스(Bionics, 서울, 한국)에서 주문하였고, 황산, 과산화수소, 무수 에탄올은 삼춘(서울, 한국)에서 구입하여 준비하였다.

3-아미노프로필트리에톡시실레인(3-Aminopropyltriethoxysilane, 이하 APTES)은 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 사용 전 건조하고 환기가 잘 되는 장소에 보관하였다. 다른 모든 화학 물질은 가장 순도가 높은 분석 등급(analytical grade)으로 준비하였고, 실험 내내 탈이온수(deionized water, DI) (Mili-Q^® 시스템, 18.2 MΩ.cm, 25°C)를 사용하였다.

실시예 1. 인터디지테이티드 전극(IDE) 바이오 센서의 제작

본 발명의 인터디지테이티드 전극(interdigitated electrode, IDE) 바이오 센서는 표적 바이러스의 RNA 서열과 상보적인 DNA 서열을 바이오센서 표면에 부착한 형태로 제조되었다.

구체적으로, 탐지 대상 물질인 바이러스의 핵산(DNA 또는 RNA)이 바이오센서 표면에 부착된 프로브 DNA와 혼성화(hybridization)하면, 각 핵산 가닥 사이에 수소결합을 형성하여 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 되고, 이때 전극 사이의 공간 전하 분포가 강화되어 캐패시턴스 값이 증가하게 된다.

따라서, 캐패시턴스의 변화 값을 관찰함으로써 IDE 바이오 센서의 감지 응답을 얻을 수 있다.

상기 바이오 센서의 제작 과정을 구체적으로 기재하면 다음과 같다.

700 μm의 두께를 갖는 6인치의 EagleXG Glass 웨이퍼를 초음파 욕조에서 아세톤, 이소프로필 알코올, 탈이온수(DI)의 순서로 5분간 세척해 준비하였다. 이때, 상기 EagleXG Glass는 모래 70~80%, 붕소 화합물 7~13%, 알칼리 4~8%, 알루미나 2~7%로 구성된 것으로 준비하였다.

세척 후 유리 웨이퍼를 가압 질소 가스로 부드럽게 날리고 70˚C로 유지하여 잔여 수분을 제거하였다.

IDE는 기존의 포토리소그래피(photolithography) 공정을 이용해 유리 웨이퍼에 구축하였다.

이를 상세히 기술하면, 우선 상기 세척과정을 거친 웨이퍼에 스핀 코팅기를 사용하여 포토레지스터(photo register, PR)를 코팅하였다. 구체적으로, PR 스핀 코팅에서 3μm 이상의 네거티브 PR 솔루션을 사용하였고, 네거티브 PR은 UV에 노출되는 부분은 남아 있고 노출되지 않은 부분이 에칭되도록 하였다.

다음 단계는 UV를 이용한 마스크 프로세스로, IDE 디자인 패턴 마스크를 웨이퍼 상단에 사용하였으며, UV 광선을 완전히 받을 수 있도록 수 초 내지 수 분 동안 UV 광선을 조사하였다.

다음 단계로서, UV에 노출된 포토레지스터가 잘 디벨롭 될 수 있도록 섭씨 80 내지 200도에서 어닐링(annealing) 하였다.

그 다음 단계는 포토레지스터 에칭 단계로서, ICP PR Asher(DAS-2000)와 O₂및 N₂ 가스를 사용한 드라이 에칭 공정으로 포토레지스터 디스컴(descum)을 실시하였다.

이후 단계는 금속 증착 단계로서, 전자빔 증착을 통해 티타늄(Ti)과 백금(Pt)을 150nm 두께로 증착하였다. 구체적으로, 상기 전자빔 증착 공정에서, 유리 기판 상에 부착하기 위해 먼저 Ti가 사용되고, Pt는 유리 표면 상에 직접 부착될 수 없기 때문에 Ti 상에 Pt가 증착되도록 하였다. 상기한 바, 전자빔 증착된 Ti 및 Pt의 두께는 각각 150nm로 동일하게 하였다. 상기 증착 공정은 5.0 x 10^-6mTorr의 압력 하에서 수행되었고, 전자 에너지는 10 kV로 고정되었다. 또한, 정확한 층 두께를 얻기 위해 0.5Å/s의 최소 증착 속도를 설정하였다.

다음 단계는 리프트 오프(lift-off) 단계로, 아세톤, 이소프로필알코올(IPA) 및 탈이온수를 사용하여 90초 내에 리프트 오프 머신을 이용하여 포토레지스터를 제거하였다. 본 실시예에서는 화학적 리프트 오프 방법을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

마지막 단계로, 웨이퍼를 인터디지테이티드 전극 32개를 포함해 채널 너비가 4100μm인 단일 칩으로 자르고, 채널 길이는 100μm로 총 감지 면적은 약 13.12mm²이 되도록 하였다.

실시예 2. DNA 혼성화를 위한 IDE 바이오 센서의 표면 처리

상기 IDE 바이오 센서의 유리 표면에 프로브 DNA를 고정화시키기 위해 다음과 같은 단계를 거쳐 표면 처리를 실시하였다.

먼저, IDE 바이오 센서의 표면 중 금속층이 형성되지 않은 유리 표면에 히드록실 그룹을 도입하기 위하여 기능화를 실시하였다.

구체적으로, 센서를 3:1 농축 H₂SO₄/H₂O₂(aq) 용액(이하 피라냐 용액)으로 80˚C에서 15 내지 20 분 동안 세척한 후 탈이온수(DI)로 헹구어 시약을 제거하였다. 그 후 UV/오존 처리를 10분간 실시(UVO Cleaner, 모델 30, Jightural Company, Inc.)하여 센서 표면이 친수성이 되도록 개질하였다.

이후, 에탄올에 함유된 5%(v/v) APTES를 센서 표면에 떨어뜨리고 건조시켜, APTES의 아민기를 프로브 DNA와 반응하기 위한 링커 분자로 기능화(functionalized) 하고, 흡착되지 않은 잔여 APTES를 제거하기 위해 탈이온수(DI)로 헹구고 상온에서 건조하였다.

마지막으로, 센서를 특성화(Characterization) 하기 위하여 프로브 DNA를 5μM 농도로 현탁시킨 탈이온수 10 마이크로리터를 센서에 떨어뜨린 후, 즉시 60 ℃의 밀폐 용기에 3 시간 동안 방치하여 반응시켰다. 반응하는 동안 프로브 DNA는 인광산염 결합(phosphoramidate linkage)의 원-스텝 반응을 통해 아민 기능화된 유리 표면에 고정되었다. 이때, APTES와 프로브 DNA는 아민과 인산염 사이의 분자 반응에 의해 공유 결합을 형성하게 된다.

반응 후에는 탈이온수로 센서를 철저히 헹궈 잔여 프로브 DNA를 제거하고, 상온에서 건조시킨 후 밀폐된 용기에 보관하였다.

실시예 3. 분석 대상물질의 검출 및 검증

본 발명의 IDE 바이오 센서를 이용하여, 바이러스의 유전체와 반응시켰을 때의 캐패시턴스 변화 여부를 측정하였다.

모든 실험은 5쌍씩(quintuplet) 수행되었으며, 먼저 탈이온수 용액에 5μM의 COVID-19 cDNA 및 사스-CoV cDNA를 현탁시켜 분석액을 준비하였다. 상기 cDNA는 RNA 바이러스인 바이러스의 유전체에 상보적 서열을 갖는 DNA를 의미한다.

혼성화를 위해 상기 분석액 10μL를 바이오센서에 떨어뜨린 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 60˚C에서 1시간 동안 배양하였다.

이후 탈이온수로 센서를 개별적으로 세척해 혼성화 되지 않은 DNA를 제거하고 상온에서 건조시켰다.

캐패시턴스 값은 임피던스 분석기(HIOKI, IM3570)를 사용하여 10Hz ~ 1kHz의 주파수 범위에서 측정하였다. 통계적 유의성을 위해 쌍체 t-검정 및 p-값을 사용하여 모든 결과를 수집하고 통계적으로 분석하였다.

도 1은 IDE 바이오센서의 COVID-19 DNA 검출을 위한 캐패시턴스 주파수(C-f) 측정 과정에 대한 개념도이다.

본 발명의 바이오센서는 여러 개의 칩을 반복적으로 장착 및 인출하기 용이함으로써, 신뢰성 있고 빠른 방식으로 신호를 감지할 수 있다.

도 1B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 IDE 센서는 종래의 센서보다 생물 종을 탐지하기 유효 영역이 더 크고, 더 나은 공간 능력과 반응성을 가질 수 있다는 이점이 존재한다.

본 발명 IDE 센서의 구조는 64개의 전극 핑거로 구성되며, IDE의 폭과 길이는 각각 4100mm와 100mm로 총 13.12mm²의 감지 면적을 제공한다(도 1C).

IDE를 구축한 후에는 도 1D와 같이 DNA와 APTES의 실레인 그룹과의 공유 결합을 형성하기 위해 유리 기판의 표면 처리를 실시하였다. 구체적으로, 상기한 유리 기판의 표면 처리는 반응 시간과 매질의 농도를 정밀하게 제어하여 잘 정련되고 단쇄 기능화된 실레인을 형성하고(1단계), 순차적으로 프로브 DNA를 상기 APTES가 기능화 된 유리 기판에 고정시켜 이루어진다(2단계). 표면에 배열된 프로브 DNA 층은 표적 DNA에 대한 접근성을 보장하기 위한 필수 조건이다.

DNA 고정화 과정은 유리의 거친 표면, 배양 시간, 농도에 쉽게 영향을 받을 수 있기 때문에, 표면의 탐침 DNA 분자의 수를 극대화할 수 있는 조건인 5μM의 농도에서 3시간 동안 배양하였다.

그 결과, 표적 DNA가 프로브 DNA와 혼성화하면 수소결합을 형성하여 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 되고, 이때 전극 사이의 공간 전하 분포가 강화되어 캐패시턴스 값이 증가하게 된 것을 확인하였다.

한편, 바이오센서는 센서에 고정된 프로브 DNA의 상태에 영향을 많이 받기 때문에, 대상 DNA와의 효과적인 혼성(hybridization)을 위하여 바이오센서의 표면을 최적화하는 것이 매우 중요한데, 이를 통해 바이오센서의 높은 특이도 및 민감도를 확보하는 것이 가능해지기 때문이다.

때문에, 바이오센서의 제조과정 각 단계에서는 반응 표면의 생리화학적 분석을 수행하여 탐침과 대상 DNA의 호환성을 검증하였다.

도 2A는 바이오센서의 표면 처리 후 표면의 접촉각을 측정한 결과를 나타내었다. 맨 표면의 접촉각은 45.8도였고, 피라냐 용액과 UV/오존 처리 후 히드록실기로 표면이 개질된 후의 표면의 접촉 각도는 3도 미만의 측정 불가능한 값으로 감소하는 것을 확인하였다.

APTES 처리 후에는 접촉각이 39.4도로 증가하여 노출된 자유 친수성 아민기로 구성된 실레인 분자 층의 균일한 커버리지가 얻어지는 것을 확인하였다. APTES의 탄화수소(EtO) 그룹의 노출은 접촉 각도가 증가된 소수성 표면을 생성하여 프로브 DNA 분자의 결합 부위가 적어짐을 의미한다. APTES의 아민 그룹의 이상적인 접촉각은 41˚이므로, 상기 결과는 센서의 표면이 히드록실화에 이어 성공적으로 아민화가 되었음을 나타낸다.

프로브 DNA가 APTES에 고정될 때에는, DNA가 존재함에 따라 바이오센서 표면 성질이 변화하면서 접촉 각도가 점차 증가하였다.

ATR-FT-IR 분석은 유효 표면에서 화학 반응이 존재하는지 확인하기 위해 수행되었다(도 2B). 유리 표면의 APTES 층의 효과적인 조립은 각각 N-H와 C-H 결합의 스트레칭을 나타내는 1568 cm^-1과 2800-2980 cm^-1 대역에서의 강한 흡수 피크를 통해 확인하였다.

한편, 프로브 DNA 고정화는 ELISA에 의해서도 강한 형광을 발하여 성공적으로 검증되었다(도 2C).

전술한 바이오센서 표면 처리에 따른 물리화학적 분석을 위해 C-f 전기적 특성화를 도 2D와 같이 수행하였다.

본 실험에 사용된 장치가 103Hz 이상의 주파수에서 용량성 응답을 보이지 않았기 때문에 캐패시턴스 값은 10~103Hz에서 측정되었다. 캐패시터에 인가되는 주파수가 증가하면 전극 사이의 내부 공간에 있는 전하가 주파수에 따라 한 전극에서 다른 전극으로 빠르게 통과할 수 있기 때문에 정전 리액턴스(Xc)가 감소한다. 용량성 리액턴스는 다음 방정식으로 표현할 수 있다.

여기서 Xc는 옴 단위의 정전 리액턴스, f는 헤르츠 단위의 주파수, C는 패러드의 캐패시턴스다.

바이오센서의 표면에 기능화된 물질의 유전체 상수는 공기(ε=1)보다 높고, 실제로 기능화된 APTES와 DNA의 복잡한 탄소 체인의 유전 상수는 각각 대략 ε=3.57과 ε=~8인 것으로 보고되고 있다.

10Hz의 낮은 주파수에서 바이오센서의 표면 처리 각 단계에서 신뢰할 수 있는 차이가 관찰되었다. 단계별 표면 처리 단계에서는 자가 조립된 모노레이어와 프로브 DNA의 유전체 상수가 공기보다 높기 때문에 캐패시턴스 값이 증가한 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

바이오 센서에 있어서,
기판; 상기 기판의 상층부에 위치하는 포토레지스터층; 상기 포토레지스터층의 상층부에 위치하는 금속층;을 포함하고,
상기 금속층은 티타늄(Ti) 및 백금(Pt)의 두가지 금속층으로 구성된 것으로서,
상기 바이오 센서는 인터디지테이티드(interdigitated electrode, IDE) 전극 32개를 포함해 채널 너비가 4100μm, 채널 길이는 100μm이고, 총 감지 면적은 13.12mm²이며,
상기 금속층을 구성하는 티타늄(Ti) 및 백금(Pt)의 두가지 금속층은 각각 150nm의 두께로 구성된 것이고,
상기 바이오 센서의 표면 중 금속층이 형성되지 않은 기판 표면에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)이 부착되어 바이러스 유전체의 상보적 DNA(cDNA)와 혼성화(hybridization) 가능한 DNA가 고정화(immobilized)되어있으며,
상기 고정화된 바이러스 유전체의 cDNA에 혼성화되는 바이러스의 유전체 수준을 검출하여 바이러스 감염 여부를 판별하는 것인, 바이오 센서.
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제1항의 바이오 센서를 포함하는 것인, 바이러스 감염 진단용 키트.
제7항에 있어서,
상기 바이러스 감염 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태 중 어느 하나의 형태인 것인, 바이러스 감염 진단용 키트.
제8항에 있어서,
상기 바이러스 감염 진단용 키트는 PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, DNA 중합효소, dNTP, 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂및 KCl로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것을 추가로 더 포함하는 것인, 바이러스 감염 진단용 키트.
(a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료를 제1항의 바이오 센서에 접촉시키는 단계;
(c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오 센서 내 상보적 DNA(cDNA)에 결합됨에 따라 캐패시턴스(capacitance)의 변화를 감지하는 단계; 및
(d) 캐패시턴스의 변화정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 바이러스 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어서,
상기 (a) 단계의 대상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 정액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이고,
상기 (c) 단계의 표적물질은 바이러스의 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)의 코딩부를 포함하는 RNA인, 바이러스 감염증의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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