KR102306735B1

KR102306735B1 - 이중 맞물린 형태의 이중 인터디지털 커패시터 센서 칩을 이용한 초고감도의 코로나바이러스 검출 방법

Info

Publication number: KR102306735B1
Application number: KR1020210006177A
Authority: KR
Inventors: 김남영; 김은성
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-09-28

Abstract

본 발명은 3초 이내에 판별이 가능하면서도 반복 사용이 가능하고, 비표지(label free) 기반의 초고감도로 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)를 검출할 수 있는 바이오 센서에 관한 것으로서, 구체적으로는 산화 그래핀(graphene oxide; GrO)으로 코팅된 이중 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC) 바이오 센서 및 상기 바이오 센서를 이용하여 코로나 바이러스를 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

이중 맞물린 형태의 이중 인터디지털 커패시터 센서 칩을 이용한 초고감도의 코로나바이러스 검출 방법{ULTRA-HIGH SENSITIVITY CORONAVIRUS DETECTION METHOD USING DOUBLE INTERDIGITATED CAPACITIVE SENSOR CHIP}

본 발명은 3초 이내에 판별이 가능하면서도 반복 사용이 가능하고, 비표지(label free) 기반의 초고감도로 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)를 검출할 수 있는 바이오 센서에 관한 것으로서, 구체적으로는 산화 그래핀(graphene oxide; GrO)으로 수정된 이중 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC) 바이오 센서 및 상기 바이오 센서를 이용하여 코로나 바이러스를 측정하는 방법에 관한 것이다.

2003년 9.6% 치사율의 SARS-CoV 출현, 2015년 36%의 높은 치사율을 보인 MERS-CoV에 이어 2019년 12월부터 시작된 신종 코로나바이러스 감염증인 COVID-19는 치사율은 낮지만 돌연변이가 쉽게 일어나고, 신종 감염병을 초래할 확률과 전파력이 높아 확진자의 수가 폭증하고 있는 상황이다.

현재 바이러스를 진단하기 위해 주로 사용되는 RT-PCR 방법은 환자 검체로부터 샘플을 추출하여 단일 가닥 상보 DNA(cDNA)로 역전사 변환한 뒤 바이러스 유전자를 표적으로 하는 특정서열의 프라이머(primer)로 RT-PCR을 행하여 DNA 존재 여부를 판단하는 형태로서, 고가의 검출 장비 및 소모품, 기술인력이 반드시 필요할 뿐 아니라 검사 시간이 24 ~ 72시간으로 현장 검사로 활용하기에 적합하지 않다는 한계점이 존재한다.

또한, 용량성 바이오 센서 등 다양한 첨단 바이오 센싱 기술이 개발되고 있으나, 고감도, 빠른 결과 판별, 재사용 가능이라는 세가지 필요성 모두를 만족시킬 수 있는 기술이 존재하지 않아, 이와 같은 기술의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

대한민국 등록특허 10-0832860호

본 발명의 목적은 코로나 바이러스 검출용 산화 그래핀(graphene oxide; GrO)으로 수정된 이중 맞물린 형태의 이중 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC) 바이오 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표지가 필요 없고, 신속하며, 매우 민감하고 재사용 가능한 코로나 바이러스를 검출할 수 있는 바이오 센서 및 이를 이용한 코로나 바이러스 항원(코로나 바이러스의 스파이크 단백질(S1))의 검출 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면은, 기판; 상기 기판 상에 위치한 티타늄 전극; 상기 기판 상에 위치한 백금 전극; 및 상기 기판 표면의 적어도 일부에 산화 그래핀으로 개질된 고정부를 포함하는, 바이오 센서를 제공한다.

상기 바이오 센서는 간단한 방법으로 세척 후 활성화하여 재사용할 수 있으며, 지속적인 재사용 시에도 특성을 유지할 수 있다.

본 발명에서 상기 기판은 유리기판(Glass), 실리콘(silicon, Si), 실리콘 산화물(silicon oxide, SiO₂), 질화규소(silicon nitride, Si₃N₄), 사파이어(sapphire), 다이아몬드(diamond), 탄화규소(silicon carbide), 질화갈륨(gallium nitride, GaN), 게르마늄(germanium, Ge), 인듐 갈륨 비소화물(indium gallium arsenide, InGaAs), 갈륨 비소화물(gallium arsenide, GaAs), 황화납(lead sulfide), 및 폴리에미드(Polyimide) 필름, PET(Polyethylene Terephthalate) 필름, PET 합성 필림 또는 이들의 조합과 같은 어느 적합한 재료를 포함할 수 있으며, 또한 본 실시예에서는 실리콘 산화물(SiO₂)을 이용하여 제조하였으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명의 바이오 센서는 상기 고정부에 코로나 바이러스의 항원으로서 스파이크 단백질인 S1 단백질(SARS-CoV-2 Spike S1)의 항체(antibody)가 고정화(immobilized)되어 있을 수 있으며, 상기 항체와 대상시료 내 존재하는 S1 단백질의 결합 과정에서 변화하는 정전용량을 측정함으로써, 대상시료 내 코로나 바이러스의 항원인 S1 단백질의 수준을 검출함으로써 코로나 바이러스 감염 여부를 진단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 티타늄 전극 및 백금 전극은 각각 적어도 하나의 가지가 20~200 μm의 간격으로 서로 교호 배치(alternately arranged)된 맞물린 형태의 구조일 수 있다. 맞물린 형태의 구조란, 상기 가지가 마치 깍지낀 손가락과 같이 일 전극과 타 전극이 번갈아 배치된 것을 의미할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 고정부는 기판 상에 화합물이 결합하여 일종의 화학층을 형성한 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 고정부에 코로나 바이러스 스파이크 S1 단백질의 항체(antibody)가 고정화(immobilized)된 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 고정부는 기판 상에 형성된 산화 그래핀 시트에 EDC-NHS 커플링을 이용하여 그래핀 시트와 S1 단백질의 항체(antibody)가 아미드 결합을 형성하도록 한 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 EDC는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)이고, NHS는 N-히드록시 석신이미드(N-Hydroxy succinimide)로서, 아민 및 카복시 그룹에서 강력한 공유결합을 형성하여 항체를 견고하게 고정하기 위하여 사용되었다.

일 실시예에 있어서, 상기 바이오 센서는 대상시료 내 코로나 바이러스 항원의 수준을 검출할 수 있다. 구체적으로, 상기 코로나 바이러스 항원의 수준은 상기 바이오 센서의 정전용량 변화를 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 코로나 바이러스 항원 농도의 로그 값이 정전용량 값에 선형비례 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 측면은, 전술한 바이오 센서를 포함하는, 코로나 바이러스 진단용 키트를 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 코로나 바이러스 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화 할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.

본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 바이오 센서를 이용하여 다양한 바이오마커를 검출하는데 필요한 실험 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(H₂O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 (a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계; (b) 상기 시료를 전술한 바이오 센서에 접촉시키는 단계; (c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오 센서 내 리셉터(항체)에 결합됨에 따라 정전용량성(capacitive) 변화를 감지하는 단계; 및 (d) 정전용량성(capacitive) 변화 정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 대상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 콧물, 비루, 비강, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 정액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 (c) 단계의 표적물질은 바이오마커(biomarker)일 수 있으며, 구체적으로 스크리닝(screening) 바이오마커, 예후(prognostic) 바이오마커, 계층(stratification) 바이오마커, 효능(efficacy) 바이오마커, 독성(toxicity) 바이오마커, 반응예측(Predictive) 바이오마커 및 약역학(Pharmacodynamic) 바이오마커로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 가장 구체적으로는 코로나 바이러스의 스파이크 S1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 기술분야에 숙련된 자들은 합당한 실험으로 이러한 방법의 다양한 단계들의 순서를 바꾸더라도 사용되는 특정 공정 및 물질에 따라 동일하거나 유사한 결과들이 나올 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 명세서에서 설명되는 다양한 단계들이 수행되는 순서 및 공정은 한정의 의미로 고려되어서는 안되며, 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자들은 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서 이러한 방법을 적절하게 수정하여 적용할 수 있을 것이다. 다양한 실시예에서는, 예시되는 단계들 중 하나 이상의 단계가 생략될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자는 원하는 결과를 여전히 획득하면서도 어떤 단계들이 생략될 수 있는지를 예를 들어, 사용되는 특정 물질, 물질의 품질, 이용가능한 시약(reagents), 이용가능한 장비 등과 같은 인자들에 근거하여 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 코로나 바이러스 감염 환자 시료에 코로나 바이러스 치료제를 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 코로나 바이러스 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 S1 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 코로나 바이러스 치료제의 모니터링 방법을 제공한다.

본 발명에서는 코로나 바이러스 치료제를 처리한 시료에 대하여 S1 단백질 수준 변화를 측정함으로써, 해당 코로나 바이러스 치료제의 치료 효과를 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 코로나 바이러스 치료제의 처리에 따라 시료 내 S1 수준이 유의적으로 정상 시료의 범위 내에 포함되는 경우, 해당 치료제의 치료효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 코로나 바이러스 감염 환자 시료에 코로나 바이러스 치료제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 S1 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 코로나 바이러스 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 일 측면은, (i) 이중 터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor) 센서 칩을 피라냐 용액(황산과 과산화 수소를 3:1의 비율로 혼합)으로 80℃에서 1분 ~ 20분간을 선별 세척하고, 이후 에탄올과 탈이온수(DI)를 이용해 다시 세척하는 단계; (ii) 산화 그래핀(GrO) 4uL를 스핀 코터를 이용하여 500 ~ 1300 rpm, 30~80℃에서 선별하여 1~60분중에 개별적으로 선택하여 상기 센서 칩에 코팅하는 단계; (iii) 100℃의 핫플레이트에서 1 ~ 10시간중에 선별하여 산화 그래핀(GrO)를 어닐링하고, 실온에서 식히는 단계; (iv) 0.4M 및 0.1M 농도의 EDC-NHS를 스핀 코터를 이용하여 10 ~150rpm중에서 5 ~ 60분간 고정화 하는 단계; (v) 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 항체 5uL를 드롭 캐스트 방법(Drop cast Method)으로 칩에 처리한 후, 1 ~12시간 동안 인큐베이션 하여 항체가 고정되도록 하는 단계; 및 (vi) 고정되지 않은 잔여 항체에 의한 비특이적 반응을 차단하기 위해 소 혈청 알부민(BSA)을 처리한 후 실온에서 10~60분동안 처리하고 탈이온수(DI)로 세척하는 단계를 포함하는, 바이오 센서의 제조 방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 사용된 바이오 센서는 상기 피라냐 용액으로 세척한 후에 재사용할 수 있다. 상기 바이오 센서는 간단한 방법으로 처리하여 재사용할 수 있으며, 다수 회의 재사용 시에도 센서로서의 성능을 유지할 수 있다.

본 발명에 의한 바이오 센서는 적은 시료를 이용하여, 초고감도로, 코로나 바이러스 항원의 농도를 정량할 수 있는 효과가 있다.

또한, 표지가 필요 없어 표지자의 신호를 분석하는 것이 아닌 정전용량을 이용한 방법으로 빠른 시간 내에 코로나 바이러스 항원의 농도를 정량할 수 있고, 재사용이 가능하여 경제적으로도 우수한 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명에 의한 정전용량 기반의 바이오 센서의 작동 원리에 관한 개념도로서, (a) 인간의 콧물이나 비강으로부터 시료수집, (b) 이중 터디지털 커패시터 구조 및 등가회로, (c) 최종 바이오 센서, (d) 바이오 센서에 의한 SARS-CoV-2항원 검출의 기작, (e)그래핀 옥사이드에 내장된 S1 항원 바이오칩의 형태학적 거동, (f) 바이오 센서 칩의 스캔 이미지, (g) SARS-CoV-2 스파이크 S1 항원 존재 하의 금속 손가락 사이 경계 모습을 나타내는 스캐닝 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명 바이오 센서의 고정화, 항체부착 및 항원 결합 공정을 개괄적으로 나타낸 것으로서, 산화 그래핀을 이용한 표면 개질, EDC-NHS를 이용한 S1 단백질의 항체 고정 및 코로나 바이러스의 항원인 S1 단백질이 결합하는 양태의 개요를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명 바이오 센서의 민감도(a, b) 및 특이성(c, d)를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 바이오 센서의 반복 실현성 및 재활용성을 확인한 결과로서, (a) 하루의 시간 변화에 따른 정전용량 안정성, (b) 10일간의 정전용량 안정성, (c~e) 지속적으로 사용하여도 변화가 없는 Graphene oxide 및 EDC-NHS, 항체 및 SARS-CoV-2 Spiked Antigen의 각 농도에 따른 센서의 반복적인 동일한 값의 정전 용량 전달 저항(nF) 데이터이다.
도 5는 본 발명 바이오칩의 전자현미경(SEM) 사진으로, (a) DIDC 칩의 표면을 산화 그래핀(GrO)으로 코팅한 모습, (b) DIDC 기판에 EDC-NHS로 코팅한 모습, (c) 코로나 바이러스의 항체가 고정화 된 모습, (d) 코로나 바이러스의 항원인 S1 단백질이 고정된 모습, rm 밑의 그림은 DIDCdml 크리에 대한 실제적 사진이다.
도 6은 표면에 대한 접착상황을 확인하기 위한 (a) GrO DIDC칩, (b) EDC-NHS 기능화 된 IDC칩, (c) 항체 결합된 DIDC칩, (d) SARS-CoV-2의 스파이크 S1 이 결합된 모습, (e) 재사용성 팩터의 AFM 이미지이다.
도 7은 (a) bare DIDC칩, (b) 산화 그래핀(GrO)이 기능화 된 IDC칩, (c) EDC-NHS 기능화 된 DIDC칩, (d) 항체 결합된 DIDC칩의 FTIR 값을 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

공간적으로 상대적인 용어인 "아래(below)", "아래(beneath)", "하부(lower)", "위(above)", "상부(upper)" 등은 도면에 도시되어 있는 바와 같이 하나의 소자 또는 구성 요소들과 다른 소자 또는 구성 요소들 과의 상관관계를 용이하게 기술하기 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시되어 있는 방향에 더하여 사용시 또는 동작시 소자의 서로 다른 방향을 포함하는 용어로 이해되어야 한다.

또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

본 발명의 실시예들에 따른 바이오 센서는 바이오 시료에 포함되어 있는 바이오 분자(biomolecule)를 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는데 이용된다. 바이오 센서는 분석하고자 하는 바이오 시료의 대상에 따라 그에 맞는 프로브(probe) 또는 리셉터들을 채용한다. 바이오 센서에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함한다. 칩 형태로 제조된 바이오 센서는 바이오칩으로도 지칭된다. 예를 들어, 각각 채용되는 프로브의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로도 지칭될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 바이오 센서는 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머란, 공유 결합된 두개 이상의 모노머(monmer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 5-30개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다.

올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.

뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.

아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.

펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.

특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 5-30개의 뉴클레오타이드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 시료 및 장비 준비

모든 저장액(Stock Solution)은 Simplicity, Millipore(USA)의 물 분배기 시스템 Milli-Q로부터 공급된 탈이온수를 사용하여 제조되었다. SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 모노클로날 IgG 항체, HEK293에서 발현된 Rabbit Mab(Catalog Number: 40150-R007) 및 SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-His Recombinant Protein (HPLC-verified) (Catalog Number: 40591-V08H) (Expression Host: HEK293 Cells) (consists of 681 amino acids)은 중국 Sino Biological로부터 구입하였다. 과산화수소(H2O2), 황산 (H2SO4), EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride), NHS (N-Hydroxysuccinimide, 98+%), HS N-Hydroxysuccinimide, 8+%)(C₄H₅NO₃)는 Fisher Scientific로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 가장 순도가 높은 분석 등급(analytical grade)으로 준비하였다.

샌드위치형 바이오 전극을 특성화하고 코로나 바이러스 항원 농도를 계산하기 위해 임피던스 분석기 또는 LCR 미터가 사용되었고 차후에는 전용 케피시터 측정기를 사용할 예정이다. 용량 측정은 1 kHz 내지 100 kHz의 주파수 범위에서 개방 회로 전위에서 수행되었다.

생체 복합체의 표면 특성을 분석하기 위해 위해 원자력 현미경(AFM)을 태핑 모드(AFM (Model XE-Model XE- 100, Park Systems, 대한민국))에서 사용했다.

고분해능 저진공 주사 전자 현미경(High-Resolution low vaccuum Scanning Electron Microscope; SEM, FEI (Nova Nano SEM 200))으로 두께와 개질된 표면을 확인하였다. 준비된 시료 격자들은 한국나노기술원(KANC)의 FT-IR Nicolet5700으로 확인하였으며, DIDC 칩에 그래핀 산화물의 확산성과 습윤성을 확인하는데 OCA 25 접촉각 측정기를 사용하였다.

실시예 2 : 산화 그래핀(GrO)으로 표면을 코팅한 DIDC 바이오 센서의 준비 및 성능 검증

본 발명 바이오 센서를 다음과 같은 단계를 거쳐 제조하였다(도 2).

첫단계로 이중 터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor) 센서 칩을 피라냐 용액(황산과 과산화 수소를 3:1의 비율로 혼합)으로 80℃에서 1분 ~ 20분간을 선별 세척하고, 이후 에탄올과 탈이온수(DI)를 이용해 다시 세척하는 단계; (ii) 산화 그래핀(GrO) 4uL를 스핀 코터를 이용하여 500 ~ 1300 rpm, 30~80℃에서 선별하여 1~60분중에 개별적으로 선택하여 상기 센서 칩에 코팅하는 단계; (iii) 100℃의 핫플레이트에서 1 ~ 10시간중에 선별하여 산화 그래핀(GrO)를 어닐링하고, 실온에서 식히는 단계; (iv) 0.4M 및 0.1M 농도의 EDC-NHS를 스핀 코터를 이용하여 10 ~150rpm중에서 5 ~ 60분간 고정화 하는 단계; (v) 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 항체 5uL를 드롭 캐스트 방법(Drop cast Method)으로 칩에 처리한 후, 1 ~12시간 동안 인큐베이션 하여 항체가 고정되도록 하는 단계; 및 (vi) 고정되지 않은 잔여 항체에 의한 비특이적 반응을 차단하기 위해 소 혈청 알부민(BSA)을 처리한 후 실온에서 10~60분동안 처리하고 탈이온수(DI)로 세척하는 단계를 포함하는, 바이오 센서의 제조 방법으로 진행하였다.

상기 준비된 바이오 센서에 SARS-CoV-2의 스파이크 S1 단백질 항원을 처리하고, 표적 분석 물질의 결합으로 인한 바이오 칩의 정전용량 변화에 반응한 결과를 도 3에 나타내었다.

구체적으로, 산화 그래핀 처리한 DIDC 칩은 정전용량 증가량이 1.37nF (0.0261nF에서 1.4nF까지)임을 확인하였다. 이러한 정전용량의 증가는 산화 그래핀의 높은 전도율 때문인 것으로 보인다. 즉, 이러한 결과는 산화 그래핀 처리를 함으로써 더욱 높은 민감도를 가질 수 있음을 의미하는 것이다.

또한, 본 발명 바이오 센서의 특이성과 관련하여, 도 3의 c, d에 나타난 것과 같이 항원과 반응한 경우(녹색선)와 항체만 존재하는 경우(파란색)의 nF 값의 차이가 20배 가까이 현저히 차이나는 바, 이러한 결과는 본 발명 바이오 센서가 높은 특이성을 가지는 것을 의미한다.

구체적으로, 상기 바이오 센서의 주요 개념은 전하 분포(charge distribution), 유전 상수(dielectric constant) 및 전도성(conductivity)을 조절하는 것에 기반한다.

분석 대상 물질이 DIDC 바이오 센서에 배치되면 유전체(dielectric)와 반응하여 전하 분포 및 항체와 항원의 전도도가 함께 변경되고, 이러한 감지 매개 변수의 변화는 IDC의 용량성 리액턴스(capacitive reactance)에 해당한다.

따라서, IDC 전압을 통한 용량성 리액턴스를 관찰함으로써 IDC 바이오 센서의 감지 응답을 얻을 수 있다.

정전용량 기반 감지 기술은 다른 방법에 비해 민감도가 높고, 응답시간이 짧다고 알려져 있다. 그러나 상기 바이오 센서는 유리 기판 상에 생물학적 구성이 가미된 Ti/Pt를 구비하여 종래의 기술보다 감도와 선택성을 현저히 개선하였다. 이러한 독특한 설계는 보다 정확한 결과를 도출할 수 있도록 한다.

상기 바이오 센서는 3초 이내에 극 미량인 0.1pg/mL 수준까지 정전용량의 변화를 감지할 수 있었다. 상기 샌드위치기반 층대층(layer-by-layer) 배열은 분석 시간을 감소시켜 실시간으로 감지가 가능하였다.

실시예 3. 본 발명 바이오 센서의 재사용성 및 신뢰성 확인

본 발명의 DIDC 바이오 센서를 SARS-CoV-2 스파이크 S1 단백질(항원)의 농도를 달리하면서 정전용량 값을 모니터링함으로써 재사용성에 대하여 평가하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명 바이오 센서 칩의 정전용량 변화를 10시간 동안 측정한 결과 안정된 결과를 보였으며(도 4a), 10일간의 연속 정전 용량 값 또한 실온에서 저온으로 칩이 옮겨지면서 변화가 발생한 2일차를 제외하고는 전반적으로 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다(도 4b).

나아가, 1.0 x 10^-3ug/ml to 1.0 x 10^-15fg/ml까지 항원인 SARS-CoV-2-Spike (S1) protein의 농도를 달리하면서 정전용량을 확인하였으며, 반복적으로 3회 사용 가능한 것을 확인하였다(도 4 c-e).

생물표면은 빠르고 비파괴적 제어된 생물학적 시스템으로 인하여 활성화되었으며, 완전한 바이오 센서 절연 시스템의 균형잡히고 표류하지 않는 신호를 제공하였다. 매우 빠른 응답 시간인 3초의 응답시간 이내에서 정전용량의 변화를 확인하여 평가되었다.

이는 바이오 센서 칩이 80℃에서 피라냐 용액으로 세척 및 건조시킨 후 원래의 특성을 회복한 것을 나타낸다. 상기 DIDC 바이오 센서 칩은 3회 이상 재사용이 가능하여 장기적으로 제품 비용을 절감시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명 실시예에서는 동일한 DIDC 바이오 센서를 실험에 계속 사용하였으며, 각각의 분석을 3회 반복한 후에도 우수한 안정성을 보여 결과에 차이가 없음을 확인하여 본 발명의 DIDC 바이오 센서가 우수한 재사용성 및 안정성을 가지는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예는 3초 이내에 코로나 바이러스 항원의 선택성 및 감도 검출을 위해 생체 기능화된 IDC 전극(Ti / Pt)을 사용하여 라벨 없는 정전용량 바이오 센서를 제조한 것이다. 상기 바이오 센서는 신속하고 비용 절감적인 코로나 감염 확진을 실시간으로 수행하도록 구성되었으며, 이러한 코로나 바이러스 감염의 진단에는 매우 적은 양의 샘플이 필요했고 센서는 최대 10일 동안 재현성과 안정성을 나타내었다. 상기 바이오 센서는 신속하고 민감하며 선택적인 바이오 마커 검출이 시급히 요구되는 표적 질병 관리 프로그램에 적용될 수 있다.

실시예 4 : 정전용량 기반 바이오 칩의 표면 특성

정전용량 측정, AFM, SEM, FT-IR 분석을 통해 DIDC 칩의 표면 개질의 특성을 분석하였다.

1) SEM 이미지

도 5에 도시된 바와 같이 본 발명 바이오 센서 칩에 산화 그래핀(GrO), EDC-NHS, 항체 및 항원이 결합한 기판의 표면 형태를 초고분해능 저진공 주사 전자 현미경 (SEM, FEI (Nova Nano SEM 200))으로 관찰하였다.

2) AFM( Atomic force microscopy studies) 분석

도 6에 도시된 바와 같이 GrO DIDC칩, EDC-NHS 기능화 된 DIDC칩, 항체 결합된 DIDC칩, SARS-CoV-2의 스파이크 S1 이 결합된 표면을 특성화하기 위해 원자력 현미경 (AFM)을 태핑 모드(AFM (Model XE-Model XE- 100, Park Systems, 대한민국))에서 사용했다.

3) FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy) 분석

도 7에 도시된 바와 같이, Bare 바이오 칩(a)은 1060cm^-1에서 피크가 나타나 C-O 1차 알코올의 존재를 확인할 수 있다.

산화 그래핀을 처리한 바이오칩(b)는 C-O(방향족 에스테르)에 해당하는 1038cm^-1에서 피크가 존재하여 바이오칩상에 그래핀 산화물을 고정하여 아로마 링의 존재를 확인할 수 있다.

(c)에서는 EDC-NHS의 니트로 그룹에 해당하는 1567cm^-1에서 날카로운 피크 를 확인할 수 있다.

(d) 에서는 C-H 스트레치 피크에 해당하는 2976 cm^-1를 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(i) 이중 터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor) 센서 칩을 피라냐 용액(황산과 과산화 수소를 3:1의 비율로 혼합)으로 80℃에서 1분 ~ 20분간을 선별 세척하고, 이후 에탄올과 탈이온수(DI)를 이용해 다시 세척하는 단계;
(ii) 산화 그래핀(GrO) 4uL를 스핀 코터를 이용하여 500 ~ 1300 rpm, 30~80℃에서 선별하여 1~60분중에 개별적으로 선택하여 상기 센서 칩에 코팅하는 단계;
(iii) 100℃의 핫플레이트에서 1 ~ 10시간중에 선별하여 산화 그래핀(GrO)를 어닐링하고, 실온에서 식히는 단계;
(iv) 0.4M 및 0.1M 농도의 EDC-NHS를 스핀 코터를 이용하여 10 ~150rpm중에서 5 ~ 60분간 고정화 하는 단계;
(v) 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 항체 5uL를 드롭 캐스트 방법(Drop cast Method)으로 칩에 처리한 후, 1 ~12시간 동안 인큐베이션 하여 항체가 고정되도록 하는 단계; 및
(vi) 고정되지 않은 잔여 항체에 의한 비특이적 반응을 차단하기 위해 소 혈청 알부민(BSA)을 처리한 후 실온에서 10~60분동안 처리하고 탈이온수(DI)로 세척하는 단계를 포함하는, 바이오 센서의 제조 방법.
제1항의 제조 방법에 의해 제조된, 바이오 센서.
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제2항의 바이오 센서를 포함하는, 코로나 바이러스 검출용 키트
(a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료를 제2항의 바이오 센서에 접촉시키는 단계;
(c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오 센서 내 리셉터에 결합됨에 따라 정전용량성(capacitive) 변화를 감지하는 단계; 및
(d) 정전용량성(capacitive) 변화 정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제8항에 있어서,
상기 (a) 단계의 대상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 정액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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