CN111273031A - 一种用于生物标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于生物标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用。该试剂盒包括独立包装的生物芯片和纳米标签。制备方法如下：所述生物芯片以载玻片为载体，在载玻片上蒸镀有一层铬膜，铬膜上蒸镀有一层金膜，金膜上修饰有待检测生物标志物对应的抗体；所述纳米标签由待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混合即得。本发明在生物芯片上滴加待检测生物标志物和纳米标签，形成双抗夹心结构；利用金纳米颗粒具有超辐射效应，在暗场下，纳米金颗粒会呈现出一个很亮的点，再通过计算金纳米颗粒数目以得到检测结果，可用于生物标志物的检测便于检测，可视性大幅提高，并显著提高检测灵敏度。

Description

一种用于生物标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物标志物检测技术领域，尤其涉及一种用于生物标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。
现有的生物标志物的检测方法有酶联免疫吸附检测、表面等离子体共振检测、电化学检测、拉曼和荧光检测等方法。但是这些检测手段存在灵敏度低、需标记、费用高(需光谱仪)的缺点。亟需一种检测简单、仪器要求门槛低，且保证灵敏度的高效检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生物标志物检测的试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒检测灵敏度高、无须标记、仪器配置简单。
本发明提供以下技术方案：
本发明的目的之一在于提供用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备生物芯片：
以载玻片为载体，在载玻片上依次镀铬膜和金膜，再在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体；
(2)制备纳米标签：
将待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混合即得。优选的，将待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混匀后，静置0.8～1.2h，得到纳米标签。
进一步，所述步骤(1)中镀膜的方法为蒸镀，蒸镀的蒸发速率独立为0.04～0.06nm/s，优选为0.05nm/s；蒸镀时间独立为90～110s，100s；优选为蒸镀温度独立为20～30℃；优选为25℃。
进一步，所述步骤(1)中铬膜的厚度为4～6nm。优选为5nm。
进一步，所述步骤(1)中金膜的厚度为45～55nm。优选为50nm。
进一步，所述生物标志物包括免疫球蛋白。优选为人免疫球蛋白。生物标志物对应的抗体相对应的为免疫球蛋白抗体，优选为羊抗人免疫球蛋白。
进一步，所述步骤(1)中在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体的方法为：在金膜表面滴加16-巯基十六烷基酸，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，然后滴加抗体，静置0.8～1.2h。优选的，16-巯基十六烷基酸的滴加量优选为30μL/cm2，静置时间均为1h，冲洗次数为3次，抗体滴加量为20μL/cm2，抗体的浓度优选为1mg/mL。
进一步，所述步骤(2)中纳米金颗粒水溶液中纳米金颗粒的浓度为0.02～0.04nM；所述纳米金颗粒的粒径为50～70nm。所述待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液的体积比优选为1:50；所述纳米金颗粒水溶液的溶剂优选为去离子水；所述去离子水的电阻率优选为18.3MΩ·cm-1；所述纳米金颗粒水溶液中纳米金颗粒的浓度优选为0.02～0.04nM，更优选为0.03nM；所述纳米金颗粒的粒径优选为50～70nm，更优选为60nm；所述静置的时间优选为1h。
本发明的目的之二在于提供利用上述方法制备的用于生物标志物检测的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供上述用于生物标志物检测的试剂盒的应用方法，包括以下步骤：在生物芯片表面滴加待检测生物标志物，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，滴加纳米标签，静置0.8～1.2h后用去离子水冲洗，干燥，进行镜检。
进一步，所述镜检于暗场显微物镜下进行，物镜倍数为100×。
本发明中，所述待检测生物标志物的滴加量优选为20～50μL/cm2，更优选为30μL/cm2；所述纳米标签的滴加量优选为25～50μL/cm2，更优选为30μL/cm2；所述镜检于暗场显微物镜下进行，物镜倍数优选为100×；所述镜检优选优选是经过100×物镜收集的散射光通过可调带通滤光片，并导入成像系统获得暗场图像；所述静置的时间独立优选为1h。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计的试剂盒由生物芯片和纳米标签组成，生物芯片上设置有金膜，纳米标签含有纳米金颗粒，且两者均含有抗体，在使用过程中待检测生物标志物滴加于前两者之间，形成双抗夹心结构；金纳米颗粒具有超辐射效应，且金膜和纳米金颗粒有耦合作用，增强金颗粒的散射，在暗场下，纳米金颗粒会呈现出一个很亮的点，极大地提高检测结果的可视性，通过计算金纳米颗粒数目得到检测结果，进而显著提高检测灵敏度；利用该试剂盒对对人免疫球蛋白进行检测，检测限为10-2ng/mL，灵敏度很高；
(2)本发明提供的制备方法简单、仪器配置要求低，无须拉曼和荧光标记，降低了生产和使用成本，适用场景广，可用于临床检测；
(3)提供了一种制备简单的、灵敏度高的、检测方便的试剂盒制备和应用思路，具有较大的应用潜力。
附图说明
图1为实施例1中人免疫球蛋白检测结果；
图2为实施例1中空白样品检测结果；
图3为对比例1中人免疫球蛋白检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明，本发明的内容完全不限于此。
本发明提供了一种用于生物标志物检测的试剂盒，包括独立包装的生物芯片和纳米标签。
制备方法如下：
(1)制备生物芯片：
以载玻片为载体，在载玻片上依次镀铬膜和金膜，再在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体；
(2)制备纳米标签：
将待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混合即得。优选的，将待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混匀后，静置0.8～1.2h，得到纳米标签。
进一步，所述步骤(1)中镀膜的方法为蒸镀，蒸镀的蒸发速率独立为0.04～0.06nm/s，优选为0.05nm/s；蒸镀时间独立为90～110s，100s；优选为蒸镀温度独立为20～30℃；优选为25℃。
进一步，所述步骤(1)中铬膜的厚度为4～6nm。优选为5nm。
进一步，所述步骤(1)中金膜的厚度为45～55nm。优选为50nm。
采用两层蒸镀的目的在于，直接使用金蒸镀在载玻片上容易出现脱落，先蒸镀铬再蒸镀金利于金膜的吸附性，防止脱落。
进一步，所述生物标志物包括免疫球蛋白，优选为人免疫球蛋白；所述生物标志物对应的抗体相对应的为免疫球蛋白抗体，优选为羊抗人免疫球蛋白。
进一步，所述步骤(1)中在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体的方法为：在金膜表面滴加16-巯基十六烷基酸，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，然后滴加抗体，静置0.8～1.2h。优选的，16-巯基十六烷基酸的滴加量为30μL/cm2，静置时间均为1h，冲洗次数为3次，抗体滴加量为20μL/cm2，抗体的浓度为1mg/mL。
进一步，所述步骤(2)中纳米金颗粒水溶液中纳米金颗粒的浓度为0.02～0.04nM；所述纳米金颗粒的粒径为50～70nm。所述待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液的体积比优选为1:50；所述纳米金颗粒水溶液的溶剂优选为去离子水；所述去离子水的电阻率优选为18.3MΩ·cm-1；所述纳米金颗粒水溶液中纳米金颗粒的浓度优选为0.02～0.04nM，更优选为0.03nM；所述纳米金颗粒的粒径优选为50～70nm，更优选为60nm；所述静置的时间优选为1h。
本发明的所制备的用于生物标志物检测的试剂盒的应用方法，包括以下步骤：在生物芯片表面滴加待检测生物标志物，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，滴加纳米标签，静置0.8～1.2h后用去离子水冲洗，干燥，进行镜检。
进一步，所述镜检于暗场显微物镜下进行，物镜倍数为100×。
本发明中，所述待检测生物标志物的滴加量优选为20～50μL/cm2，更优选为30μL/cm2；所述纳米标签的滴加量优选为25～50μL/cm2，更优选为30μL/cm2；所述镜检于暗场显微物镜下进行，物镜倍数优选为100×；所述镜检优选优选是经过100×物镜收集的散射光通过可调带通滤光片，并导入成像系统获得暗场图像；所述静置的时间独立优选为1h。
下述实施例中，载玻片的规格为1×1cm，为浮法玻璃，购自于江苏实验器材有限公司；纳米金颗粒购自于BBI solution(中国公司必艾生物技术(上海)有限公司)，粒径为60nm。
实施例1
人免疫球蛋白的检测
载玻片：1×1cm的干净载玻片，浮法玻璃材质，购自江苏实验器材有限公司。
1.使用热蒸发镀膜机在载玻片上先蒸镀5nm铬膜，蒸发速率0.05nm/s，蒸镀时间100s，蒸镀温度25℃；
2.使用热蒸发镀膜机在铬膜表面蒸镀50nm金膜，蒸发速率0.05nm/s，蒸镀时间100s，蒸镀温度25℃；
3.在蒸镀好的金膜表面修饰人免疫球蛋白抗体，具体方法是在金膜表面滴加30μL16-巯基十六烷基酸，静置1h后，用去离子水冲洗三次，然后滴加20μL浓度为1mg/mL的人免疫球蛋白抗体，静置1h，人免疫球蛋白抗体连接在金膜上；
4.将人免疫球蛋白抗体加入到纳米金颗粒水溶液中，静置1h，抗体吸附到金纳米颗粒上，得到纳米标签；金颗粒溶液的浓度约0.03nM，颗粒的尺寸是60nm；
5.在金膜表面滴加50μL浓度为10-2ng/mL人免疫球蛋白，静置1h后用去离子水冲洗三次，接着滴加50μL制备好的纳米标签，静置1h后用去离子水冲洗，干燥，得到生物芯片。
6.将生物芯片置于暗场显微物镜下，经过100×物镜收集的散射光通过可调带通滤光片，并导入成像系统获得暗场图像。
空白样品为不加入免疫球蛋白的情形。
检测结果参见图1，图1显示10-2ng/mL的人免疫球蛋白对应的暗场图像，其纳米颗粒的数目比空白样品(图2)的金颗粒数量多3倍以上，表明该方法的检测限为10-2ng/mL，灵敏度高。
对比例1
拉曼检测
1.金膜表面滴加30μL 16-巯基十六烷基酸，静置1h后，用去离子水冲洗三次，然后滴加20μL浓度为1mg/mL的人免疫球蛋白抗体，静置1h，人免疫球蛋白抗体连接在金膜上。
2.纳米标签：首先将5μL，浓度为10-3M的4-巯基苯甲酸溶液加入到500μL的金颗粒溶液中，混合1h后，将免疫抗体加入到纳米金颗粒水溶液中，静置1h后抗体将吸附到金颗粒上。金颗粒溶液的浓度约0.03nM，颗粒的尺寸是60nm。
3.通过滴加浓度分别为1μg/mL和1ng/mL的30μL人免疫球蛋白，静置1h后用去离子水冲洗三次，接着滴加30μL制备好的纳米标签，静置1h，金颗粒将连接在金膜上。
4.去离子水冲洗和干燥后，将该芯片置于显微物镜下，经过100×物镜收集的拉曼散射光获得拉曼信号。
该方法需要昂贵光谱仪采取信号。
检测结果参见图3，由图3可知在1070cm-1和1585cm-1处的拉曼强度相对标准差很大，这对标志物的定量产生困难。空白例为不加入免疫球蛋白的情形。另外，人免疫球蛋白浓度为1ng/mL时的拉曼谱在1070cm-1处的拉曼强度约为空白样品的3倍，根据检测限的定义，该方法的检测限仅为1ng/mL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备生物芯片：
以载玻片为载体，在载玻片上依次镀铬膜和金膜，再在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体；
(2)制备纳米标签：
将待检测生物标志物对应的抗体和纳米金颗粒水溶液混合即得。
2.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中镀膜的方法为蒸镀，蒸镀的蒸发速率独立为0.04～0.06nm/s，蒸镀时间独立为90～110s，蒸镀温度独立为20～30℃。
3.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中铬膜的厚度为4～6nm。
4.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中金膜的厚度为45～55nm。
5.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述生物标志物包括免疫球蛋白；所述对应的抗体为免疫球蛋白抗体。
6.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在金膜上修饰待检测生物标志物对应的抗体的方法为：在金膜表面滴加16-巯基十六烷基酸，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，然后滴加抗体，静置0.8～1.2h。
7.根据权利要求1所述的用于生物标志物检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中纳米金颗粒水溶液中纳米金颗粒的浓度为0.02～0.04nM；所述纳米金颗粒的粒径为50～70nm。
8.一种用于生物标志物检测的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1～7任一项所述的方法制备。
9.一种权利要求8所述的用于生物标志物检测的试剂盒的应用方法，包括以下步骤：在生物芯片表面滴加待检测生物标志物，静置0.8～1.2h后，用去离子水冲洗，滴加纳米标签，静置0.8～1.2h后用去离子水冲洗，干燥，进行镜检。
10.根据权利要求9所述的用于生物标志物检测的试剂盒的应用方法，其特征在于：所述镜检于暗场显微物镜下进行，物镜倍数为100×。
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