KR20180129206A - 빗살형 전극에 나노입자을 증착시켜 TNF-alpha 측정 감도를 높인 나노바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 빗살형 전극에 금 나노입자를 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 및 이를 활용한 나노바이오센서에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 금 나노입자를 증착시킨 IDE를 사용하여, 수용체 분자에 더 잘 결합하며 생물학적 활성을 존속시키는 플랫폼을 제공하는 효과가 있다.
구체적으로는, 금 나노입자가 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하여, TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 빗살형(interdigitate) 전극 기반 면역센서를 개발하여, 일반적인 IDE에 비해 향상된 감도를 보이고 잘못된 부착이 일어나지 않도록 한다. 1pg/ml 내지 10ng/ml의 극미량 TNF-alpha 농도에 의존적으로 정전용량(커패시턴스) 값이 영향 받는 것을 확인하였고, 0.83pg/ml의 농도까지 측정 가능하므로, 인간의 혈장 내 TNF-alpha 농도를 그대로 측정할 수 있다.
향상된 감도를 보이는 바이오센서는 기존에 사용한 방법에서 소모되었던 비싼 형광 염료, 시약, 장비를 필요로 하지 않으며, 환자의 질병 진단 과정에서도 TNF-alpha 농도 측정 용도로 다양하게 응용될 수 있는 효과가 있다.

Description

빗살형 전극에 나노입자을 증착시켜 TNF-alpha 측정 감도를 높인 나노바이오센서{Nano-biosensor with interdigitated electrode for enhanced sensing TNF-alpha by deposition of nanoparticle}
본 발명은 빗살형 전극에 금 나노입자을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 및 이를 활용한 나노바이오센서에 관한 것이다.
전기화학 바이오센서는 그 민감성, 선택성, 간단성 및 낮은 가격에 의해 치료 진단, 식품 분석 및 환경감시(environmental monitoring) 분야에서 주목받고 있으며 주요 분석 도구로 자리매김하고 있다. 이런 이유로, 민감성과 선택성이 뛰어난 전기화학 바이오센서를 이용한 새로운 전략적 센서 플랫폼은 꾸준히 발전하고 있다.
종양 괴사 인자 alpha(TNF-alpha)는 알레르기성 비염 및 결막염을 포함하는 면역 및 염증 반응에서 중추적인 역할을 수행하는 것으로 보이는 사이토카인이다. TNF-alpha는 17 kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체(homotrimer)이다 (Smith, 1987). TNF-alpha는 다른 세포 종류와 함께, 단핵 세포 및 대식구로부터 유래된다. TNF-alpha의 조절은 알레르기성 결막염 및 TNF-alpha의 활성화와 관련된 다른 증상을 위한 치료적 전략으로 제안되었다.
TNF-alpha의 농도를 정밀하게 검출하면, 임상에서 사용하는 진단 및 신약 개발을 위한 약리적 반응 검사에 적용할 수 있다.
전기화학 바이오센서에 대한 대다수의 연구는 민감한 전기화학 센서를 고안함에 있어 금속 나노입자의 혼합에 주목해 왔다. 촉매 활성, 광학, 전기 및 자기력과 같은, 벌크(bulk) 구조에서는 나타나지 않는 나노입자 고유의 특성들을 얻기 위해, 최근 많은 노력이 전기를 이용한 나노입자 증착에 집중되어왔다.
본 발명자들은, 인듐 주석 산화물(ITO) 마이크로디스크 전국 어레이(MDEA) 칩 위에 증착된 Au 나노입자(NP) 혼합물(hybrid) 구조로 구성된 새로운 나노 바이오센서를 만들었고, 이를 TNF-alpha 나노바이오센서로 적용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 물질적 특성과 나노구조에 의해 금 나노입자를 증착시킨 빗살형 전극(AuNP=IDE)을 제조하여, 기존 IDE보다 측정감도를 높임으로써, 미량의 TNF-alpha 물질을 경제적이고 안정적으로 검출할 수 있는 나노바이오센서를 제공하고자 함에 있다. 또한 이러한 나노바이오센서의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면에 나노입자가 증착되어 있고, 결합된 항체를 포함하는, 빗살형(Interdigitate) 전극을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 결합된 항체는 TNF-alpha 항체인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 결합은 공유 결합인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 빗살형(Interdigitate) 전극은 복수 개의 빗살형 핑거가 서로 이격되어 배열된 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서를 제공한다.
또한 본 발명은, (a) 빗살형 전극 표면에 전기적 증착(Electrodeposition)으로 나노입자를 증착시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계를 거친 빗살형 전극에 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 상기 (a) 단계의 나노입자는 금(Au) 나노입자이며, 상기 (b) 단계의 항체는 TNF-alpha의 항체인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계; (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는, 시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 금 나노입자를 증착시킨 빗살형 IDE를 사용하여, 수용체 분자에 더 잘 결합하며 생물학적 활성을 존속시키는 플랫폼을 제공하는 효과가 있다.
구체적으로는, 금 나노입자가 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하여, TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 빗살형(interdigitate) 전극 기반 면역센서를 개발하여, 일반적 IDE에 비해 향상된 감도를 보이고 잘못된 부착이 일어나지 않도록 한다. 1pg/ml 내지 10ng/ml의 극미량 TNF-alpha 농도에 의존적으로 정전용량(커패시턴스) 값이 영향 받는 것을 확인하였고, 0.83pg/ml의 농도까지 측정 가능하므로, 인간의 혈장 내 TNF-alpha 농도를 그대로 측정할 수 있다.
향상된 감도를 보이는 바이오센서는 기존에 사용한 방법에서 소모되었던 비싼 형광 염료, 시약, 장비를 필요로 하지 않으며, 환자의 질병 진단 과정에서도 TNF-alpha 농도 측정 용도로 다양하게 응용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 최종적으로 제조된 IDE의 모습 사진. (a)는 8개의 반응 챔버를 가진 IDE의 사진. (b)는 반응 챔버를 확대한 사진. 빗살형 전극의 모양을 확인 가능하다. (c)는 빗살형 IDE 표면을 찍은 전자현미경 사진. 추가 증착된 것이 없는 모습이다. (d)는 금의 나노입자가 증착된 빗살형 전극 표면을 찍은 전자현미경 사진.
도 2는 하나의 IDE 팔(WE)과 두 개의 IDE 팔(WE+CE)에 AuNP를 증착시키고, 1X PBS 용액에서의 IDE의 임피던스와 정전용량(커패시턴스)를 분석한 그래프. (a)는 임피던스 그래프. (b)는 정전용량(커패시턴스) 그래프.
도 3은 농도의 변화에 따른 임피던스 양과 정전용량(커패시턴스)의 변화에 대해 측정한 결과 그래프. (a)는 임피던스 양 |Z|의 Bode 곡선, (b)는 1X PBS 용액에서 TNF-alpha 센서가 TNF-alpha를 검출하기 위해 획득하는 데이터인 반응성 정전용량 곡선, (c)와 (d)는 범위가 10에서 104 pg/ml의 여러 TNF-alpha 농도에서 획득되는 임피던스 양 |Z|와 반응성 정전용량 값들의 곡선, (e)와 (f)는 범위가 10에서 104 pg/ml의 여러 HS-TNF-alpha 농도에서 획득되는 임피던스 양 |Z|와 반응성 정전용량 값들의 곡선
도 4는 범위가 10에서 104 pg/ml의 여러 TNF-alpha 농도의 변화에 따른, 센서의 정전용량(커패시턴스) 모듈러스 변화에 대한 결과 그래프. (a)는 여러 TNF-alpha 농도에 대한 곡선, (b)는 여러 HS-TNF-alpha 농도에 대한 곡선, (c)는 TNF-alpha 농도가 1-3 pg/ml일 때, Bare IDE와 AuNP IDE의 정전용량 측정 민감도를 비교한 것. (d)는 인간의 혈장액이 있을 때와 없을 때의 TNF-alpha 농도와
Figure pat00001
값을 비교하고 Kd값을 구한 것. 그래프 안의 그래프는 농도가 0-500 pg/ml일 때의 농도범위만 확대한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면에 나노입자가 증착되어 있고, 결합된 항체를 포함하는, 빗살형(Interdigitate) 전극을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 결합된 항체는 TNF-alpha 항체인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 결합은 공유 결합인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 빗살형(Interdigitate) 전극은 복수 개의 빗살형 핑거가 서로 이격되어 배열된 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서를 제공한다.
또한 본 발명은, (a) 빗살형 전극 표면에 전기적 증착(Electrodeposition)으로 나노입자를 증착시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계를 거친 빗살형 전극에 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 상기 (a) 단계의 나노입자는 금(Au) 나노입자이며, 상기 (b) 단계의 항체는 TNF-alpha의 항체인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계; (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는, 시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법을 제공한다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. AuNP/IDE 어레이 제조
3-mercaptopropionic acid (MPA), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로 클로라이드(EDC), N-히드록시숙신이미드(NHS), 소 혈청 알부민(BSA) 및 폴리(디메틸실록산)(PDMS)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 재조합 TNF-alpha는 Enzo Life Sciences, Inc.에서 구입하였다. TNF-alpha 단클론항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 연세 세브란스 병원 (서울,한국)의 동의하에 인간 혈청을 채취 하였다. 인산염 완충 식염수 (1X PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 및 1.4mM KH2PO4, pH 7.4) 및 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산 (MES; 0.1M, pH 6.0)은, Tech and Innovation사에서 얻었다. 탈이온수(증류수) (18.2 MΩㅇcm)는 Milli-Q 시스템으로부터 얻고 실험 전반에 걸쳐 사용하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석(analytical) 등급으로 사용하였다.
Au/NP IDE 어레이를 슬라이드 유리 (75 X 25 X 1mm3) 기판 위에 제조하였다. 유리 기판을 70 % 메탄올에서 초음파 처리하여 세정하였으며, 리프트-오프 포토 레지스트 (DNR L300-30)를 기판 상에 스핀-코팅하고, 전극, 전송 라인 및 단자 패드의 역 패턴을 가지도록 패터닝하였다. 패턴화된 기판 상에 Ti (25nm) 및 Au (50nm)를 스퍼터링에 의해 순차적으로 증착하고, 희생(sacrifice) 층을 제거하여 IDE를 형성하였다. 이어서, 절연 기판 (SU-8 2002)을 IDE 기판 위에 패터닝하여 IDE 감지 영역과 단자 패드를 노출시켰다. IDE의 빗살형 전극의 폭과 간격은 모두 50μm이다. IDE 상에 AuNP를 형성하고, 사용된 반응 용매를 보존하기 위해, 제조된 IDE 상에 PDMS 챔버를 두었다(도 1의 (a)와 (b) 참조). 증류수에서 Au (HAuCl4·3H2O; 0.5 mM) 용액을 IDE에 가하였다. Ag/AgCl 대비 -0.9V의 증착 전압을 실온에서 20 초 동안 IDE에 적용하였다. 증착 후, 생성된 AuNP/IDE 어레이를 증류수로 세척하고 질소기체(N2) 환경하에서 건조시켰다. 최종적으로 유리 슬라이드 상에, AuNP/IDE 어레이를 형성하였다.
IDE에서 AuNP 증착을 확인하기 위해 20 kV의 작동 전압(COXEM)에서 주사 전자 현미경 (SEM) 측정을 수행하였다(도 1의 (c)와 (d) 참조). 제조된 센서의 전기적 특성은 전기 임피던스 분광기 (EIS) 분석기(IVIUM CompactStat)를 사용하여 실온에서 검사되었다. 측정은 PBS 용액에서 0.1V의 입력 전위에서 수행되었고, 1-105 Hz의 주파수 범위를 스캐닝하며 수행되었다. 전기 임피던스 측정에 앞서, 순수한 질소가스 스트림으로 버블링하여 PBS 전해질 용액에서 산소를 제거하였다. 측정된 임피던스 스펙트럼은 설계된 등가 회로 모델에 비선형 커브 피팅 (nonlinear curve fitting)으로 특징이 파악되었다. AuNP/IDE의 전기적 특성을 더 잘 파악하기 위해 소자의 전계 및 전류 분포를 유한요소해석법(COMSOL Multiphysics)으로 시뮬레이션하였다. 모델링된 전극 구조의 치수(dimension)는 제조된 IDE의 치수와 유사하지만, IDE상의 AuNP는 반경 50nm의 균일 한 반구로서 단순화되었다.
실험예 2. AuNP/IDE 기반 TNF-alpha 면역센서 제조
TNF-alpha 항원과의 효과적인 결합 확인은 표준 절차에 따라 수행되었다. 제조된 AuNP/IDE는 3-MPA의 ethanolic 10 mM 용액에 6 시간 동안 실온에서 담겨 처리되었다. 그런 다음 400 mM EDC 용액과 100 mM NHS 용액을 부드럽게 혼합하면서 IDE 위에 연속적으로 떨어뜨려 고정 IDE 표면에서 1 시간 동안 반응시켜 3-MPA와 반응시켰다. 그런 다음 활성화된 IDE 표면에 10 μl의 항체 용액 (100 μg/ml)을 떨어 뜨렸다. PBS (10 mM, pH 7.4) 에 녹인 소 혈청 알부민 (BSA, 1 ng/ml)을 사용하여 전극 표면에 대한 비특이적 흡착을 차단하였다. TNF-alpha의 다양한 양을 PBS 또는 사람 혈청용액에 혼합하여, 1, 10, 100, 500, 1,000 및 10,000 pg/ml인 최종 농도를 얻었다. 이어서, 각 시료의 10 μl 분취량을 준비된 센서에 적용하고 4 ℃에서 60 분 동안 배양하였다.
실험결과
(1) AuNP/IDE의 전기화학적 특성 - 임피던스와 정전용량(커패시턴스)
아무 것도 증착되지 않은 Bare, IDE (WE) 전극의 한 팔에 증착된 AuNP와, 1X PBS의 IDE (WE + CE)전극의 양 팔에 증착된 AuNP, 세 경우에 측정된 임피던스 크기(|Z|) 및 해당 정전용량(커패시턴스) 그래프를 (도 2)에 도시하였다. 제조된 전극의 임피던스 특성은 용액 저항(RS)에 대한 직렬 저항과 전극 계면 임피던스(CPE)에 대한 일정 위상 요소를 포함하는 등가 회로로 모델링 될 수 있는데, 이는 1/T(jω)CPE-P(여기서, CPE-T 및 CPE-P는 조정 가능한 값이고, j는 허수 단위이고, ω는 각 주파수이다.)를 이용한다. 데이터 피팅 분석을 한 아래 (표 1)의 결과로부터, AuNP의 증착은 전극 표면의 거칠기 및 면적의 증가를 반영하는 1/CPE-T 및 CPE-P의 감소를 유도하고, bare IDE인 경우의 CPE-P 값은 1에 가까워 전극 계면 임피던스(electrical interfacial impedance) 가 대부분 용량성(capacitive) 리액턴스에 기인한다는 것을 나타낸다. AuNP 증착으로 인한 전극 계면 임피던스의 감소 정도는 AuNP가 증착된 정도에 따라 달라진다.
(표 1)
Figure pat00002
Bare IDE와 AuNP/IDE 모두에서 전기장과 전류 밀도 분포가 시뮬레이션되었다(도 2 참조). Bare IDE의 경우, 전극의 가장자리(edge)에서 가장 높은 전기장 수치가 관찰되며, 전극의 다른 영역에서는 상대적으로 낮은 전기장 기울기가 관찰된다 (도 2의 c 참조). 이 결과는, 전극의 나머지 영역과 비교하여, 전극의 중심부보다 가장자리에서 측정 감도가 최대임을 나타낸다. 그러나 AuNP/IDE의 경우, 전극의 가장자리 및 AuNP가 증착된 영역 주위 두 곳에서, 강한 전기장이 관찰된다(도 2의 d 참조). 집중된 전기장 강도와, 전극상의 AuNP에 잘 분산된 전류 밀도로 인해서, 센서의 감도가 높은 영역이 확장된다.
TNF-alpha의 직접 검출을 위해, SAM의 형성과 AuNP/IDE 표면의 기능화(functionalization)가 EIS로 평가된다. 링커와 단백질은 전하와 구조에 따라 복잡한 전기적 특성을 나타내지만, 전극 위에 순차적 형성으로 인해, 임피던스 크기(|Z|)가 증가하고 반대로 반응성 정전용량(커패시턴스)는 감소한다(도 3 참조). 표면의 기능화 및 단백질 고정화 후, 총 정전 용량의 감소가 관찰되었다. 이는 일련의 유전체 층을 형성하는 전극 상에 각각의 고정화된 층의 결합으로부터 유도된 것으로 추정된다. AuNP/IDE 표면상의 SAM의 형성은, 전극 인터페이스의 임피던스와 함께 직렬 정전용량(커패시턴스)(CSAM)을 생성하는 것으로 생각된다. 같은 방식으로, TNF-alpha 항체의 고정화(CaTNF-alpha) 및 TNF-alpha의 결합은, 추가적인 직렬 연결 커패시터 (CaTNF-alpha 또는 CTNF-alpha)를 형성한다. 따라서 SAM, aTNF-alpha 및 TNF-alpha를 고정화 한 후의 센서의 총 정전용량(커패시턴스)은 다음 식과 같이 나타낼 수 있다.
Figure pat00003
전반적으로 정전용량(커패시턴스)의 감소(|Z|증가)는 SAM 분자들의 결합 친화력(binding affinity) 및 항원-항체 반응과 관련이 있다. 임피던스 분석을 통하면, SAM 분자 및 단백질이 순차적으로 코팅된 센서의 표면 상태를 확인할 수 있다.
(2) AuNP/IDE의 전기화학적 특성 - TNF-alpha 농도 측정
본 발명에서 제조된 센서의 감지 특성을 파악하기 위한 임피던스 측정은, PBS 용액에서의 TNF-alpha 농도(ConcTNF-alpha) 및 인간 혈청에서의 TNF-alpha 농도(ConcHS-TNF-alpha)와 비교하여 수행되었다. 이 때 10mM PBS 용액에 녹인 10 pg/ml에서 104 pg/ml ( 588.24 fM 내지 588.24 pM에 상당)의 TNF-alpha 농도 용액을 이용한다. (도 3의 c) 및 (도 3의 e)에서 알 수 있는 바와 같이, 임피던스 모듈러스 값(|Z|)은 항원 농도에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 게다가 항원 농도에ㅔ 대한 반응성 정전용량(커패시턴스)의 의존성은 (도 3 d) 및 (도 3 f)에서 확인되듯이 줄어든다.
정전용량(커패시턴스) 모듈러스 값은 다음 식에 의해 기술된 바와 같이 측정된 데이터로부터 추출되었다.
Figure pat00004
여기서, C는 TNF-alpha가 특정 농도에서 항체와 결합한 후의 실제 정전용량(커패시턴스)이고, C0는 결합 전 정전용량(커패시턴스) 값이다. 면역 센서 표면의 TNF-alpha 농도를 증가 시키면 |ΔC|가 증가한다(도 4의 a 참조).
인간 혈청에서 TNF-alpha에 대해 개발된 감지 플랫폼의 실행 가능성을 조사하였다. 보다 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 200 배 희석한 인간 혈청을 분석 곡선으로 사용하여 작업 곡선을 만들었다. 인간 혈청 내 TNF-alpha의 농도가 증가함에 따라 센서의 |ΔC| 또한 (도 4의 b)와 같은 양상으로 증가한다. 이러한 결과는 복잡한 생물학적 구조에 대해서도 TNF-alpha에 대한 측정 방법을 문제없이 적용할 수 있음을 나타낸다.
또한 낮은 TNF-alpha 농도값(1-3 pg/ml)으로 Bare IDE와 AuNP/IDE의 민감도(Sensitivity)를 조사한 결과, AuNP/IDE의 경우 Bare IDE와 비교하여 |ΔC| 스펙트럼이 높은 민감도를 갖는다는 것이 확인되었다(도 4의 c 참조). 이러한 실험 결과를 보면, AuNP/IDE이 bare IDE보다 민감하다는 시뮬레이션 결과와 잘 일치한다. analyte 농도, TNF-alpha 농도 또는 HS-TNF-alpha 농도에 대한 센서 반응의 의존성은, (도 4의 d)와 같다. 10 Hz에서 측정된 정전용량(커패시턴스) 변화를 보면, PBS 또는 인간 혈청 샘플 내의 TNF-alpha 농도에 따라 증가하였다. 혈청 내의 analyte 물질의 경우, 0.83 pg/ml의 검출 한계(LOD)가 3(Sb/m)로부터 계산되어 얻어졌다. 여기서 Sb는 blank인 상태와 분석 곡선의 기울기인 m에 대해 측정한 신호의 표준 편차이다. 그러나 blank인 것의 신호와 피팅 커브로부터 얻은 표준 편차로부터만 LOD를 판단하는 것은 충분하지 않다. LOD에 대한 보다 정확한 평가는 1 pg/ml 이하의 농도에서 측정된 실험 데이터로부터 얻을 수 있다.
TNF-alpha와의 결합 친화성을 평가하기 위해, Langmuir 흡착 모델에 기반한 접근법을 사용하여 TNF-alpha의 해리 상수 Kd를 계산하였다. 항체(Ab)와 항원(Ag) 결합의 평형은 아래식과 같이 나타낼 수 있다.
Figure pat00005
만약 Ab-Ag 결합체의 표면 커버리지가 θ이고 비결합 항체의 표면 커버리지가 1-θ라면, 해리 상수 Kd는 아래식과 같다.
Figure pat00006
Langmuir 흡착 모델로부터 우리는 |ΔC| 값이 다음 식과 같이 항체-항원 결합에 직접적으로 관련된다.
Figure pat00007
여기서 |ΔC|sat는 센서의 최대 응답값이며, |(Csat-C0)/C0|값이다. 위의 식들에서, Langmuir 등온선 방정식의 선형화된 형태인, 다음과 같은 식이 유도될 수 있다.
Figure pat00008
위의 식을 사용하여, 낮은 항원 농도로부터의 반응을 피하면서 Kd값을 얻을 수 있다. PBS와 사람의 혈청에서 관찰된 TNF-alpha의 Kd 값은 각각 73.98과 103.53 pg/ml이었다.
좋은 재현성은 임상 진단에서 면역센서를 응용하기 위해 중요한 요소이다. 현재 연구에서, 면역센서의 재현성은 내부분석(intra-assay) 및 내부분석 상대표준 편차(RSD)에 의해 시험된다. 100 pg/ml 농도의 TNF-alpha를 검출하는지 여부를 통해, 면역센서의 내부분석 정밀도 측정이, 5회의 반복으로 조사되었다. 내부분석(inter-assay) 정밀도는, 5 가지의 서로 다르게 준비된 BSA/aTNF-alpha/MPA/AuNP/IDE로 TNF-alpha 100pg/ml 농도 시료를 측정함으로써 평가되었다. 내부분석(intra-assay)와 내부분석(inter-assay) RSD 값은 각각 2.62와 4.58%였다. 이 결과는 본 발명의 면역 센서가 수용 가능한 정확도와 재현성을 가짐을 나타낸다. 면역 센서를 재생성하기 위해서는, 전극을 0.2M 글리신-HCl 용액 (pH 2.3)에 10 분 동안 담가서 항체-항원간 결합을 깨뜨려서 달성할 수 있었다. 그럼에도 불구하고 생화학 시약은 재사용을 위해 센서 표면이 쉽게 세척될 수 있으며 각각의 변형된 센서는 실험에서 일회용으로 사용된다.
본 발명의 면역센서는, BSA/aTNF-alpha/MPA/AuNP/IDE 구조의 센서를 PBS (10 mM, pH 7.4) 내에서 4 ℃로 1주일간 유지시켜도 명백한 변성없이, 보관 한 후에도 EIS 반응능력을 유지하였다. 이는 센서의 구조가 항체의 생체적 활성을 유지하기에 충분할 정도로 생체 적합성을 가지고 있다는 것을 나타낸다. 또한, MPA로 변형된 AuNP와 항체의 1차(primary) 아민기 사이의 공유 결합 작용으로 TNF-alpha 항체가 탈착되는 것을 방지한다. 제안된 정전용량(커패시턴스) 값 기반으로 한 TNF-alpha 검출방법의 이점은, 다른 기존 방법에 비하면, 따로 라벨 물질이 필요 없으며, 실제적용 가능성이 높고, 필요한 최소한의 샘플을 준비하고 전기 신호를 직접 판독하는 것이 비용이 적게 든다는 것이다.
TNF-alpha 농도에 대한 민감한 정전용량(커패시턴스) 측정 기반의 면역센서는 AuNP/IDE에 하나의 TNF-alpha를 간단하게 고정시킴으로써 성공적으로 제조된다. IDE에서 AuNP의 형성은 SEM과 EIS에 의해 확인되었고, AuNP/IDE는 수용체 분자의 결합을 향상시키고 생체 활성을 유지하기 위한 견고한 플랫폼을 제공한다. 제조된 AuNP/IDE 기반의 정전용량(커패시턴스) 측정 센서는, 사람의 혈청에 직접 적용할 수 있으며, 노출 된 IDE에 비해 감도기 높고 생체 오염에 대한 저항성도 높다. 면역 센서는 0.83 pg/ml의 검출 한계가 계산되었고, 1 에서 104 pg/ml의 농도 범위에서 측정용 교정 곡선을 얻었다. 이러한 결과는 또한 AuNP/IDE가 TNF-alpha 농도를 측정하기 위한 생체 적합성 플랫폼을 구축하는데 적합할 수 있으며, 이는 일회용 바이오면역 센서를 쉽게 구현할 수 있음을 시사한다. 본 발명에서 개발된 정전용량(커패시턴스)형 바이오 센서는 값비싼 형광 염료, 시약 및 정교한 기기를 필요로하지 않기 때문에 경제적인 도구이다. 질병 진단을 위해 대상이 되는 피험자로부터 TNF-alpha 농도 수준을 검출하는 데 있어서, 용이하게 적용할 수 있는 다목적 도구가 될 것이다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 표면에 나노입자가 증착되어 있고, 결합된 항체를 포함하는, 빗살형(Interdigitate) 전극.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 하는 빗살형(Interdigitate) 전극.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 결합된 항체는 TNF-alpha 항체인 것을 특징으로 하는 빗살형(Interdigitate) 전극.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 결합은 공유 결합인 것을 특징으로 하는 빗살형(Interdigitate) 전극.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 빗살형(Interdigitate) 전극은 복수 개의 빗살형 핑거가 서로 이격되어 배열된 것을 특징으로 하는 빗살형(Interdigitate) 전극.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서.
  7. (a) 빗살형 전극 표면에 전기적 증착(Electrodeposition)으로 나노입자를 증착시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계를 거친 빗살형 전극에 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 나노입자는 금(Au) 나노입자이며,
    상기 (b) 단계의 항체는 TNF-alpha의 항체인 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법.
  9. (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계;
    (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는,
    시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법.
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