KR102510453B1 - 인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출을 위한 빗살물결형 전기임피던스 측정 센서 - Google Patents
인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출을 위한 빗살물결형 전기임피던스 측정 센서 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인산화-타우 트레오닌 231 단백질을 검출하기 위한 측정 센서에 관한 것으로, 기판 상에 형성되고, 소정의 폭 및 간격을 두고 이격된 복수의 핑거를 구비하는 전극층, 전극층의 표면에 자기 조립 단층(self-assembled monolayer) 방식으로 고정되는 MHA(6-Mercaptohaxanoic acid), MHA 화합물의 카르복실기와 결합을 통해 활성화하는 NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 적어도 하나 이상의 NHS의 활성화기와 결합한 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody)를 포함하고, 복수의 핑거는 물결형상으로 형성되며, 직선에 의한 전극 모서리를 갖지 않도록 형성된 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출용 센서에 관한 것으로, 특히 인간 혈청 내에 존재하는 소량의 트레오닌 231 단백질을 검출할 수 있는 빗살물결형 전극 기반의 센서에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 기억력 감소와 그 외의 인식 부족 등의 특징이 나타나는 신경쇠퇴성병으로, 치매의 가장 중요한 원인이다. 노인성 치매는 고령화 시대에 진입하여 전세계적으로 주목하는 질병이며, 특히 한국은 초고령화 사회로 빠르게 진입하고 있어서 관련 사회 비용이 기하급수적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.
기억력, 사고력이 급격히 저하하는 퇴행성 뇌질환인 노인성 치매는 대표적인 노인성 질환으로, 뇌기능이 점진적으로 쇠퇴하여 기억, 사고 및 일상적 생활 능력 및 행동에 문제가 생기는 질병이다.
알츠하이머병의 주요 병리적 특징 중 하나는 인산화-타우 단백질이 뇌에서 신경원섬유엉킴 형태로 응집되는 것으로, 이는 뇌세포의 손상 및 사멸을 일으켜 뇌의 여러 기능에 문제를 가져온다.
또한, 알츠하이머 환자의 뇌척수액 및 면역학 분석 결과 알츠하이머 진단 시 여러 종류의 p-tau 단백질(231, 181, 217) 농도가 85%의 민감도와 97%의 특이도를 가진다고 보고된 바 있다.
현재 임상에서 뇌척수액 내 p-tau 단백질을 검출하기 위하여 뇌척수액 추출기법을 사용하고 있으나, 이는 매우 침습적인 방법으로 환자에게 고통과 후유증이 따르며, PET 측정법은 방사선 조영제 주입, 환자 거동 제한, 낮은 영상분해능, 복잡한 고가의 측정기기로 인해 재택진단 및 일상적 건강관리 활용이 용이하지 않은 문제점이 있다. 따라서 보다 간편하고 빈번하게 p-tau 단백질을 검출함으로써 알츠하이머 치매 조기진단과 건강관리를 할 수 있는 진단기술의 필요성이 대두되었다.
본 발명의 목적은, 인간 혈청 내에 존재하는 소량의 트레오닌 231 단백질을검출할 수 있는 빗살물결형 전극 기반의 센서를 제공하고자 한다.
본 발명은 전술한 목적을 달성하기 위한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 기판 상에 형성되고, 소정의 폭 및 간격을 두고 이격된 복수의 핑거를 구비하는 전극층, 전극층의 표면에 자기 조립 단층(self-assembled monolayer) 방식으로 고정되는 MHA(6-Mercaptohaxanoic acid), MHA 화합물의 카르복실기와 결합을 통해 활성화하는 NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 적어도 하나 이상의 NHS의 활성화기와 결합한 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody)를 포함하고, 복수의 핑거는 물결형상으로 형성되며, 직선에 의한 전극 모서리를 갖지 않도록 형성된 것을 특징으로 하는 전기임피던스 측정 센서를 제공한다.
본 발명에 따른 전기임피던스 측정 센서는, 소량의 p-tau231 단백질을 검출할 수 있으며, 우수한 선택성 및 안정성을 가지는 바, p-tau231 단백질 검출을 통해 알츠하이머를 조기진단할 수 있는 바이오센서를 제공할 수 있다.
도 1(a)는 본 발명의 예시적 구체예에 따라 전기임피던스 측정 센서를 제조하는 방법을 도시화하였으며, 1(b)는 센서의 구체적 형상을, 1(c)는 제조된 센서의 개략도 및 EIS 데이터를 도시화한 도면이다.
도 2(a)는 본 발명의 제조 단계별 Nyquist plot을 도시화하였으며, 2(b)는 Randle's equivalent circuit을, 2(c)는 제조 단계 별 Rct값을 계산한 값이며, 2(d)는 제조 단계별 CV값을 도시화한 도면이다.
도 3(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 PBS 용액 내에서 p-tau231의 농도별 Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 3(b)는 p-tau231의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다.
도 4(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 인간 혈청 내에서 p-tau231의 농도별 Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 4(b)는 이를 p-tau231의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다.
도 5(a)(b)는 p-tau단백질의 농도를 x축, p-tau단백질의 농도/△R(정규화된 Rct)를 y축으로 하여 도시화한 도면이며, 도5(c)는 본 발명에 따른 센서의 p-tau단백질 선택성을 도시화한 도면이며, 도5(d)는 시간에 따른 Rct 값을 도시화한 도면이다.
도 2(a)는 본 발명의 제조 단계별 Nyquist plot을 도시화하였으며, 2(b)는 Randle's equivalent circuit을, 2(c)는 제조 단계 별 Rct값을 계산한 값이며, 2(d)는 제조 단계별 CV값을 도시화한 도면이다.
도 3(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 PBS 용액 내에서 p-tau231의 농도별 Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 3(b)는 p-tau231의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다.
도 4(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 인간 혈청 내에서 p-tau231의 농도별 Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 4(b)는 이를 p-tau231의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다.
도 5(a)(b)는 p-tau단백질의 농도를 x축, p-tau단백질의 농도/△R(정규화된 Rct)를 y축으로 하여 도시화한 도면이며, 도5(c)는 본 발명에 따른 센서의 p-tau단백질 선택성을 도시화한 도면이며, 도5(d)는 시간에 따른 Rct 값을 도시화한 도면이다.
본 명세서 또는 출원에 개시되어 있는 본 발명의 개념에 따른 실시 예들에 대해서 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시 예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 별명의 개념에 따른 실시 예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서 또는 출원에 설명된 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 개념에 따른 실시 예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시 예를 설명함에 있어서 본 발명이 속하는 기술 분야에 익히 알려져 있고 본 발명과 직접적으로 관련이 없는 기술 내용에 대해서는 설명을 생략한다. 이는 불필요한 설명을 생략함으로써 본 발명의 요지를 흐리지 않고 더욱 명확히 전달하기 위함이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"기판(substrate)"은 그 위에 부착(고정) 또는 코팅(도포) 가능한 표면을 제공하는 구조 또는 구조물을 의미할 수 있으며, 전형적으로 2차원의 표면을 제공할 수 있다.
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 적어도 하나의 다른 층(중간층 또는 개재층)이 존재하거나, 또는 추가 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
"접촉한다"는 용어의 경우, 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
어떠한 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 있어서 임의의 구성 요소 또는 부재가 다른 구성 요소 또는 부재와 "연결된다" 또는 "연통된다"고 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 다른 구성 요소 또는 부재와 직접 연결 또는 연통되어 있는 경우뿐만 아니라, 다른 구성 요소 또는 부재의 개재 하에서 연결 또는 연통되어 있는 경우도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
이하에서는 이 발명의 실시 예에 대하여 첨부된 도면을 참조하면서 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
도 1(a)는 발명의 예시적 구체예에 따라 전기임피던스 측정 센서를 제조하는 방법을 도시화하였으며, 1(b)는 센서의 구체적 형상을, 1(c)는 제조된 센서의 개략도 및 EIS 데이터를 도시화한 도면이다.
빗살물결형 전극(Interdigitated Wave-shaped Electrode) 제조
빗살물결형 전극의 전극층은 리프트오프(lift-off) 공정에 의해 제조된다. 즉, 기판상에 빗살물결 형상 전극을 제조할 수 있도록 마스크를 씌운 후, 금속을 도포시키고, 포토레지스트(photoresist)방식에 의해 마스크를 제거하는 방식으로 빗살물결형 전극을 제조하였다. 이 때, 빗살물결 형상의 핑거(finger)는 소정의 폭 및 간격을 두고 이격되게 형성될 수 있으며, 센서의 민감도가 향상될 수 있도록 핑거간의 간격 및 형상이 조절될 수 있다. 빗살물결 형상이란 복수개의 핑거가 물결형상으로 형성되며, 일정한 간격으로 이격되어 형성된 것을 말한다. 이러한 빗살물결형 전극층은 다양한 기판상에 형성될 수 있다. 일 예로서, 기판의 재질은 실리콘(예를 들면, 단결정 실리콘 등), 석영(예를 들면, 단결정 석영, 용융(fused) 또는 비정질 석영 등), 글래스, 세라믹, 투명 플라스틱 및 전도성기판(예를 들면 FTO, ITO 등)으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 슬라이드 글라스일 수 있다.
이 때 주목할 점은 빗살물결 형상의 핑거는 각각이 물결 형상으로 구성되어 직선에 의한 전극모서리를 갖고 있지 않다는 것이다. 본 개시 내용이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 직선에 의한 전극 모서리를 곡선으로 대체함으로써 인가된 전기장이 전극 모서리에 집중되지 않고 맞물리도록 형성된 체인 형상에 집중되도록 하여 향후 단백질이 존재할 때 변화하는 임피던스 값을 정확하게 측정할 수 있는 것으로 판단된다.
본 발명에 따른 일 실시예에서는, 맞물린 체인의 전극층은 금(Au), 티타늄(Ti), 바나듐(V), 크롬(Cr), 스칸듐(Sc), 니오븀(Nb), 및 몰리브덴(Mo)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 재질로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 맞물린 체인 전극층은 기판상에 증착된 티타늄(Ti)층 및 티타늄(Ti)층 상단에 증착된 금(Au)층으로 구성될 수 있다. 보다 구체적으로, 기판상에 마스크를 씌운 후, 티타늄 금속을 10 내지 50 nm, 티타늄 금속 상단에 금을 30 내지 70 nm 적층하여 전극층을 형성할 수 있다. 보다 구체적으로 Ti 금속을 25 nm, Ti 금속 상단에 금(Au)을 50 nm 적층할 수 있다. 핑거의 폭 및 간격은 센서의 민감도 및 선택성에 영향을 미치는 점을 고려하면, 전술한 범위 내에서 정하는 것이 유리할 수 있다. 이와 관련하여, 핑거 간 이격 거리가 가까울수록 임피던스 변화가 증가하는 만큼, 상술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 유리할 수 있다. 다만, 상술한 패턴의 물리적 성상 또는 치수 범위는 예시적 취지로 이해될 수 있으며, 본 개시 내용이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 금(Au)은 양호한 내산화성 및 내부식성, 생물학적 실험에서 사용 시 비활성 표면(즉, 단백질에 미치는 영향이 적음)을 제공할 수 있고, 전기전도성 및 열 전도성이 양호하며, 광 반사도(optical reflectivity)가 높고, 평활한 표면을 얻을 수 있는 등의 표면 특성을 갖고 있다. 이러한 특성을 이용하여, 예를 들면 생명과학 분야에서 유용한 기재로 사용되거나, 화학 및 생화학 센서에서 시그널 변환기(transducer)로 적용되고 있다.
티타늄 및 금으로 형성된 금속층을 적층하기 위해 각각은 당업계에서 알려진 도전층 형성 공정(예를 들면, 물리적 증착법(PVD; 예를 들면 스퍼터링, 열 증착(thermal vapor deposition), E-beam 증착 등), 화학적 증착법(CVD; 예를 들면, 플라즈마 화학기상증착(PECVD), 열적 화학기상 증착(thermal CVD) 등) 및/또는 패턴화 공정(예를 들면, 포토리소그래피 공정 등)을 통하여 원하는 패턴, 형상 및/또는 치수를 갖도록 형성될 수 있다. 전형적으로, 티타늄 및 금층은 포토리소그래피 공정을 이용하여 수행될 수 있는 바, 이의 기본 원리는 당업계에 널리 알려져 있는 만큼, 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
커패시턴스 센서 제조단계
전극이 형성된 기판을 세척한 후, 인산화-타우 트레오닌 231 단백질(이하, p-tau-231 단백질)을 검출할 수 있는 전기임피던스 측정 센서를 제조한다. 전기임피던스 측정 센서의 제조방법은 전극층에 카르복실기를 포함하는 제 1화합물을 결합시키고, 제 1화합물의 카르복실기와 결합능을 가지며, 제 1화합물과 결합 후 항 인산화-타우 트레오닌 231 항체와 결합가능한 활성화기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2화합물을 첨가하는 방식으로 이루어진다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제 1화합물은 MHA(6-Mercaptohaxanoic acid)이고, 제 2화합물은 NHS(N-hydroxysuccinimide)일 수 있다. 전극층이 형성된 기판을 MHA (50mM)용액에 12시간 이상 잠기도록 하여 자기 조립 단층 방식(Self-assembled monolayer)에 의하여 전극층 표면에 MHA를 결합시킬 수 있다. 그 후, 75 mM의 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'ethylcarbodiimide hydrochloride)용액과 5 mM의 NHS(N-hydroxysuccinimide)용액에 순차적으로 기판을 담구도록 함으로써 NHS를 전극층 표면에 결합된 MHA와 결합하도록 하여 전극층을 활성화시킬 수 있다. 그 후, 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체를 활성화된 전극에 떨어뜨려 항 인산화-타우 트레오닌 231 항체를 전극에 고정화시킬 수 있다. 즉, 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체의 아미노그룹은 NHS가 결합된 전극과 반응하여 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체가 전극에 고정화 된다. 마지막으로 비특이적 결합을 방지하기 위하여 BSA(Bovine Serum Albumin)용액을 넣어준다. BSA는 활성화된 전극 중 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체가 고정화되지 않은 전극과 결합하여 비특이적인 반응이 진행되는 것을 방지할 수 있다. 해당 실시예의 조건들은 예시적 조건에 불과한 바, 전술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 가능하다. 본 발명은 이러한 제조방법에 의해 제조된 센서를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 전기임피던스 측정 센서는 도 1과 같다. 즉, 기판 상에 소정의 폭 및 간격을 두고 이격된 복수의 핑거를 구비하는 전극층, 상기 전극층의 표면에 자기 조립 단층(self-assembled monolayer) 방식으로 고정되는 MHA(6-Mercaptohaxanoic acid), 상기 MHA 화합물의 카르복실기와 결합을 통해 활성화하는 NHS(N-hydroxysuccinimide), 및 적어도 하나 이상의 NHS의 활성화기와 결합한 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody)를 포함한다. 또한, 센서는 복수의 핑거는 물결형상으로 형성되며, 직선에 의한 전극 모서리를 갖지 않도록 형성된다.
필요에 따라, NHS의 활성화기 중 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody)가 결합하지 않은 나머지 활성화기와 결합하여 비특이적 결합을 제한하는 BSA(bovine Serum Albumin)를 포함할 수 있다. 이 때, 복수의 핑거는 물결형상으로 형성되며, 전극층에 구비된 핑거간의 간격은 3 내지 7 ㎛ 범위에서 정할 수 있다. 전극층은 기판 상부에 적층된 티타늄층 및 티타늄층 상부에 적층된 금(Au)층으로 형성된다. 즉, 본 발명은 빗살물결형 전극층의 금표면에 자기 조립 단층 방식(Self-assembled monolayer)에 의하여 MHA를 결합한 후, EDC(N-(2-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)의 커플링반응에 의하여 MHA의 카르복실기를 활성화시키며 반응을 진행시켜 제조된다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 센서의 특성을 알아보았다.
특성화
도 2(a)는 본 발명의 제조 단계마다 Nyquist plot을 도시화한 값이며, 2(b)는 Randle's equivalent circuit을, 2(c)는 제조 단계 별 계산된 Rct값을 도시화한 도면이며, 2(d)는 제조 단계별 CV(Cyclic Voltammetry)값을 측정하여 도시화한 도면이다. CV는 3전극 시스템을 이용하였으며, Ag/AgCl을 레퍼런스 전극으로 하고, Pt를 상대전극으로 하여 0.1 M KCl을 포함하는 1mM K[Fe(CN)6]3-/4- 용액에서 측정되었다.
도 3(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 PBS 용액 내에서 p-tau-231 단백질의 농도별(10-4~101 ng/mL 범위) Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 3(b)는 p-tau-231 단백질의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다. Rct 값은 p-tau-231 단백질의 농도가 증가할수록 증가하며, 이는 p-tau-231 단백질의 검출을 평가하기 위한 매개변수로서 Rct의 유용성을 나타낸다. 또한, Rct의 증가는 [Fe(CN)6]3-/4- 산화환원 프로브와 바이오센서 표면 사이의 전자 전달을 차단하는 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체와 p-tau-231 단백질의 특이적 결합으로 인한 것이다. 그림 3(b)는 PBS에서 10-4에서 101ng mL-1까지의 농도 범위에서 p-tau-231 단백질의 검출을 위한 보정 곡선을 보여줍니다. 이것은 Randle의 등가 회로 모델을 통해 Nyquist 플롯(그림 3a)에서 적합값 Rct의 정규화에 의해 생성되었다. 정규화는 R = (RT-R0)/R0로 추정되었으며, 여기서 R0는 바이오센서의 Rct이고 RT는 p-tau-231 단백질(10-4-101ng mL-1)과 배양 후 바이오센서의 Rct 값을 의미한다. 선형 회귀 방정식(y = 1.1 + 0.2x)은 10-4-101ng mL-1의 선형 검출 범위(LRD)와 0.06ng mL-1의 검출 하한(LOD)을 정의했습니다(60 pg mL-1)은 PBS에서 p-tau-231 단백질의 검출을 위한 보정 곡선에서 획득하였다. LOD는 (3S/b)로 계산되었으며, 여기서 S는 표준 편차이고 b는 보정 곡선의 기울기입니다.
도 4(a)는 본 발명에 따라 제조된 센서를 이용하여 인간 혈청 내에서 p-tau-231 단백질의 농도별(10-4~101 ng/mL 범위) Nyquist plot을 도시화한 도면이며, 4(b)는 이를 p-tau-231 단백질의 농도를 x축, △R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이다. 구체적인 과정은 도 3과 동일하다. 선형 회귀 방정식(y = 2.0 + 0.3x), 10-4에서 101ng mL-1까지의 LRD 및 0.14ng mL-1(140pg mL-1)의 LOD에서 p-tau-231 단백질 검출 HS는 교정 곡선에서 결정되었습니다. AD 환자에서 CSF p-tau-231 단백질의 평균 검출 수준(700 pg mL-1)과 경도인지 장애 환자에서 검출 가능한 CSF p-tau-231 단백질 농도(501 pg mL-1)와 비교하여, 바이오센서는 HS 및 PBS에서 각각 p-tau-231 단백질에 대해 140pg mL-1 및 60pg mL-1의 낮은 LOD를 나타내어 p-tau-231 단백질의 조기 검출을 위한 바이오센서의 능력을 입증했습니다. 현재까지 p-tau-231 단백질 검출을 위한 전기화학적 바이오센서에 대한 연구는 보고되지 않았다. 이것은 IWE를 사용하여 HS 및 PBS에서 p-tau-231 단백질의 민감한 검출을 위한 전기화학적 바이오센서에 대한 첫 번째 연구입니다.
검출 특성
도 5(a)(b)는 p-tau 231단백질의 농도를 x축, p-tau 231단백질의 농도/△R(정규화된 Rct)을 y축으로 하여 도시화한 도면이며, 도5(c)는 본 발명에 따른 센서의 p-tau-231 단백질 선택성을 도시화한 도면이며, 도5(d)는 시간에 따른 Rct 값을 도시화한 도면이다.
Langmuir 흡착 모델 기반 접근법은 이 연구에서 항-p-tau231 항체 EPR2488과 p-tau-231 단백질 간의 결합 해리 상수(Kd)를 결정하는 데 사용되었다. 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체와 p-tau-231 단백질 사이의 Kd는 작아서 높은 결합 친화도를 가진다. 본 연구에서는 p-tau-231 단백질에 대한 센서의 응답을 이용하여 선형화된 Langmuir 등온식을 다음과 같이 나타내었다.
Cp-tau231/△R= Cp-tau231/△Rmax + Kd/△Rmax
여기서 Cp-tau231은 PBS용액 및 인간 혈청(Human Serum)에서 p-tau-231단백질(ng mL-1)의 농도이다. R은 센서의 p-tau-231단백질에 대한 응답 정규화한 값이며, Rmax는 p-tau-231단백질에 대한 센서의 최대 응답의 정규화 값이다. 이 방정식을 사용하여 PBS 및 HS내에서 Cp-tau231 대 Cp-tau231/R의 두 가지 선형 회귀가 결정된다. Kd는 y절편을 선형회귀의 기울기로 나누어 구하였다. PBS와 HS에서 두 회귀의 y절편과 기울기는 각각 0.05와 0.88, 0.30과 0.86이다. 따라서 PBS 및 HS에서 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체와 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체 간의 결합 Kd는 각각 0.056 및 0.35ng mL-1이었다. 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체 EPR2488의 분자량은 46kDa이다. 결과적으로, Kd는 PBS 및 HS에서 각각 1.2 및 7.6 pM으로 변환될 수 있다. 이 연구에서 얻은 Kd는 이전 연구의 추정치보다 작으며 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체 EPR2488과 p-tau-231 단백질 간의 높은 결합 친화성과 p-tau-231 단백질 인식의 높은 특이성을 반영합니다. 이것은 PBS 및 HS에서 p-tau-231 단백질을 검출하는 본 발명에 따른 센서 IWE/SAM/EDC-NHS/anti-p-tau231의 능력을 보여줍니다.
그림 5(c)는 p-tau-231 단백질(10-3ng mL-1), 아밀로이드-β40(aβ40, 10ng mL-1), 아밀로이드-β42(αβ42,10ng mL-1), C-반응성 단백질(CRP, 10ng mL-1) 및 종양 괴사 인자-알파(TNFα, 500pg mL-1)를 포함한 다양한 분석물질에 대한 본 발명의 센서의 반응(RA-R0)/R0을 도시화하고 있다. 여기서 R0는 센서의 Rct값이며, RA는 다양한 분석물과 함께 배양된 후 센서의 Rct값이다. p-tau-231 단백질에 대한 센서의 반응은 다른 분석 물질에 비해 크게 변화하고 증가하여 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체와 p-tau-231 단백질 사이의 특이적 결합을 나타내며, 이는 p-tau-231 단백질 검출을 위한 센서의 선택성을 확인시켜준다. 센서의 EIS는 4℃의 냉장고에서 1, 2, 3, 5, 7, 14일 보관 후 측정되었으며, 센서의 Rct는 보관 후 변화가 크지 않아, 안정성을 가진 것으로 확인되었다(그림 5(d)).
이에 따라, 본 발명에 의해 제조된 센서는 p-231 단백질에 대하여 10-4 내지 101 ng/mL-1의 검출선형범위를 가지며, 검출한계는 140 pg/mL-1로 측정되었다.
본 발명에 따른 전기임피던츠 측정 센서는 p-tau-231 단백질에 대하여 우수한 선택성 및 안정성을 가지는 바, 향후 인간 혈청 내의 p-tau-231 단백질을 검출하고 알츠하이머병을 진단하는데 용이하게 사용될 수 있을 것으로 보인다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (4)
- 기판 상에 형성되고, 소정의 폭 및 간격을 두고 이격된 복수의 핑거를 구비하는 전극층;
상기 전극층의 표면에 자기 조립 단층(self-assembled monolayer) 방식으로 고정되는 MHA(6-Mercaptohaxanoic acid);
상기 MHA 화합물의 카르복실기와 결합을 통해 활성화하는 NHS(N-hydroxysuccinimide);및
적어도 하나 이상의 NHS의 활성화기와 결합한 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody);를 포함하고,
상기 복수의 핑거는 물결형상으로 형성되며, 직선에 의한 전극 모서리를 갖지 않도록 형성되며,
p-231단백질 농도가 10-4 내지 10 ng/mL 범위일 때, [수식1]을 만족하는 것을 특징으로 하는 전기임피던스 측정 센서.
[수식1]
Cp-tau231/△R= Cp-tau231/△Rmax + Kd/△Rmax
수식1에서 Cp-tau231는 용액 내에서 p-tau 231단백질의 농도, R은 센서의 p-tau-231단백질에 대한 응답을 정규화한 값, Rmax는 p-tau-231단백질에 대한 센서의 최대 응답의 정규화 값이며, Kd는 항체와 단백질 간 결합 해리 상수를 의미함.
- 제1 항에 있어서,
상기 NHS의 활성화기 중 항-인산화-타우 트레오닌 231 항체(anti-phosphorylated-Tau Threonine 231 antibody)와 결합하지 않은 나머지 활성화기와 결합하여 비특이적 결합을 제한하는 BSA(bovine Serum Albumin);를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기임피던스 측정 센서. - 제2 항에 있어서,
상기 전극층은,
상기 기판 상부에 물결 형상으로 형성되되, 소정의 폭 및 간격을 두고 이격되어 적층된 티타늄층;및
상기 티타늄층 상부에 적층된 금(Au)층을 포함하는 것을 특징으로 하는 전기임피던스 측정 센서. - 제1 항에 있어서,
상기 센서는,
140pg/mL의 p-231단백질 검출한계를 가지는 것을 특징으로 하는 전기임피던스 측정 센서.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220068378A KR102510453B1 (ko) | 2022-06-03 | 2022-06-03 | 인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출을 위한 빗살물결형 전기임피던스 측정 센서 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220068378A KR102510453B1 (ko) | 2022-06-03 | 2022-06-03 | 인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출을 위한 빗살물결형 전기임피던스 측정 센서 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102510453B1 true KR102510453B1 (ko) | 2023-03-14 |
Family
ID=85502904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220068378A KR102510453B1 (ko) | 2022-06-03 | 2022-06-03 | 인산화-타우 트레오닌 231 단백질 검출을 위한 빗살물결형 전기임피던스 측정 센서 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102510453B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180129206A (ko) * | 2017-05-25 | 2018-12-05 | 가천대학교 산학협력단 | 빗살형 전극에 나노입자을 증착시켜 TNF-alpha 측정 감도를 높인 나노바이오센서 |
| JP2019027952A (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-21 | 京都府公立大学法人 | リン酸化タウタンパク質の測定方法 |
| KR20210049459A (ko) * | 2019-10-25 | 2021-05-06 | 가천대학교 산학협력단 | 혈청내 IgM 류마티즘 인자를 민감하게 검출하기 위한 비표지 전기화학 임피던스 측정 면역센서 및 그 제조방법 |
| KR20210100989A (ko) * | 2020-02-07 | 2021-08-18 | 가천대학교 산학협력단 | 빗살 체인형 전극 형태의 아밀로이드 베타 펩타이드 검출 센서 |
-
2022
- 2022-06-03 KR KR1020220068378A patent/KR102510453B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180129206A (ko) * | 2017-05-25 | 2018-12-05 | 가천대학교 산학협력단 | 빗살형 전극에 나노입자을 증착시켜 TNF-alpha 측정 감도를 높인 나노바이오센서 |
| JP2019027952A (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-21 | 京都府公立大学法人 | リン酸化タウタンパク質の測定方法 |
| KR20210049459A (ko) * | 2019-10-25 | 2021-05-06 | 가천대학교 산학협력단 | 혈청내 IgM 류마티즘 인자를 민감하게 검출하기 위한 비표지 전기화학 임피던스 측정 면역센서 및 그 제조방법 |
| KR20210100989A (ko) * | 2020-02-07 | 2021-08-18 | 가천대학교 산학협력단 | 빗살 체인형 전극 형태의 아밀로이드 베타 펩타이드 검출 센서 |
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