KR20190049223A - 전극에 금 나노입자을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 측정 감도를 높인 나노바이오센서 - Google Patents

전극에 금 나노입자을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 측정 감도를 높인 나노바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전극에 금 나노입자와 환원된 그래핀 산화물을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 및 이를 활용한 나노바이오센서에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 금 나노입자를 증착시키고, TNF-alpha 항체를 결합시킨 IDE를 사용하여, 수용체 분자인 TNF-alpha에 더 잘 결합하며 생물학적 활성을 존속시키는 플랫폼을 제공하는 효과가 있다.
구체적으로는, 금 나노입자와 환원된 그래핀 산화물(rGO)이 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하여, TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 기반 면역센서를 개발하여, 일반적 IDE에 비해 향상된 감도를 보이고 잘못된 부착이 일어나지 않도록 한다. 극미량 TNF-alpha 농도에 의존적으로 임피던스 값이 영향 받는 것을 확인하였고, 0.43pg/ml의 농도까지 측정 가능하였다.
향상된 감도를 보이는 바이오센서는 환자의 질병 진단 과정에서도 TNF-alpha 농도 측정 용도로 다양하게 응용될 수 있는 효과가 있다.

Description

전극에 금 나노입자을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 측정 감도를 높인 나노바이오센서{Nano-biosensor with electrode for enhanced sensing TNF-alpha by deposition of gold nanoparticle and covalent TNF-alpha antibody binding}
본 발명은 전극에 금 나노입자와 환원된 그래핀 산화물을 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 및 이를 활용한 나노바이오센서에 관한 것이다.
전기화학 바이오센서는 그 민감성, 선택성, 간단성 및 낮은 가격에 의해 치료 진단, 식품 분석 및 환경감시(environmental monitoring) 분야에서 주목받고 있으며 주요 분석 도구로 자리매김하고 있다. 이런 이유로, 민감성과 선택성이 뛰어난 전기화학 바이오센서를 이용한 새로운 전략적 센서 플랫폼은 꾸준히 발전하고 있다.
종양 괴사 인자 alpha(TNF-alpha)는 알레르기성 비염 및 결막염을 포함하는 면역 및 염증 반응에서 중추적인 역할을 수행하는 것으로 보이는 사이토카인이다. TNF-alpha는 17 kD 단백질 서브유닛의 가용성 동종삼량체(homotrimer)이다 (Smith, 1987). TNF-alpha는 다른 세포 종류와 함께, 단핵 세포 및 대식구로부터 유래된다. TNF-alpha의 조절은 알레르기성 결막염 및 TNF-alpha의 활성화와 관련된 다른 증상을 위한 치료적 전략으로 제안되었다.
TNF-alpha의 농도를 정밀하게 검출하면, 임상에서 사용하는 진단 및 신약 개발을 위한 약리적 반응 검사에 적용할 수 있다.
전기화학 바이오센서에 대한 대다수의 연구는 민감한 전기화학 센서를 고안함에 있어 금속 나노입자의 혼합에 주목해 왔다. 촉매 활성, 광학, 전기 및 자기력과 같은, 벌크(bulk) 구조에서는 나타나지 않는 나노입자 고유의 특성들을 얻기 위해, 최근 많은 노력이 전기를 이용한 나노입자 증착에 집중되어왔다.
본 발명자들은, 인듐 주석 산화물(ITO) 마이크로디스크 전국 어레이(MDEA) 칩 위에 증착된 환원된 그래핀 산화물(rGO) 및 금(Au) 나노입자(NP)의 혼합물(hybrid) 구조로 구성되고, 추가로 TNF-alpha 항체가 결합된 새로운 나노 바이오센서를 만들었고, 이를 TNF-alpha 측정용 면역센서로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 물질적 특성과 나노구조에 의해 환원된 그래핀 산화물과 금 나노입자를 증착시키고 TNF-alpha 항체를 결합시킨 전극을 제조하여, 기존 IDE보다 측정감도를 높임으로써, 미량의 TNF-alpha 물질을 경제적이고 안정적으로 검출할 수 있는 나노바이오센서를 제공하고자 함에 있다. 또한 이러한 나노바이오센서의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면에 나노입자가 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하는 TNF-alpha 측정용 전극을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 전극과 상기 TNF-alpha 항체의 결합은 공유 결합인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서를 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 산화된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시키고, TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha 측정용 전극 센서(NP-rGO/ITO)를 제조하는 단계;를 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (1)단계는, (a) 인듐 주석 산화물(ITO) 전극 표면에, 환원제로 환원된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)을 전기적증착(Electrodeposition)으로 증착시키는 단계; (b) 상기 (a)단계를 거친 전극 표면에, 전기적 증착(Electrodeposition)으로 금(Au)나노입자를 증착시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계를 거친 전극 표면에, TNF-alpha 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계; (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는, 시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 금 나노입자를 증착시키고, TNF-alpha 항체를 결합시킨 IDE를 사용하여, 수용체 분자인 TNF-alpha에 더 잘 결합하며 생물학적 활성을 존속시키는 플랫폼을 제공하는 효과가 있다.
구체적으로는, 금 나노입자와 환원된 그래핀 산화물(rGO)이 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하여, TNF-alpha에 대한 측정 감도를 높인 전극 기반 면역센서를 개발하여, 일반적 IDE에 비해 향상된 감도를 보이고 잘못된 부착이 일어나지 않도록 한다. 극미량 TNF-alpha 농도에 의존적으로 임피던스 값이 영향 받는 것을 확인하였고, 0.43pg/ml의 농도까지 측정 가능하였다.
향상된 감도를 보이는 바이오센서는 환자의 질병 진단 과정에서도 TNF-alpha 농도 측정 용도로 다양하게 응용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 최종적으로 제조된 IDE의 모습 사진과 각 단계의 모식도. (a)는 8개의 반응 챔버를 가진 IDE의 사진. (b)부터 (e)까지는 반응 챔버를 확대한 사진. 전극의 모양을 확인 가능하며, 한 단계씩 증착될 때마다 변하는 모습을 확인 가능하다. (f)는 TNF-alpha 측정용 IDE 전극의 표면이 어떤 과정을 거쳐 만들어 지는지 설명한 모식도.
도 2에서 (a)는 GO 전극-환원과정에서 측정한 Cyclic voltammogram이고, (b)는 금속나노입자(AuNP)의 증착과정에서 측정한 Chronoamperogram 그래프.
도 3은, RGO/ITO, NP/ITO 및 NP-RGO/ITO형태로 구조가 변화할 때, UV-Vis 흡수 스펙트럼의 변화를 보인 그래프.
도 4는, (a)의 경우 ITO, (b)의 경우 RGO/ITO, (c)의 경우 NP/ITO 및 (d)의 경우 NP-RGO/ITO의 원자현미경 사진. (e)는 각 종류의 전극에 따라 변화된 Topographic 프로파일. 측정은 (a), (b), (c), (d)에서 흰선으로 나타나는 부분을 따라 측정하였다.
도 5는, (a)는 임피던스 양 |Z|의 Bode 곡선, (b) 위상과 주파수간 관계를 ITO, RGO/ITO, NP/ITO 및 NP-RGO/ITO에 대해 얻은 그래프.
도 6은, 완성된 전극 센서의, 측정물질 임피던스에 대한 Nyquist 그래프.
도 7은, (a)는 측정대상인 TNF-alpha 농도에 따라, 저항값이 변화를 나타낸 그래프, (b)는 측정대상 물질인 TNF-alpha의 농도를 측정하기 위한 칼리브레이션(calibration) 커브.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면에 나노입자가 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하는 TNF-alpha 측정용 전극을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 전극과 상기 TNF-alpha 항체의 결합은은 공유 결합인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서를 제공한다.
또한 본 발명은, (1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 산화된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시키고, TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha 측정용 전극 센서(NP-rGO/ITO)를 제조하는 단계;를 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 (1)단계는, (a) 인듐 주석 산화물(ITO) 전극 표면에, 환원제로 환원된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)을 전기적증착(Electrodeposition)으로 증착시키는 단계; (b) 상기 (a)단계를 거친 전극 표면에, 전기적 증착(Electrodeposition)으로 금(Au)나노입자를 증착시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계를 거친 전극 표면에, TNF-alpha 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은, (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계; (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는, 시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법을 제공한다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. AuNP/IDE 어레이 제조
3-mercaptopropionic acid (MPA), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로 클로라이드(EDC), N-히드록시숙신이미드(NHS), 소 혈청 알부민(BSA) 및 폴리(디메틸실록산)(PDMS)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 재조합 TNF-alpha는 Enzo Life Sciences, Inc.에서 구입하였다. TNF-alpha 단클론항체는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 인산염 완충 식염수 (1X PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 및 1.4mM KH2PO4, pH 7.4) 및 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산 (MES; 0.1M, pH 6.0)은, Tech and Innovation사에서 얻었다. 탈이온수(증류수) (18.2 MΩㅇcm)는 Milli-Q 시스템으로부터 얻고 실험 전반에 걸쳐 사용하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석(analytical) 등급으로 사용하였다.
표준 포토 리소그래피 절차를 사용하여, 7.5cm ㅧ 25cm 크기 기판 상에 직경 500㎛ 및 두께 490nm의 ITO 코팅 디스크 전극 어레이 (8 개의 작동 디스크 전극 및 공통으로 사용하는 커다란 역전극을 구 함) 유리 기판 (도 1 참조)에서 (도 1)과 같은 과정을 거쳐 전극을 제조하였다. 제조된 전극이 있는 8 개의 반응 컨테이너가 포함된 플라스틱 챔버가 있고, 이 전극에서 전기 화학 증착 및 면역 반응이 일어나도록 용매를 보관하였다. 제조된 전극을 Triton X 100, 물 (1 : 5, v / v) 및 에탄올로 이어지는 용액에서 초음파 처리로 세정 한 후, 증류수로 세정하고 질소 흐름 하에서 건조시켜서, 최종적으로 유리 기판 상에 전극 어레이를 형성하였다.
그래핀 옥사이드(1mg/ml, 용매는 증류수)와 tetrachloroauric산(HAuCl4ㅇ3H2O, 0.5 mM 농도, 용매는 증류수)을 넣고 전기화학적 증착반응을 (도 2)와 같이 수행하였다. 이는 cyclic voltammetry를 3극 시스템하에서 해당 전극을 작동 전극으로 하여 수행되었다. 이때 Ag/AgCl 전극은 기준 전극으로 사용되고, 대형 ITO 패턴층은 역(counter)전극이 되었다. 전극 표면에 환원된 그래핀 옥사이드(RGO)를 로딩하는 것을 조절하기 위해, 전압이 조절되어, 3번의 증착 사이클이 0 내지 -1.6 V 내에서 이루어졌다. scan rate는 25mV/s로 하였다. 금 나노입자(AuNP)를 전극에 증착시키기 위해서 증착 전압은 -0.9 V가 적용되었고, 증류수 내의 tetrachloroauric산을 사용하여 30초간 이루어졌다.
(도 3)은 흡수 스펙트럼을 UV-Vis 분광계(Optizen Pop, Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용해 기록한 것이다. 환원 된 그래핀 옥사이드, 금 나노입자 및 복합 물질의 막을 ITO의 석영 표면에 증착하고 3nm/s의 스캔 속도로 200에서 800nm 범위로 스캔하였다. 증착이 된 전극 표면의 표면 토포그래피는 비접촉 모드로 작동되는 원자현미경 (PSIA XE-100, Park Systems, Korea)에 의해 0.5 Hz의 속도로 스캐닝되어 얻어졌고, (도 4)와 같이 확인하였다.
나노입자와 결합된 NP-RGO 형태의 전극을 3-MPA 물질과 함께 3 시간 동안 항온 배양하여 자기조립 단일층을 형성하였다. MPA로 변형된 전극은 이어서 TNF-alpha 항체와의 결합을 위해 EDC(0.4 M) / NHS(0.1 M) 용액에 담그었고, 활성화된 표면상에 10 ㎍ / ㎖의 공유 결합을 형성하기 위해, 20 ㎕의 항-TNF-항체 용액을 각 전극 칩 상에 드롭 캐스팅하고 습기가 있는 챔버에서 2시간 동안 유지시켜, 항-TNF-alpha 항체를 대상 전극 위의 항-TNF-alpha 항체의 아미노기와 EDC/NHS로 활성화 된 MPA 분자 사이에서, 커플링 반응을 일으켜 공유결합으로 고정되게 하였다. 마지막으로, 비특이적 흡착을 피하기 위해 BSA(1 ng mL-1 in PBS, 10 mM, pH 7.4)를 처리하였다. 결과적으로 anti-TNF-alpha 항체-MPA-NP-RGO-ITO의 구조를 갖게 되어 완성되었다.
실험예 2. AuNP/IDE 기반 TNF-alpha 면역센서 확인
TNF-alpha 항원과의 효과적인 결합 확인은 전기화학적 임피던스 분광법(EIS) 분석으로 수행되었다. 제조된 AuNP/IDE는 3-MPA의 ethanolic 10 mM 용액에 6 시간 동안 실온에서 담겨 처리되었다. (도 5)는 전기화학적 증착을 통해 얻어진 전극 표면의 전기적 특성에 대한 정보를 얻은 결과이다.
실험결과
(1) anti-TNF-alpha 항체-MPA-NP-RGO-ITO 전극의 전기화학적 특성 ?? 임피던스와 정전용량(커패시턴스)
EIS 결과, (도 5)와 같은 그래프를 얻을 수 있었다. 임피던스 양 |Z|의 Bode 곡선과, 위상과 주파수간 관계를 ITO, RGO/ITO, NP/ITO 및 NP-RGO/ITO에 대해 얻은 그래프를 얻을 수 있었으며, 높은 주파수에서, 총 임피던스는 전해질 용액 (RS)의 옴 저항에 의해 결정되었고 따라서 위상이 0에 가깝게 나타났다. 측정 된 주파수 범위에서 용량성 전극 계면 임피던스가 전하와 병렬로 관찰되었다
비선형 커브 피팅 분석으로 외삽된 변형 Randles 회로 모델 파라미터는 (표 1)과 같다.
(표 1)
Figure pat00001
(도 6)은, 완성된 전극 센서들의 측정물질 임피던스에 대한 Nyquist 그래프를 보인다. TNF-biosensor의 표면 상태의 변화를 보면, 전하 이동 저항 (RCT, 낮은 주파수에서의 저항)에 잘 반영되며, 1pg/ml부터 1000pg/ml의 농도까지 TNF-alpha의 농도를 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.
(2) anti-TNF-alpha 항체-MPA-NP-RGO-ITO 전극의 전기화학적 특성 ?? TNF-alpha 농도 측정
(도 7)의 (a)는 측정대상인 TNF-alpha 농도에 따라, 저항값의 변화를 나타낸 그래프이며, 수 Hz 이하의 낮은 주파수에서 저항의 상당한 변화가 있었고, 저항 값은 TNF-의 농도가 증가함에 따라 증가한다는 것을 알 수 있다.
센서 민감도와 검출 한계를 평가하기 위해 선형 회귀 (r = 0969)를 사용하여 저항 변화에 대한 보정 곡선을 얻었으며, y = 37337+12890x의 식이 된다. 여기서 y는 1Hz에서의 저항값이며, x는 CTNF는 pg/ml 단위로 나타낸 TNF의 농도이다. 검출 한계는 0.43 pg/ml의 매우 낮은 값으로 나타났다. 이는 TNF가 최하 24.7fM의 농도가 될 때까지 측정할 수 있다는 것으로, 임상에서 사용할 수 있는 정도의 충분히 낮은 값이다.
본 발명에서 개발된 면역 바이오 센서는 값비싼 형광 염료, 시약 및 정교한 기기를 필요로 하지 않기 때문에 경제적인 도구이다. 질병 진단을 위해 대상이 되는 피험자로부터 TNF-alpha 농도 수준을 검출하는 데 있어서, 용이하게 적용할 수 있는 다목적 도구가 될 것이다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 표면에 나노입자가 증착되어 있고, TNF-alpha 항체를 포함하는 TNF-alpha 측정용 전극.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자는 금(Au) 나노입자인 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 전극.
  3. 제 1항에 있어서,
    전극과 상기 TNF-alpha 항체의 결합은 공유 결합인 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 전극.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 전극을 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서.
  5. (1) 인듐 주석 산화물(ITO) 기판에 환원된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)과 금속나노입자를 증착시키고, TNF-alpha 항체를 결합시켜 TNF-alpha 측정용 전극 센서(NP-rGO/ITO)를 제조하는 단계;를 포함하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 (1)단계는,
    (a) 인듐 주석 산화물(ITO) 전극 표면에, 환원제로 환원된 그래핀 산화물(reduced Graphene Oxide, rGO)을 전기적증착(Electrodeposition)으로 증착시키는 단계;
    (b) 상기 (a)단계를 거친 전극 표면에, 전기적 증착(Electrodeposition)으로 금(Au)나노입자를 증착시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계를 거친 전극 표면에, TNF-alpha 항체를 공유결합으로 고정시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF-alpha 측정용 면역 센서의 제조방법.
  7. (1) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 측정용 교정(calibration) 곡선을 얻는 단계;
    (2) TNF-alpha 측정용 면역 센서의 전극에 시료를 넣고 전극을 연결하여 정전용량(capacitance)을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계에서 획득한 정전용량 값으로부터 시료의 TNF-alpha 함량을, 교정(calibration) 곡선을 이용하여 구하는 단계;를 포함하는,
    시료의 TNF-alpha 함량을 측정하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102270811B1 (ko) * 2020-06-30 2021-06-30 (주)바이오제네시스 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서
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