KR101774891B1

KR101774891B1 - 환원된 그래핀 산화물-나노입자 혼합물 임피던스 측정 소자를 이용한, c-반응성 단백질에 대한 직접적이고 라벨이 필요 없는 나노바이오센서

Info

Publication number: KR101774891B1
Application number: KR1020160002318A
Authority: KR
Inventors: 조성보; 아제이 쿠마 아가티
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2016-01-07
Publication date: 2017-09-06
Also published as: KR20170082947A

Abstract

본 발명은 환원된 그래핀 산화물 나노입자 혼합물 임피던스 측정 소자를 이용한 C-반응성 단백질 측정용 나노바이오센서 및 이러한 센서를 사용하여, C-반응성 단백질을 직접적이면서 라벨이 필요없이 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 나노바이오센서인 환원된 그래핀 산화물과 금 나노입자 복합체를 대시간전류법으로 증착시킨 ITO 변형 혼합물 전극을 이용하고, 사람의 C-반응성 단백질에 대한 항체를 이에 고정시켜, C-반응성 단백질을 낮은 농도에서도 검출할 수 있었다. 이러한 검출 방법은 타겟인 C-반응성 단백질에 매우 특이적으로 검출할 수 있었으며, 용액 내 C-반응성 단백질의 로그 스케일 농도(1 ng mL^-1부터 1000 ng mL^-1까지)에 선형으로 비례하여 반응하였다. 검출 한계는 0.06 또는 0.08 ng mL^-1 에 이르러, C-반응성 단백질에 대한 고감도 나노바이오센서를 얻는 효과를 확인하였다.

Description

환원된 그래핀 산화물-나노입자 혼합물 임피던스 측정 소자를 이용한, C-반응성 단백질에 대한 직접적이고 라벨이 필요 없는 나노바이오센서{Label-free and direct detection of C-reactive protein using reduced graphene oxide-nanoparticle hybrid impedimetric sensor}

본 발명은 환원된 그래핀 산화물 나노입자 혼합물 임피던스 측정 소자를 이용한 C-반응성 단백질 측정용 나노바이오센서 및 이러한 센서를 사용하여, C-반응성 단백질을 직접적이면서 라벨이 필요 없이 검출하는 방법에 관한 것이다.

전기화학 바이오센서는 그 민감성, 선택성, 간단성 및 낮은 가격에 의해 치료 진단, 식품 분석 및 환경감시(environmental monitoring) 분야에서 주목받고 있으며 주요 분석 도구로 자리매김하고 있다. 이런 이유로, 센서의 틀에 대한 새로운 전략이 이용된 민감성과 선택성이 뛰어난 전기화학 바이오센서의 등장은 꾸준히 발전하고 있다.

전기화학 바이오센서에 대한 대다수의 연구는 민감한 전기화학 센서를 고안함에 있어 금속 나노입자의 혼합에 주목해 왔다. 촉매 활성, 광학, 전기 및 자기력과 같은, 벌크(bulk) 구조에서는 나타나지 않는 나노입자 고유의 특성들에서 기인하여, 최근 많은 노력이 나노입자들의 전착에 집중되어왔다. 탄소 유래 물질 또한 높은 전도도와 귀금속 대비 낮은 가격으로 상당한 주목을 받고 있다. 많은 탄소 유래 물질들 중에서도 그래핀은 2차원의 얇은 판을 이루는 탄소 원자들이 벌집 유사한 격자 모양을 구성하고 있는 것으로, 물리적 전기적으로 독특한 성질을 가지며 화학적으로 안정하고, 비표면적이 넓고 생체에 적합한 특성을 갖추었다는 점에서 전기화학적 바이오센서로서의 관심이 높아지고 있다. 그래핀이 포함하는 카복실기 및 하이드록실기는 친수성 성질의 원인이 되는 것으로, 물과 유기 용매 모두에서 높은 분산성을 나타낸다. 따라서, 그래핀 유래의 나노구조들은 근래에 전극의 표면을 개질해 전기화학적 반응을 향상시키는 것에 이용되고 있다.

C-반응성 단백질(C-reactive protein; CRP)은, 단백질의 펜트락신군(pentraxin family) 계열의 일원이고, 각 서브유닛(subunit)에 대하여, 자연 특이적 단백질인, 포스포콜린(phosphocholine; PC)에 대한 특이적 결합 자리를 가지고 있다. 셀이 손상될 때, CRP는 인식 및 식균성 세표(phagocytotic) 면역 반응을 시작하는 PC에 결합한다. 평형 투석 실험(Equilibrium dialysis experiment)은, Ca2+의 존재 하에서, CRP가 한개/서브유닛의 발렌스(valence)로 1.6 X 10⁵M^-1의 PC 와 결합 상수로 결합하는 것을 나타냈다. 면역 전자 현미경(Immunoelectron microscopy)은 모든 PC-결합 사이트가 CRP 오량체(pentamer)의 표면 상에 있고, 상기 분자의 면과 거의 수직이라는 것을 나타냈다. CRP는 혈액에서 발견되는 단백질로서, 그의 레벨은 염증(inflammation) (급성 병기 단백질(acute-phase protein))에 반응하여 증가하고, 주로 염증의 마커로서 사용된다. 건강한 인간 혈청에서 CRP의 표준 농도는 보통 10 mg/L 미만이다. 더 높은 레벨은 가벼운 염증 및 바이러스의 감염 (10-40 mg/L), 활동적 염증, 박테리아 감염 (40-200 mg/L), 심한 박테리아 감염 및 화상(burn) (>200 mg/L) 에서 발견된다. 최근 연구는 CRP의 상승된 기저 레벨을 가진 환자가 당뇨병, 고혈압 및 심장 혈관 질환의 증가된 위험에 있다고 제안한다. 이런 이유로, ELISA, 면역 탁도 측정법(immunoturbidimetry), 면역확산(immunodiffusion) 및 시각적 응집(visual agglutination)과 같은 다양한 분석 방법이 이미 이용 가능함에도 불구하고, CRP 검출 및 정량화를 위한 빠르고, 저비용이고, 정확한 방법이 요구된다.

Ｃ-반응성 단백질 검출용 바이오센서와 관련한 선행기술로는, 국내등록특허 제10-1196481호 'Ｃ-반응성 단백질 검출용 칩 및 이의 제조 방법'와 국내등록특허 제10-1570149호 '코티졸 및 씨-반응성 단백질 측정을 위한 광열바이오센서, 상기 광열바이오센서의 측정 장치 및 방법'이 있다. 다만, 국내등록특허 제10-1196481호의 C-반응성 단백질 검출용 칩과, 국내등록특허 제10-1570149호의 코티졸 및 씨-반응성 단백질 검출용 칩은, 그 구조와 제조공정이 복잡하며 다른 단백질로 방해되어 선택성이 낮은 단점이 있었다.

본 발명자들은, 인듐 주석 산화물(ITO) 마이크로디스크 전국 어레이(MDEA) 칩 위에 증착된 rGO-Au 나노입자(NP) 혼합물(hybrid) 구조로 구성된 새로운 혼합물 나노 바이오센서를 만들었으며, 전기적 임피던스 분광법(EIS) 기반으로 사람의 혈장에서 C-반응성 단백질 검출을 하기 위해 이를 사용할 수 있음을 보였다. 또한, rGO-NP의 표면을 사용하면, 전자의 이동 경로를 개선하고, 고정화된 anti-CRP 항체의 생물학적 활성을 보존할 수 있는지 여부를 조사하였다. EIS 측정 결과를 보면, rGO-NP 혼합물 구조로 인해 C-반응성 단백질의 검출을 위한 적절한 센서 플랫폼이 될 수 있고, 나노바이오센서의 일반적 디자인으로 유용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 인듐 주석 산화물(ITO) 마이크로디스크 전국 어레이(MDEA) 칩 기술을 이용하여, 미량의 C-반응성 단백질을 경제적이고 안정적으로 검출할 수 있는 나노바이오센서를 제공하고자 함에 있다. 또한 이러한 나노바이오센서의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 산화된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시켜 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)를 제조하는 단계;를 포함하는 나노센서의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 (1)단계는, (a) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 전기적증착(Electrodeposition)으로 금속나노입자를 증착시키는 단계;(b) 상기 (a)단계를 거친 ITO 기판에 환원제로 환원된 그래핀 산화물을 전기적증착(Electrodeposition)으로 증착시키는 단계;를 포함한다.

바람직하게는, 상기 환원제는 테트라클로로아우릭산(tetrachloroauric acid)인 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 (1)단계 이후에, (2) 상기 (1)단계에서 만들어진 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)에, C-반응성 단백질에 대한 항체를 고정시켜, 단백질 검출용 나노바이오센서를 제조하는 단계;를 더 포함한다.

바람직하게는, 상기 (2)단계는, (c) 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)을 처리하여, 상기 (1)단계에서 만들어진 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)의 환원된 그래핀 산화물에 결합시키는 단계;(d) C-반응성 단백질에 대한 항체를 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)과 아마이드 결합시켜 나노센서에 고정시키는 단계;를 포함한다.

바람직하게는, 상기 (2)단계 이후에, (3) 상기 (2)단계에서 만들어진 단백질 검출용 나노바이오센서에 비특이적 항체-항원 반응을 막을 수 있는 물질을 처리하여, C-반응성 단백질 검출용 나노바이오센서를 제조하는 단계;를 더 포함한다.

바람직하게는, 상기 비특이적 항체-항원 반응을 막을 수 있는 물질은, BSA(Bovine Serum Albumin)인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 어느 하나의 제조방법으로 만들어진 나노센서를 포함하는 C-반응성 단백질 검출용 칩을 제공한다.

바람직하게는, 상기 칩은, PDMS(Polydimethylsiloxane)로 이루어진 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 상기 칩은, 반대 전극을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 시료의 C-반응성 단백질의 함량을 측정하는 방법에 있어서, (1) C-반응성 단백질 검출용 칩의 측정용 계측(calibration) 곡선을 얻는 단계; (2) C-반응성 단백질 검출용 칩의 전극에 시료를 로딩하고 전극을 연결하여 임피던스를 측정하는 단계; (3) 상기 (2)단계에서 획득한 임피던스 값으로부터 시료의 C-반응성 단백질 함량을, 계측(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는, 시료의 C-반응성 단백질의 함량을 측정하는 방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 나노바이오센서인 환원된 그래핀 산화물과 금 나노입자 복합체를 대시간전류법으로 증착시킨 ITO 변형 혼합물 전극을 이용하고, 사람의 C-반응성 단백질에 대한 항체를 이에 고정시켜, C-반응성 단백질을 낮은 농도에서도 검출할 수 있었다. 이러한 검출 방법은 타겟인 C-반응성 단백질에 매우 특이적으로 검출할 수 있었으며, 용액 내 C-반응성 단백질의 로그 스케일 농도(1 ng mL^-1부터 1000 ng mL^-1까지)에 선형으로 비례하여 반응하였다. 검출 한계는 0.06 또는 0.08 ng mL^-1 에 이르러, C-반응성 단백질에 대한 고감도 나노바이오센서를 얻는 효과가 있다.

도 1은 CRP를 검출하기 위한 혼합물 임피던스 측정 센서의 모습과 제조과정 개념도. (a)는 8개의 원형 작동 전극(반지름 = 250μm이고, PDMS로 보통 이루어지며, 반대전극(CE)은 하나임)을 포함하는 rGO-NP/ITO 기반 MDEA 센서의 사진, (b)는 rGO-NP/ITO 기반 MDEA를 단계별로 제조하는 과정에 따른 변화 사진, (c) rGO-NP/ITO 기반 MDEA의 표면에 센서를 형성하는 과정을 포함하는 제조과정 모식도이다.
도 2는 전기화학측정법으로 증착 여부를 cyclic voltammetry로 확인한 과정. (a)는 그래핀 산화물(GO)과 AuNP을 함께 전기적으로 증착시킨 것, (b)는 증착으로 인해 전도도가 증가하는 것을 확인한 그래프.
도 3은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 확인한 전극의 증착과정에 따른 흡광도의 변화 그래프.
도 4는 각 (a) rGO/ITO 표면의 XRD 패턴 분석도; 및 (b) NP/ITO 및 (c) ERGO-NP/ITO 표면 XRD 패턴 분석도.
도 5는 rGO-NP/ITO 기반 MDEA의 단계별 제조과정에 따른 표면 변화를 보인 전자현미경 사진. (a)는 아무것도 없는 ITO 표면, (b)는 rGO/ITO 표면, (c)는 NP/ITO 표면, (d)는 rGO-NP/ITO의 표면 사진이다.
도 6은 혼합물 나노바이오센서의 전기화학 임피던스에 대한 보드 그래프(bode plot). (a)는 ITO, NP/ITO, rGO/ITO, rGO-NP/ITO에 대한 EIS 스펙트럼, (b)는 rGO-NP/ITO를 면역센서로 만드는 변형 과정에서 EIS 스펙트럼의 변화 그래프
도 7은 임피던스 스펙트럼(|Z|)을 normalize하고 다양한 Ccrp농도를 X축으로 하여 그린 그래프가 (a), (b)는 계측(calibration) 곡선이다.
도 8은 임피던스 스펙트럼(|Z|)을 normalize하고 다양한 인간 serum 내 Ccrp농도를 X축으로 하여 그린 그래프가 (a), (b)는 계측(calibration) 곡선이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 산화된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시켜 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)를 제조하는 단계;를 포함하는 나노센서의 제조방법을 제공한다.

상기 (1)단계는, (a) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 전기적증착(Electrodeposition)으로 금속나노입자를 증착시키는 단계;(b) 상기 (a)단계를 거친 ITO 기판에 환원제로 환원된 그래핀 산화물을 전기적증착(Electrodeposition)으로 증착시키는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 환원제는 테트라클로로아우릭산(tetrachloroauric acid)인 것이 바람직하다.

기 (1)단계 이후에, (2) 상기 (1)단계에서 만들어진 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)에, C-반응성 단백질에 대한 항체를 고정시켜, 단백질 검출용 나노바이오센서를 제조하는 단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (2)단계는, (c) 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)을 처리하여, 상기 (1)단계에서 만들어진 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)의 환원된 그래핀 산화물에 결합시키는 단계;(d) C-반응성 단백질에 대한 항체를 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)과 아마이드 결합시켜 나노센서에 고정시키는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (2)단계 이후에, (3) 상기 (2)단계에서 만들어진 단백질 검출용 나노바이오센서에 비특이적 항체-항원 반응을 막을 수 있는 물질을 처리하여, C-반응성 단백질 검출용 나노바이오센서를 제조하는 단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 비특이적 항체-항원 반응을 막을 수 있는 물질은, BSA(Bovine Serum Albumin)인 것이 바람직하다.

상기 칩은, PDMS(Polydimethylsiloxane)로 이루어진 것이 바람직하다.

상기 칩은, 반대 전극을 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 유리 기판위에 ITO 기반 MDEA의 준비

표준 photolithographic 과정을 사용하여, 유리 표면에 8개의 센싱 디스크 전극을 가진 ITO 코팅 전극 어레이를 형성하였다. 그리고 하나의 공유된 반대 전극(counter electrode)이 같이 존재한다(도 1 a 참조). 8개의 반응 챔버를 구성하는 물질은 PDMS를 사용하여 표준적인 방법으로 만들어진다.

실험예 2. rGO-NP/ITO 변형 MDEA의 준비

그래핀 산화물(1 mg mL^-1, in DI water)와 테트라클로로아우릭산(HAuCl₄ㅇ3H₂O, 0.5mM in DI water)의 혼합물로 구성된 용액을 그래핀-Au 나노구성물 합성에 사용한다. 순환전류전압 기법을 사용하여 전기적 증착을 수행한다. 전극 표면에 로딩하는 양을 조절하기 위해, 전압 스윕(sweep)은 전압의 범위를 0 내지 1.6 V로 제한한 3번의 증착 사이클로 한다. (도 1 b)는 ITO만 있는 경우부터 rGO/ITO, NP/ITO, rGO-NP/ITO로 증착되었을 때, MDEA에 대한 위상차 현미경 사진을 보인다. 가운데 까만 점이 단계별로 증착된 MDEA의 모습이다.

실험예 3. BSA/anti-CRP항체/MPA/rGO-NP/ITO 센싱 인터페이스의 준비

rGO-NP 형태까지 만들어진 MDEA는 (도 1 c)에서 ①단계를 거친 것이다. 그 다음으로 MDEA는 MPA와 함께 3시간 동안 반응하여 SAM 레이어를 형성하게 된다. MPA로 변형된 전극은 그 다음에 EDC (0.4 M)/NHS (0.1 M)과 반응하여 항체가 결합할 수 있는 부위가 만들어진다(도 1 c의 ②단계). 항-CRP 항체와는, 카르복실기와 아민기의 커플링 제재로 반응시켜 MDEA 표면에 고정시킨다(도 1 c의 ③단계). 이렇게 형성된 전극(anti-CRP antibodies/MPA/rGO-NP/ITO)에 BSA를 처리(도 1 c의 ④단계)하여, 비특이적 반응을 막는다. 결국 전극의 형태는 BSA/anti-CRP antibodies/MPA/rGO-NP/ITO가 되고, 마지막으로 C-반응성 단백질(CRP)의 검출(도 1 c의 ⑤단계)을 위해 사용할 수 있게 된다.

실험결과

(1) rGO-NP/ITO 전극의 전기화학적 특성

그래핀 산화물(GO)과 AuNP을 함께 전기적으로 증착시키는 것은, 음극(cathodic) 상태 하에서 환원 과정을 통하여 수행되었다(도 2 a 참조). 금속 NP와 그래핀 시트의 혼합물 구조를 형성하였다. ITO 전극에 rGO가 형성되고 GO가 증착되는 동안 순환전류전압측정 결과 그래프(cyclic voltammogram)가 그려졌다. 두 개(i, ii)의 음극(cathode) 피크와 하나(iii)의 양극(anode) 피크가 순환전류전압측정 결과 그래프(도 2 a 작은 그림)에서 관찰되었다. 연속적인 포텐셜(potential) 스캔 동안 전류 피크값이 증가하는 것으로 관찰되었다. 이는 그래핀 산화물의 전극 표면에 대한 분산으로부터, 전도성 그래핀의 증착이 이루어졌음을 나타낸다.

[Fe(CN)6]3-/4- 산화/환원 짝에서, rGO-NP 전극의 순환전류전압측정 피크는, ITO 디스크 전극 상의 개별 구성자의 그것보다 더 크다. 아무것도 없는 ITO 전극일때의 값보다 75% 정도 음극( anode) 피크 전류(Epa)가 증가한다(도 2 b 참조). 이러한 증가는 다른 변경된 전극에 비해 이러한 전극이 더 높은 표면적을 가지기 때문이다.

확산 레이어 두께의 효과는, rGO-NP/ITO 디스크 전극에서 증가된 전도성 때문인 것으로 돌릴 수 있다.

(2) rGO-NP/ITO의 표면 특성

혼합물 구조와, 해당 구조가 ITO 전극의 표면에 개별적으로 증착된 것은, 분산 반사 모드의 UV-Vis 스펙트럼을 조사하여 확인하였다. 각 변형 과정 후, 200 내지 900 nm 파장 에 걸쳐 스펙트럼을 얻었다(도 3 참조). rGO/ITO 전극은 흡수 피크(λ_max)를 238nm에서 보였고, 이는 C=C 아로마 링의 π-π* 변환 때문이다. 금(Au)이 증착된 ITO 표면은, 금 나노입자의 특성인 흡수 패턴에 따라, 넓은 피크(λ_max)가 530nm에서 보이게 된다. (도 3)을 보면, 550nm와 238nm에서 모두 피크가 관찰되었고, 이는 rGO-NP 혼합물 층이 형성되었음을 나타낸다.

(도 4)와 같이, GO, rGO, rGO-NP 표면에 대한 XRD 패턴을 조사하였다. GO의 XRD 패턴은 강한 피크가 2θ=11.7°에서 관찰되었다(도 4 b). 이는 층간 거리 7.6 옹스트롬에 해당한다. (도 4 c)에서 보이는 2θ = 24° 피크는, 그래핀 산화물의 환원 과정 중 일어나는 그래핀 나노시트의 랜덤 패킹에 해당하는 피크이다. (도 4 d)에서 보이는 2θ = 38.5° 와 2θ = 46.1° 피크가 보이는데, 이는 Au(111)과 Au(200)에 해당하는 것이다. 동시에 2θ = 23° 와 2θ = 35° 피크도 보이는데, 이는 전기적으로 증착된 rGO-NP 구조가 온전하다는 것을 나타낸다. 아무것도 없는 ITO(도 4 a)의 표면과 변형된 표면을 비교하면, rGO-NP/ITO가 GO와 HAuCl₄의 혼합물로부터 in situ 전기화학적 환원과정을 거쳐 잘 형성된 것을 확인할 수 있다.

전자현미경으로 표면의 거칠기와 형상을 보기 위해 사진을 찍었다. 그 결과 (도 5 a)에서 보듯이, 아무것도 없는 ITO 표면은 어떤 증착된 것이 없이 전체적으로 약간 솟은 부분만 보이는데, (도 5 b)를 보면, 얇은 커튼처럼 넓은 표면을 가졌지만 층을 이룬 구조를 나타내며, (도 5 c)를 보면, 입자 크기가 약 50 nm 인 나노입자가 표면에 증착된 것을 확인할 수 있고, (도 5 d)를 보면, rGO와 NP의 혼합물 구조를 볼 수 있어서 나노입자가 균질적으로 rGO 필름에 스태킹되고 뭉쳐 있지 않은 것을 볼 수 있다. 나노입자가 그래핀 산화물 층 사이로 끼어 들어가면 여러 장점을 갖는다. 그래핀 층이 뭉치는 것을 막으며, 필름의 전도성과 생물학적 응용성을 높인다.

(3) 전극의 임피던스 특성

EIS는, 센서 제조 과정에서 변형된 전극 표면의 인터페이스 성질을 분석하기에 적합하고, 전극 기반의 임피던스 측정 바이오센서의 개발을 위해 사용할 수 있는, 비파괴적이고 실시간으로 측정할 수 있는 도구이다. (도 6 a)처럼 ITO, NP/ITO, rGO/ITO, rGO-NP/ITO에 대해 EIS 스펙트럼을 얻었다. 높은 주파수에서는 반원 형태를 꺾이는 현상을 보이는데, 낮은 주파수에서는 확산에 의해서만 제한되는 과정이라서 선형의 형태를 보이고, 높은 주파수에서는 전자의 전송이 제한되는 것을 의미한다. ITO에서 NP/ITO, rGO/ITO, rGO-NP/ITO로 전극에 물질이 증착될수록 임피던스 감소 현상이 있는 것을 확인할 수 있다.

(도 6 a)의 회로와 같은 모델은, 측정된 주파수의 전체 범위에 걸쳐 임피던스 스펙트럼의 결과와 잘 들어맞는다. (표 1)에서는 변형된 Randles 회로 모델을 사용한 비선형 커브 적합 분석에 의해 계산된 파라메터 목록을 정리하였다. 전기적으로 증착된 전극의 표면 구성은 Rct 값으로 나타난다. 다른 변형 전극과 비교하여 rGO-NP/ITO의 상대적으로 작은 Rct 값은, 전극에서 일어나는 전하 전달 비율이 매우 개선되었음을 나타낸다. 따라서 Rct값은 변형된 MDEA의 특성을 나타내는 적절한 시그널로 간주된다.

< 표 1 : 도 6 a에서 보이는 MDEA 들의 측정된 Nyquist 그래프와 맞는 Randles 변형 동가 회로의 파라미터들 >

rGO-NP/ITO 전극에 대한 순차적 변형으로 C-반응성 단백질에 대한 바이오센서를 만드는 것은, Bode 그래프를 사용하여 특성을 볼 수 있다. 비록 링커와 단백질로 인해, 전하 및 구조에 따라 복잡한 전기적 성질이 나타나지만, 전극의 형상은, 낮은 주파수에서 관찰될 수 있는 redox 프로브의 전자 전달에 영향을 준다. 하지만, 1kHz 이상의 주파수에서는 임피던수 크기에 중대한 차이는 나타나지 않으며, 1kHz 주파수 이상에서는 전극의 인터페이스 현상으로 인한 전체 임피던스 크기에 대한 영향은 무시할 수 있을 정도가 된다.

(도 6 b)에서 화살표로 표시한 그래프의 변화를 보면, SAM 레이어를 형성하기 위해 3-MPA를 처리하면, 100Hz보다 낮은 주파수에서 임피던스 크기가 증가하며, 전극에 형성된 MPA에 EDC-NHS를 처리하면, 낮은 주파수에서 임피던스 크기가 감소한다. 이어서 CRP 항체를 SAM에 결합(binding)시키고, 이어서 비특이적 항원 결합을 피하기 위해 BSA를 처리하면, 낮은 주파수에서 임피던스 크기의 증가를 확인할 수 있다. 이는 rGO-NP 전극에 도달하는 redox 짝을 방해하는 절연층으로 작동하기 때문이다. BSA에 의한 고정화를 통해, 비특이적 배경 신호를 무시할 수 있게 만들고, 항원-항체 반응이 효과적으로 일어날 수 있게 한다. 또한, 음전하인 C-반응성 단백질(1 μg mL^-1)이 항체(10 μg mL^-1)와 결합하는 것으로 인해 임피던스 크기가 증가하며, 이는 결합 affinity와 관련이 있다.

(도 6 b)를 보면, 임피던스 변화와 차이가 나는 주파수대를 확인할 수 있다.

(4) CRP 단백질의 임피던스 검출

C-반응성 단백질(CRP)와 항-CRP 항체와의 반응을 검증하기 위해, 다양한 농도의 CRP(Ccrp)를 만들어, BSA/anti-CRP antibodies/MPA/rGO-NP/ITO MDEA에서 시험하였다. 측정한 결과인 임피던스 스펙트럼(|Z|)을 normalize하고 다양한 Ccrp농도를 X축으로 하여 그린 그래프가 (도 7 a)이다. normalize된 임피던스 크기는 증가하는 Ccrp 농도에 비례하는 것을 확인할 수 있다. 계측(calibration) 곡선은, CRP 반응 이후 10Hz에서 △Z(△Z = (|Z|antigen-|Z|anti-CRPantibodies)/|Z|anti-CRPantibodies) 변화에 따라 측정하여 계산하였다. IC50 값이 50.4 ng mL^-1로 계산되었다.

(5) 인간 serum 내의 CRP 단백질의 임피던스 분석

나노바이오센서의 실제 활용을 위해서는, anti-CRP antibodies/MPA/rGO-NP/ITO 전극을 이용하여, 인간의 serum 샘플 내에서 CRP 양을 결정할 수 있는지 조사해야 한다. (도 8 a)의 결과를 보면, 다양한 농도의 인간 serum 내 C-반응성 단백질에 대해, △Z값의 변화가 비례한다는 것이 확인되었으며, (도 8 b)와 같이 계측(calibration) 곡선을 구해보면, IC50 값이 43.4 ng mL^-1로 계산되었다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

(1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판의 표면에, 2차원적인 환원 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시켜, 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)를 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 만들어진 혼합물 임피던스 측정 전극 센서(rGO-NP/ITO)에, 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)을 처리하여 상기 2차원적인 환원 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)에 결합시키는 단계;
(3) C-반응성 단백질에 대한 항체를 상기 (2)단계의 3-머캅토프로피오닉산(3-mercaptopropionic acid)과 아마이드 결합시켜 나노센서에 고정시켜 단백질 검출용 나노바이오센서를 만드는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에서 만들어진 단백질 검출용 나노바이오센서에 비특이적 항체-항원 반응을 막을 수 있는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 처리하여, C-반응성 단백질 검출용 나노바이오센서를 제조하는 단계;를 포함하는 나노센서의 제조방법.
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