KR102522561B1 - 아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서 - Google Patents

아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 사이클로덱스트린/환원 그래핀 산화물(CD/RGO) 나노복합체를 기반으로 하여 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40 단백질을 효과적으로 검출할 수 있는 무표지(label-free) 방식의 검출 센서(또는 검출 플랫폼), 및 이를 이용하여 극미량의 시료 내 아밀로이드베타 1-40 단백질에 대하여도 양호한 감도로 검출하는 방법이 개시된다.

Description

아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서{Capacitance sensor for Detecting Amyloid-beta 1-40 Protein}
본 개시 내용은 아밀로이드베타 1-40 단백질(aβ40) 검출용 커패시턴스 센서에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 사이클로덱스트린/환원 그래핀 산화물(CD/RGO) 나노복합체를 기반으로 하여 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40 단백질을 효과적으로 검출할 수 있는 무표지(label-free) 방식의 검출 센서(또는 검출 플랫폼), 및 이를 이용하여 극미량의 시료 내 아밀로이드베타 1-40 단백질에 대하여도 양호한 감도로 검출하는 방법에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(Alzheimer's disease)은 기억력, 인지 능력, 추론 등과 같은 정신 작용의 저하와 관련된 증상으로 정의되는 가장 흔한 질환이다. 알츠하이머 질환은 치매를 유발하는 가장 큰 원인의 하나로, 알츠하이머 환자 수는 점점 증가하고 있으나, 정확한 원인이 규명되지 않고 있다. 또한, 알츠하이머 질환에 대한 효과적인 치료법 역시 개발되지 않은 실정이다. 다만, 알츠하이머성 치매의 주요 원인 단백질인 아밀로이드베타(amyloid-β, Aβ), 뉴런 세포질 내에서 비정상적으로 인산화된 타우(phosphorylated tau, p-tau) 단백질 등의 응집물 또는 침착물(구체적으로 아밀로이드베타 펩타이드 및 신경 섬유가 뒤엉켜 생성되는 신경성 플라크(neuritic plaques))이 신경 독성을 유발시켜 치매를 일으키는 것으로 알려져 있다.
현재, 아밀로이드베타, 인산화된 타우 단백질 등으로부터 형성된 신경섬유의 응집 또는 침착을 확인하기 위하여, 대부분 신경심리학적인 검사(GDS, MMSE), 또는 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기공명영상(MRI) 등의 진단 장치를 이용하고 있다(Alzheimer's & Dementia, Vol. 14, Issue 4, 535-562 (2018) 등). 그러나, 이러한 진단 기술의 경우, 많은 시간 및 비용이 소요되며, 특히 PET 및 MRI는 구역질, 두통, 구토 등과 같은 부작용을 일으킬 수 있다. 더 나아가, PET 측정 방식의 경우, 방사선 조영제 주입, 환자 거동제한, 낮은 영상분해능, 복잡한 고가의 측정기기 사용 등으로 인하여 재택 진단 및 일상적 건강관리 활용 측면에서 불리하다.
다른 진단 방법으로, 체액으로부터 바이오마커를 검출하는 방식이 개발되었다(예를 들면, BioChip J 14, 2-17 (2020)). 구체적으로, 체액 내 알츠하이머 질환의 바이오마커 레벨과 뇌의 병리학적 변화 간에 강한 상관 관계가 존재한다는 연구 결과에 기초하여 바이오마커를 검출함으로써 알츠하이머 환자의 침습적 진단을 최소화하고, 병증 진행을 지속적으로 모니터링할 수 있다. 이와 관련하여, 비용 면에서 효율적이면서 간편한 바이오마커, 특히 아밀로이드베타 단백질(또는 펩타이드)의 검출을 통한 조기 진단이 바람직할 수 있다. 대표적으로, 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)의 추출을 통하여 바이오마커인 아밀로이드베타 단백질을 검출하는 방식이 개발되었다. 그러나, 뇌척수액의 추출 시 침습성으로 인하여 인체의 고통 및 후유증을 유발하는 문제점을 갖고 있다.
반면, 혈액으로부터 바이오마커를 검출하는 방식은 시료의 채취가 용이할 뿐만 아니라, 혈액 내 바이오마커는 풍부한 단백질 종을 제공할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 혈액 내 바이오마커의 검출 방식이 제공하는 유용성에도 불구하고, 혈액 내 바이오마커의 농도는 다른 체액(구체적으로 뇌척수액(CSF)) 내 바이오마커의 농도에 비하여 현저히 낮은 수준이다. 또한, 혈액 시료의 경우, 다양한 종류의 간섭 물질들이 함유되어 있어 신뢰성 높은 바이오마커의 검출이 곤란하다.
따라서, 인체로부터 쉽게 채취할 수 있는 혈액(특히, 혈청)과 같은 시료 내에 미량으로 함유되어 있는 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 단백질을 높은 정확도 및 신뢰도로 간편하게 검출할 수 있고, 더 나아가 별도의 표지(label)를 사용하지 않는 방안이 지속적으로 연구되고 있다.
본 개시 내용에 따른 일 구체예에서는 미량의 시료 내 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40 단백질(aβ40)을 간편하게 검출하기 위한 나노복합체 기반의 센서 또는 검출 플랫폼을 제공하고자 한다.
본 개시 내용에 따른 다른 구체예에서는 나노복합체 기반의 센서 또는 검출 플랫폼을 이용하여 별도의 표지를 사용하지 않고도 시료 내 아밀로이드베타 단백질을 높은 정확도 및 감도로 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 제1 면에 따르면,
전극;
상기 전극 상에 형성된 환원 그래핀 산화물 층;
상기 환원 그래핀 산화물 층 상에 형성된 사이클로덱스트린 층; 및
호스트-게스트 상호작용을 통하여 상기 사이클로덱스트린 층에 고정되며, 액상 시료와 접촉 시, 액상 시료 내에 함유된 아밀로이드베타 1-40 단백질과 특이적으로 바인딩되는 항-아밀로이드베타 1-40 항체;
를 포함하는 아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서로서,
상기 액상 시료 내에 아밀로이드베타 1-40 단백질이 함유된 경우에 항-아밀로이드베타 1-40 항체와의 바인딩에 의한 커패시턴스 변화를 검출하도록 구성된 커패시턴스 센서가 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 전극은 기판 상에 형성될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 전극은 마이크로-디스크 전극일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 마이크로-디스크 전극의 직경은 100 내지 1000 ㎛ 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 호스트-게스트 상호작용에 의하여 β-사이클로덱스트린과 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간에 거대분자 포접 복합체(supermolecular inclusion complex)가 형성될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 사이클로덱스트린 층은 β-사이클로덱스트린 층일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 기판은 실리콘, 석영, 글라스, 세라믹 및 고분자로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 재질일 수 있다.
본 개시 내용의 제2 면에 따르면,
a) 전극을 제공하는 단계;
b) 상기 전극의 표면 상에 환원 그래핀 산화물(RGO) 층을 부착하는 단계;
c) 상기 환원 그래핀 산화물 층에 사이클로덱스트린(CD) 층을 부착하여 CD/RGO 나노복합체를 형성하는 단계; 및
d) 상기 CD/RGO 나노복합체 내 사이클로덱스트린에 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 고정하되, 호스트-게스트 상호작용을 통하여 호스트인 사이클로덱스트린의 내측 캐비티 내로 게스트 분자인 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 도입하는 단계;
를 포함하는 아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서의 제조방법이 제공된다.
본 개시 내용의 제3 면에 따르면,
커패시턴스 센서를 이용한 시료 내 아밀로이드베타 1-40 단백질의 검출 방법으로서,
분석 대상인 액상 시료를 제공하는 단계; 및
상기 액상 시료에 커패시턴스 센서를 접촉시켜 커패시턴스의 변화를 측정하는 단계;
를 포함하고,
상기 커패시턴스 센서는,
전극;
상기 전극 상에 형성된 환원 그래핀 층;
상기 환원 그래핀 층 상에 형성된 사이클로덱스트린 층; 및
호스트-게스트 상호작용을 통하여 상기 사이클로덱스트린 층에 고정되며, 액상 시료와 접촉 시, 액상 시료 내에 함유된 아밀로이드베타 1-40 단백질과 특이적으로 바인딩되는 항-아밀로이드베타 1-40 항체;
를 포함하며,
상기 액상 시료 내에 아밀로이드베타 1-40 단백질이 함유된 경우에 항-아밀로이드베타 1-40 항체와의 바인딩에 의한 커패시턴스 변화가 발생하는 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 액상 시료는 혈청일 수 있다.
본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 아밀로이드베타 1-40(aβ40) 단백질 검출용 커패시턴스 센서는 호스트-게스트 상호작용에 의하여 사이클로덱스트린 및 환원 그래핀 산화물의 나노복합체에 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 고정시켜 시료 내 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40을 검출함으로써 기존의 PET 및 MRI 테크닉을 통하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방식에 비하여 간편하고 경제적이다. 특히, 검출 시료 내에 극미량으로 함유된 아밀로이드베타 1-40에 대하여도 고감도로 검출할 수 있기 때문에, 기존의 뇌척수액 대신에 용이하게 추출할 수 있는 혈액(구체적으로 혈청)을 검출 시료로 사용할 수 있다. 또한, 레독스 프로브를 사용하지 않으면서도 다른 아밀로이드베타 1-40 검출용 센서에 비하여 개선된 검출 한계 및 민감도를 달성할 수 있는 장점을 제공한다. 따라서, 향후 광범위한 활용이 기대된다.
도 1은, 예시적 구체예에 따른 검출 센서에 있어서, (a) β-사이클로덱스트린(CD), 항-아밀로이드베타 1-40(항-aβ40) 항체, 및 β-CD와 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간의 거대분자 포접 복합체(supramolecular inclusion complex)의 형성, 그리고 (b) 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 커패시턴스 센서의 개략적인 구성 및 주파수별 커패시턴스 응답 특성을 개략적으로 보여주는 도면이고;
도 2는, (a) 실시예에서 제작된 ITO 마이크로-디스크 전극 어레이(글라스 기판 상에 8개의 환형 작업 전극(Φ=500 ㎛) 및 공통(common) 상대 전극이 형성됨)의 디지털 사진(β-CD/RGO 부착 후 환형 작업 전극은 검정색으로 표시함), 그리고 (b) ITO 마이크로-디스크 전극(상측) 및 β-CD/RGO로 수식된 ITO 마이크로-디스크 전극(하측) 각각의 현미경 사진이고;
도 3은, (a) β-CD, 및 ITO 전극 표면 상에 개질된 GO, RGO 및 β-CD/RGO 각각의 XRD 패턴, 그리고 (b) ITO 전극 표면 상에 개질된 GO, RGO 및 β-CD/RGO 각각의 라만 스펙트로스코피이고;
도 4는 RGO/ITO의 XRD 스펙트럼이고;
도 5는, (a) GO 및 RGO, 그리고 (b) β-CD 및 β-CD/RGO 각각의 FT-IR 결과를 나타내는 그래프이고;
도 6은, 센서 제작 과정 중 개별 단계(ITO, β-CD/RGO, 항-aβ40, BSA, 및 aβ40)에서의 나이퀴스트 플롯 및 CV 곡선(1 mM K[Fe(CN)6]3-/4-이 함유된, 0.1 M KCl의 PBS 용액 (pH 7.4))이고;
도 7은 베어(bare) ITO 및 ITO 전극 상에 개질된 GO 및 RGO에 대한 CV 곡선 및 나이퀴스트 플롯(1 mM K[Fe(CN)6]3-/4-이 함유된, 0.1 M KCl의 PBS 용액 (pH 7.4))이고;
도 8은, ITO 전극 표면 상에서 수행되는 개질 단계 중 PBS 용액 (pH 7.4) 내 β-CD/RGO, 항-aβ40 및 aβ40 각각에 대한, (a) 임피던스 및 (b) 커패시턴스 측정 결과를 나타내는 그래프이고;
도 9는, PBS 내 상이한 농도(101 내지 105 fg/mL)의 aβ40를 희석하여 센서 상에서 인큐베이션 후, (a) 측정한 커패시턴스 변화(|ΔC|) 및 3 Hz에서 |ΔC|의 플롯, 그리고 혈청 내 상이한 농도(101 내지 105 fg/mL)의 aβ40를 희석하여 센서 상에서 인큐베이션 후, (c) 측정한 커패시턴스의 변화(|ΔC|) 및 (d) 3 Hz에서 |ΔC|의 플롯이고(심볼 및 바는 각각 데이터의 평균 값 및 표준 편차(n=3)를 나타냄); 그리고
도 10은 KD를 결정하기 위하여 피팅된, (a, b) PBS 및 혈청 내 aβ40 농도/커패시턴스 변화(Concaβ40/|ΔC|)의 플롯, 그리고 (c) 선택도 평가를 위하여 상이한 분석 대상을 사용하여 3 Hz에서 관찰된 커패시턴스의 변화(|ΔC|) 및 (d) 센서의 안정성(n=3)을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"센서"는 검출 소자로 불리기도 하며, 물리ㆍ화학량의 변화를 감지하는 디바이스를 의미하는 바, 크게 물리량을 측정하는 물리 센서 및 화학물질 측정을 위한 화학 센서로 구분될 수 있다. 이와 유사하게, "바이오센서"는 특정 바이오 물질의 물리량 또는 화학량을 선택적으로 포착하여 측정 가능한 신호로 변화시키는 디바이스를 의미한다.
"바이오마커"는 알츠하이머 질환을 알츠하이머 질환이 아닌 상태와 구분할 수 있도록 지시하는 물질을 지칭할 수 있다.
"기판(substrate)"은 포괄적으로는 1 또는 2 이상의 부재 또는 부품(예를 들면, 센서, 세포 등)을 지지할 수 있는 고체 표면을 의미할 수 있다. 구체적으로, 그 위에 부착(고정) 또는 코팅(도포) 가능한 표면을 제공하는 구조 또는 구조물을 의미할 수 있으며, 전형적으로 2차원의 표면을 제공할 수 있다.
"그래핀(graphene)"은 sp2 탄소 원자들이 6각형의 하니컴(honeycomb) 격자를 형성하는 형태의 2차원 나노시트(2-D nanosheet) 단일 층의 탄소 구조체를 의미할 수 있다. 즉, 그래핀은 6각형의 격자점 평면에 꽉 들어찬 2차원(평면)의 탄소 원자면 구조를 갖고 있다.
"그래핀 산화물(GO)"은 하기 구조식 1과 같이 산소-함유 기능기(예를 들면, 에폭시 또는 히드록시기)으로 기능화된 그래핀, 구체적으로 단일층 그래파이트 산화물(C-O 공유 결합을 도입함으로써 그래핀으로부터 유도된 2차원 물질)을 의미할 수 있고, 그래핀의 엣지(edge) 부위에는 카르보닐기 및 카르복시기가 존재하여 극성 표면 특성을 나타낼 수 있다.
[구조식 1]
Figure 112022060020477-pat00001
예를 들면, 카르복시기의 존재로 인하여 친수성을 나타내어 물에 용이하게 분산되어 콜로이드 용액을 형성할 수 있다. 그래핀 산화물은 그래핀계 격자 및 다양한 산소-함유 그룹의 존재로 인하여 그래핀 산화물 표면의 작용기는 다양한 활성종을 고정하기 위한 앵커 사이트로 작용할 수 있고, 조절 가능한 전자적 특성을 갖게 된다.
"환원 그래핀 산화물(RGO)"는 그래핀과 유사한 구조를 갖는 물질로서 높은 비표면적, 박막 및 도전성을 나타낼 수 있다. 전형적으로, 그래핀 산화물은 절연 특성을 갖게 되는 바, 시트 저항은 1012 Ω/sq 이상을 나타낸다. 그러나, 그래핀 산화물이 환원될 경우, 시트 저항은 현저히 감소하여 도전체 또는 반도체로 전환될 수 있다.
"나노시트"는 단일 또는 수개의 단일 층 두께를 가질 수 있는 2차원 재료와 유사할 수 있으며, 수백 나노미터에서 수십 마이크로미터의 횡 치수를 가질 수 있다.
"항원"은 특이한 면역 반응을 일으킬 수 있는 임의의 물질(substance)로서, 구체적으로 적어도 하나의 항체에 의하여 인식 가능한 임의의 분자 또는 분자 그룹을 의미할 수 있다. 항원은 적어도 하나의 에피토프(epitope; 항체의 의하여 인식될 수 있는 특정 생화학적 유닛)을 함유한다.
"항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미할 수 있다. 구체적으로, 완전한 다클론(또는 폴리클론) 또는 단클론(모노클론) 항체뿐만 아니라, 이의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일사슬 (ScFv), 다이아바디, 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체, 그의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 요망되는 특이성의 항체 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 임의의 기타 변형 배열을 의미할 수 있다. 항체로는 임의의 범주에 해당되는 항체, 예를 들면 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 서브클래스), 및 특정 클래스에 속하지 않는 항체를 포함할 수 있다.
"바인딩(binding)"은 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.
"고정(immobilization)"은 임의의 물질 또는 생활성제가 기재에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 방식에 의하여 바인딩되는 것을 의미할 수 있다.
"작업 전극"은 특정(관심) 반응이 일어나는 전기화학 시스템 내 전극을 의미할 수 있고, "기준 전극"은 안정적이고 공지된 전극 전위를 갖는 전극을 의미할 수 있다. 또한, "상대 전극"은 전류가 전기화학 시스템을 통과하는 것을 보조하며 작업 전극으로 흐르는 전하와는 상반된 부호의 전하가 흐르는 전극으로서 전형적으로 특정(관심) 반응은 상대 전극에서는 일어나지 않는다.
"시료" 또는 "액상 시료"는 검출하고자 하는 타겟 검체 또는 바이오물질을 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid)일 수 있다. 생물학적 유체는, 예를 들면, 체액(body fluid), 구체적으로는, 혈액(전혈), 혈장, 혈청, 타액, 정액, 소변, 대변, 가래, 뇌척수액, 간질액, 복막액, 눈물, 타액, 양수 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로 혈액, 특히 구체적으로 혈청(serum)일 수 있다. 이때, 시료는 생체 시료 자체뿐만 아니라, 이를 처리한 것도 포함할 수 있는 바, 이러한 처리로서 여과, 증류, 추출, 농축, 희석, 간섭 물질의 비활성화, 시약 첨가 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 명세서에서 수치 범위가 하한값 및/또는 상한값으로 특정된 경우, 해당 수치 범위 내에 임의의 서브 조합도 개시된 것으로 이해될 수 있다. 예를 들면, "1 내지 5"로 기재된 경우, 1, 2, 3, 4 및 5는 물론, 이들 간의 임의의 서브-조합도 포함할 수 있다.
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 적어도 하나의 다른 층(중간층 또는 개재층)이 존재하거나, 또는 추가 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
"접촉한다"는 용어의 경우, 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에 있어서 임의의 구성 요소 또는 부재가 다른 구성 요소 또는 부재와 "연결된다" 또는 "연통된다"고 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 상기 다른 구성 요소 또는 부재와 직접 연결 또는 연통되어 있는 경우뿐만 아니라, 다른 구성 요소 또는 부재의 개재 하에서 연결 또는 연통되어 있는 경우도 포함되는 것으로 이해될 수 있다.
아밀로이드베타 1-40(aβ40) 단백질 검출 센서(검출 플랫폼) 및 이의 제조
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 전극 상에 형성된 나노복합체(nanohybrid)를 기반으로, 시료 내에 존재하는 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40 단백질(aβ40)을 검출할 수 있는 커패시턴스 센서 또는 검출 플랫폼이 제공된다.
일 구체예에 따른 커패시턴스 센서의 경우, 전극 상에 환원 그래핀 산화물 및 사이클로덱스트린(CD)이 순차적으로 형성된 나노복합체에 아밀로이드베타 1-40 단백질과 특이적으로 바인딩되는 항-아밀로이드베타 1-40 항체가 고정된다(예를 들면, 항원-항체 상호작용에 의함). 이와 같이, 항-아밀로이드베타 1-40 항체가 고정된 나노복합체/전극 구조물은 커패시턴스 센서의 작업 전극(working electrode)으로 사용될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 전극은 도전성 재료로 이루어질 수 있다. 일 예로서, 전극 재질은 도전성 금속, 탄소나노튜브(CNT)와 같은 전도성 탄소 소재, 전도성 고분자(예를 들면, PEDOT/PSS, 폴리아닐린, 및 폴리피롤(PPy)) 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 도전성 전극은 인듐-주석-산화물(ITO), 인듐-아연-산화물(IZO), 안티몬주석산화물(ATO), 아연산화물(ZnO), 주석산화물(SnO2), 갈륨-아연-산화물(GZO), 알루미늄-아연-산화물(AZO), 카드뮴-주석-산화물(CTO) 등의 금속 산화물 중에서 적어도 하나가 선택되는 재질일 수 있다. 다른 예시적 구체예에 따르면, 도전성 금속은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 텅스텐(W), 니켈(Ni) 등으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 상기 예시된 종류로 한정되는 것은 아니다.
특정 구체예에 있어서, 전극 재질은 ITO일 수 있는 바, 높은 광투과성 및 전도성으로 인한 광학-전기적 특성 동시 분석능, 낮은 배경전류, 그리고 높은 전기화학적 안정성을 갖는 점에서 유리할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 전극(또는 전극 층)은 기판 상에 형성될 수 있으며, 예를 들면 패턴화(예를 들면, 마스크를 이용한 패턴화) 공정을 통하여 원하는 패턴, 형상 및/또는 치수를 갖도록 형성될 수 있다. 일 예로서, 물리적 증착법(PVD; 예를 들면 스퍼터링, 열 증착(thermal vapor deposition), E-beam 증착 등), 화학적 증착법(CVD; 예를 들면, 플라즈마 화학기상증착(PECVD), 열적 화학기상 증착(thermal CVD)) 등을 적용할 수 있다. 택일적으로, 당업계에서 공지된 다양한 금속 산화물 형성 방법, 예를 들면 수열합성법, 전기화학증착법, 이온빔증착법 등을 채택할 수 있으며, 보다 구체적으로 전기화학증착법을 적용할 수 있다. 전극의 형성 및/또는 패턴화 기술은 당업계에 공지된 만큼, 이에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
예시적 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 형성된 전극 또는 전극 층의 두께는, 예를 들면 약 5 내지 1000 nm, 구체적으로 약 50 내지 600 nm, 보다 구체적으로 약 100 내지 400 nm의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적 취지로 이해될 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 전극은 마이크로전극일 수 있는 바, 소량의 활성 건극 물질로 높은 전류 밀도를 제공할 수 있는 점에서 유리할 수 있다. 특정 구체예에서 마이크로전극은 마이크로-디스크 전극일 수 있다. 마이크로-디스크 전극은 절연체 내 마이크론 수준의 반경을 갖는 디스크 형상의 전극이 매립되면서 노출된 형태의 전극일 수 있다.
한편, 전극이 형성될 수 있는 기판은 절연 및 방수 특성을 갖는 한, 당업계에서 공지된 재질을 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 일 예로서, 기판의 재질은 실리콘(예를 들면, 단결정 실리콘 등), 석영(예를 들면, 단결정 석영, 용융(fused) 또는 비정질 석영 등), 글라스, 세라믹, 고분자(예를 들면, 투명 플라스틱) 등으로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 글라스일 수 있다. 예시적으로, 기판의 두께는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 약 0.5 내지 2 mm, 구체적으로 약 0.7 내지 1.5 mm, 보다 구체적으로 약 0.9 내지 1.1 mm의 범위일 수 있다.
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 전극 또는 전극 층의 형성 후에는 환원 그래핀 산화물(RGO) 층이 전극에 부착될 수 있다. 이와 관련하여, RGO는 사이클로덱스트린을 전극 상에 고정시키는데 효과적인 소재이다. 구체적으로, RGO는 나노시트 구조, 넓은 비표면적, 양호한 전도성, 그리고 환원 프로세스 후에 탄소 골격의 표면 상에 잔류하는 산소 기능기로 인하여, 공유 결합 및 π-π 상호작용을 통하여 후술하는 바와 같이 그 위에 사이클로덱스트린을 고정시킬 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, RGO 층을 형성하기 위하여, 당업계에서 알려진 부착(deposition) 테크닉을 활용할 수 있다. 일 예로서, 전기화학적 부착 테크닉을 이용하여 전극 상에 환원 그래핀 산화물 층을 형성할 수 있는 바, 나노 시트 구조, 넓은 표면적, 및 우수한 전도도로 제공할 수 있고, 항체 결합을 위한 다수의 사이클로덱스트린을 고정화할 수 있는 점에서 유리하다(특히, 한정된 면적에서 보다 많은 항체 결합을 유도할 수 있음). 이와 같이, 전기화학적 테크닉을 통하여 RGO를 부착할 경우, 예를 들면 2전극 시스템 또는 3전극 시스템을 기반으로 할 수 있는 바, 작업 전극은 전술한 바와 같이 형성된 전극(예를 들면, ITO 재질의 마이크로-디스크 전극)일 수 있다.
또한, RGO의 전기화학적 부착 시, 상대 전극(counter electrode)으로서, 예를 들면 백금 전극(백금 필라멘트 전극, 백금 링 전극 등), 금 전극, 은 전극(또는 은 네트 전극) 등과 같은 전도성 금속 재질 또는 이의 조합(백금/금 전극)으로 이루어진 전극; 전도성 입자가 코팅된 유리, 석영, 플라스틱 필름, 마이카 및 알루미늄 판; 티타늄 전극; 은/수은 필름 전극 등을 사용할 수 있다. 또한, 3전극 시스템을 사용할 경우, 기준 전극은 통상적으로 사용되는 Hg2SO4, Ag/AgCl, Ag/Ag+, Hg/Hg2SO4, RE-6H, Hg/HgO, KCl 포화된 칼로멜 반전지(SCE), 염다리 백금 필라멘트 기준 전극 등일 수 있다.
또한, RGO를 전기화학적으로 부착하기 위하여, 순환 전압 전위법(cyclic voltammetry) 또는 전류법(amperometry)을 적용할 수 있는 바, 이러한 방식 각각의 기본적 원리는 당업계에 알려져 있다. 일 예로서, 전자의 경우에는 사이클이 증가할수록 RGO 층의 두께가 증가하는 한편, 후자의 경우에는 시간이 증가할수록 RGO 층의 두께가 증가할 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 전류법, 구체적으로 시간대 전류법(chronoamperometry)을 이용할 수 있다. 이때, 그래핀 산화물(GO)의 용액(구체적으로, 수용액)을 제조하여 사용할 수 있는 바, GO 용액의 농도는, 예를 들면 약 0.1 내지 10 ㎎/mL, 구체적으로 약 0.4 내지 5 ㎎/mL, 보다 구체적으로 약 0.8 내지 2 ㎎/mL의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이는 예시적 취지로 이해될 수 있다. 또한, 전기화학적 반응을 통하여 인가되는 전압은, 예를 들면 약 -2 내지 -0.5 V, 구체적으로 약 -1.7 내지 -0.9 V, 보다 구체적으로 약 -1.5 내지 -1.3 V 범위에서 선택될 수 있다. 또한, 부착 시간은, GO 용액의 농도 및 전극 구조를 고려하여 조절될 수 있는 바, 예를 들면 약 10 내지 60 초, 구체적으로 약 20 내지 55 초, 보다 구체적으로 약 25 내지 40 초의 범위일 수 있다.
상술한 절차를 통하여 형성된 RGO 층의 두께는, 예를 들면 약 1 내지 3 nm, 구체적으로 약 1.3 내지 2.5 nm, 보다 구체적으로 약 1.5 내지 2 nm의 범위일 수 있다. 또한, 형성된 RGO 층의 비표면적(BET)은, 예를 들면 약 50 내지 150 ㎡/g, 구체적으로 약 65 내지 135 ㎡/g, 보다 구체적으로 약 80 내지 110 ㎡/g의 범위일 수 있다. 이외에도, RGO 층은 카본나노튜브(CNT) 보다 높은 전도도 및 산화환원 전류 전달능을 나타낼 수 있다.
한편, 일 구체예에 따르면, 전극 상에 환원 그래핀 산화물 층이 형성된 후에는 사이클로덱스트린(CD) 층이 형성된다.
사이클로덱스트린(CD)은 물에서 안정한 비독성 당 고분자, 구체적으로 복수의 글루코오스 서브유닛을 포함하는 사이클릭 올리고사카라이드로서, 크게 알파-사이클로덱스트린(α-CD), 베타사이클로덱스트린(β-CD) 및 감마-사이클로덱스트린(γ-CD)으로 구분되는 바, 이들 각각은 6개, 7개 및 8개의 글루코오스 서브유닛를 갖고 있다. 사이클로덱스트린은 통상적으로 결정성이 높고, 수분을 흡수하지 않는 성상을 갖고 있다.
특히, 사이클로덱스트린은 친수성의 외측 표면과 소수의 내측 캐비티(동공)를 갖는 환상면체(toroidal) 형상을 갖는 바, 소수성의 캐비티는 작은 크기의 유기 분자를 부분적으로 또는 완전히 캡슐화하는 성상을 갖고 있다. 이처럼, 사이클로덱스트린은 특유의 컵 형상의 구조를 갖고 있어 일정한 분자량 범위(약 300 이하)의 분자들을 컵 내부에 포획할 수 있는 가능성을 갖는다. 이처럼, 외부로부터의 분자(게스트)가 컵 구조 내부에 도입되어 형성되는 복합체를 호스트-게스트 복합체로 지칭할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 사이클로덱스트린으로서 하기 화학식 1로 표시되는 β-CD가 사용될 수 있는 바, 도넛 형태의 내측은 소수성, 외측은 친수성을 띄어 항체 분자를 선택적으로 사이클로덱스트론 동공에 위치시켜 안정적인 거대분자(또는 초분자) 호스트-게스트 포접 복합체 형성이 가능한 점에서 유리할 수 있다.
[화학식 1]
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예시적으로, β-CD는 일반적으로 전분 소스로부터 효소적으로 제조할 수 있는 바, 이때 사용되는 효소는, 예를 들면 알파-아밀로스와 함께 사이클로덱스트린 글리코실트란스퍼라아제(glycosyltransferase)가 사용 가능하다. 특히, β-CD의 캐비티 직경은 약 6 내지 6.4 Å, 외측 직경은 약 15.4 Å, 그리고 높이는 약 7.8 Å이다.
예시적 구체예에 따르면, RGO 층 상에 사이클로덱스트린이 형성됨으로써 나노복합체(즉, CD/RGO nanohybrid)를 형성하는 바, 이러한 나노복합체는 큰 비표면적 및 균일한 필름을 형성함으로써 베이스 용액 및 베어 전극 사이의 전자 전달을 촉진시킬 수 있다. 또한, CD/RGO(구체적으로, β-CD/RGO) 나노복합체는 사이클로덱스트린의 내측 캐비티가 갖는 호스트 특성 구조로 인하여 게스트 분자에 대한 높은 거대분자 인식(supramolecular recognition) 특성을 나타낼 수 있다. 즉, 사이클로덱스트린은 호스트(host)로 기능하여 게스트(guest) 분자와 호스트-게스트 상호작용을 통하여 게스트 분자를 내측 캐비티 내로 도입하거나 고정시킬 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 사이클로덱스트린은 당업계에 공지된 테크닉을 이용하여 환원 그래핀 산화물(RGO) 상에 부착될 수 있는 바, 예를 들면 전기화학적 부착, 화학적 부착 등을 예시할 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 사이클로덱스트린을 전기화학적으로 환원 그래핀 산화물 층 상에 부착할 수 있는 바, 예를 들면 순환전압 전위법(cyclic voltammetry)을 적용할 수 있다. 이와 관련하여, 3전극 시스템을 이용하여 사이클로덱스트린을 부착할 수 있는 바, 이때 작업 전극은 RGO 층이 형성된 전극일 수 있으며, 기준 전극 및 상대 전극 각각은 앞서 기술된 바와 같다.
이때, 사이클로덱스트린은 부착 과정에 용액 형태로 제공될 수 있는 바, 이때 액상 매질로, 예를 들면 PBS(phosphate-buffered solution), 탈이온수 등으로부터 적어도 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 용액의 pH는, 예를 들면 약 6 내지 9, 구체적으로 약 7 내지 8의 범위에서 조절될 수 있다. 또한, 사이클로덱스트린의 농도는, 예를 들면 약 0.005 내지 0.025 M, 구체적으로 약 0.008 내지 0.02 M, 보다 구체적으로 약 0.01 내지 0.015 M의 범위에서 조절 가능하다. 다만, 이는 예시적 취지로 이해될 수 있다.
한편, 순환전압 전위법을 적용할 경우, 인가되는 전압은, 예를 들면 약 -1.5 내지 1.5 V, 구체적으로 약 -1.2 내지 1.2 V, 보다 구체적으로 약 -1 내지 1 V 범위에서 정하여질 수 있다. 또한, 순환전압 전위법에서 전압을 인가할 경우, 주사속도는, 예를 들면 약 5 내지 500 mV/s, 구체적으로 약 10 내지 300 mV/s, 보다 구체적으로 약 30 내지 100 mV/s의 범위에서 적절히 조절할 수 있는 바, 산화-환원반응에서 산화 피크 및 환원 피크를 통하여 분극 현상 및 전기 전도 저항을 관찰할 수 있고, 사이클로덱스트린 층이 형성되는지 확인할 수 있다. 이외에도, 사이클로덱스트린의 로딩 량의 경우, 사이클 회수에 따라 조절 가능한 바, 예시적으로 사이클 회수는, 예를 들면 약 2 내지 50 사이클, 구체적으로 약 3 내지 20 사이클, 보다 구체적으로 약 4 내지 10 사이클의 범위에서 정하여질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, CD/RGO 나노복합체에 있어서, RGO(또는 RGO 층)의 중량 기준으로, CD(또는 CD 층)의 함량은, 예를 들면 약 3 내지 12 중량% 구체적으로 약 5 내지 10 중량% 보다 구체적으로 약 7 내지 9 중량%의 범위에서 정하여질 수 있는 바, CD 층과 RGO 층 간의 균형잡힌 비율을 설정할 경우, 항체 고정화를 극대화함으로써 센서 제작 효율을 높일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 일 구체예에 따르면, CD/RGO 나노복합체를 기반으로 하고, 호스트-게스트 상호작용을 통하여 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 고정할 수 있다. 이때, CG/RGO 나노복합체는 거대분자 호스트-게스트 포접 복합체(supramolecular host-guest inclusion complex)를 형성하는 방식으로 다량의 항체를 고정할 수 있는 캐리어로서 기능할 수 있다.
이와 관련하여, 예시적 구체예에 따른 검출 플랫폼에 있어서, β-사이클로덱스트린(CD), 항-아밀로이드베타 1-40(항-aβ40) 항체, 및 β-CD와 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간의 거대분자 포접 복합체의 분자 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.
상기 도면을 참조하면, 게스트 분자인 항-aβ40 항체가 호스트인 CD/RGO 나노복합체 중 β-CD의 내측 캐비티로 침투하게 되는 바, 이때 정전기적 포접 상호작용, 수소 결합 등이 작용하게 되며, 그 결과 거대분자 호스트-게스트 포접 복합체를 형성하게 된다.
예시적 구체예에 따르면, 항-aβ40 항체를 CD/RGO 나노복합체에 고정 또는 도입하기 위하여, 예를 들면 항체 및 나노복합체를 인큐베이션시킬 수 있다. 이때, 항체의 농도는, 예를 들면 약 10 내지 100 μg/mL, 구체적으로 약 30 내지 70 μg/mL, 보다 구체적으로 약 40 내지 60 μg/mL의 범위에서 정하여질 수 있다. 또한, 인큐베이션 온도는, 예를 들면 약 1 내지 7 ℃, 구체적으로 약 2 내지 6 ℃, 보다 구체적으로 약 3 내지 5 ℃의 범위에서 조절될 수 있다. 인큐베이션 온도는 단백질 변성에 영향을 미칠 수 있으므로, 전술한 범위 내에서 조절하는 것이 유리할 수 있다. 한편, 인큐베이션 시간은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 약 0.1 내지 5 시간, 구체적으로 약 0.5 내지 3 시간, 보다 구체적으로 약 0.8 내지 2 시간의 범위에서 조절될 수 있다.
이처럼, 항-aβ40 항체가 CD/RGO 나노복합체에 고정될 경우, CD와 항-aβ40 항체 간의 거대분자 포접 복합체가 형성됨으로써 전극/용액 계면에서의 전자 전달을 억제하게 된다.
커패시턴스 센서 또는 검출 플랫폼을 이용한 시료 내 아밀로이드베타 1-40(aβ40) 단백질의 검출(진단)
본 개시 내용의 일 구체예에 따르면, 전술한 바와 같이 항-aβ40 항체가 고정된 사이클로덱스트린(CD)/환원 그래핀 산화물(RGO)/전극을 구비하는 커패시턴스 센서를 이용하여 시료 내 알츠하이머 질환의 바이오마커인 아밀로이드베타 1-40 단백질을 정성적 및/또는 정량적으로 검출(또는 진단)하는 방법이 제공된다.
이와 관련하여, 예시적 구체예에 따른 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 커패시턴스 센서의 개략적인 구성, 그리고 주파수별 커패시턴스 응답 특성을 도 1b에 개략적으로 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, 시료(구체적으로, 액상 시료) 내에 아밀로이드베타 1-40 단백질(aβ40)이 함유될 경우, 항체와 항원 간 특이적 상호작용을 통하여 항원인 aβ40이 사이클로덱스트린의 내측 캐비티에 침투된 항체(항-aβ40 항체)와 바인딩된다. 이와 같이, 항원과 항체가 바인딩됨에 따른 커패시턴스의 변화를 측정(분석)함으로써 시료 내 aβ40를 검출할 수 있다.
예시적 구체예에 있어서, 시료는 액상 시료로서, 예를 들면 체액, 구체적으로 혈액, 보다 구체적으로 혈청(human serum)일 수 있다. 이때, CD/RGO 나노복합체 및 항-aβ40 항체 간의 복합체가 형성된 후에는 외부 성분 등에 의하여 오염되는 등의 현상을 억제할 목적으로, 선택적으로(optionally) BSA, 브로커 카제인(blocker casein) 등에 의하여 블로킹 처리할 수 있다.
또한, 예시적 구체예에 따르면, 커패시턴스 센서는 항-aβ40 항체가 고정된 사이클로덱스트린(CD)/환원 그래핀 산화물(RGO)/전극을 작업 전극으로 하고, 상대 전극(2전극 시스템), 또는 상대 전극 및 기준 전극(3전극 시스템)이 구비될 수 있다. 이때, 전극 각각은 도전성의 컨택부 또는 패드를 통하여 회로와 연결됨으로써 전기적 신호를 전달할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 커패시턴스 센서를 이용하여 시료 내 aβ40를 정성적/정량적으로 검출할 수 있다. 예를 들면, 커패시턴스의 변화 대 aβ40 농도 간의 상관 관계에 따라 시료 내 미지의 aβ40 농도를 구할 수 있다. 이때, 본 구체예에 따른 검출 센서를 사용할 경우, 레독스 프로브(또는 레독스 쌍), 예를 들면 K[Fe(CN)6]3-/4-의 부존재 하에서도 개선된 감도 특성을 달성할 수 있다는 점은 주목할 만하다.
이와 관련하여, 본 구체예에 따른 검출 센서의 혈청에서의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 100 fg/mL 이하, 구체적으로 약 10 fg/mL 이하, 보다 구체적으로 약 1 fg/mL 이하의 낮은 수준일 수 있는 바, 이는 기존의 다른 센서 및 뇌척수액 추출 방식에서의 바이오마커(aβ40) 측정 시 보고된 결과에 비하여 현저히 낮은 수준이다. 또한, 본 구체예에 따른 센서의 혈청에서의 LRD(linear range of detection)는, 예를 들면 약 1 내지 106 fg/mL, 구체적으로 약 5 내지 105 fg/mL, 보다 구체적으로 약 10 내지 5×104 fg/mL의 범위일 수 있다.
더 나아가, 본 구체예에 따른 검출 플랫폼의 경우, 높은 aβ40 항원-항체 바인딩(결합력)으로 인하여 낮은 해리 상수(KD)를 나타낼 수 있는 바, 예를 들면 혈청 내에서 약 10-5 nM 이하, 구체적으로 약 10-6 nM 이하, 보다 구체적으로 약 3×10-7 nM 이하일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다.
물질
- GO(초고농도 수용액)은 Graphene-Supermarket (USA)로부터 구입하였다.
- β-사이클로덱스트린(파우더, ≥97%), K[Fe(CN)6]3-/4-, 염화칼륨(KCl, 결정), BSA(bovine serum albumin), 및 FDA-승인 혈청(human serum; (USA origin; sterile-filtered)은 각각 Sigma-Aldrich사(South Korea)로부터 구입하였다.
- PBS (pH 7.4)는 Tech and Innovation (South Korea)로부터 구입하였다.
- 탈이온수(18.2 MΩ cm)는 Milli-Q system (South Korea)으로부터 구입하였다.
- 재조합 인체 베타 아밀로이드 1-40 단백질(aβ40; ab82797) 및 재조합 항-베타 아밀로이드 1-40 항체 EP1876Y (anti-aβ40)는 Abcam (South Korea)로부터 공급받았다.
장치
- 고해상도 X-선 회절 분석(XRD, Rigaku, SmartLab, Japan)은 40 kV 및 Cu Kα (1.54 Å)에서 수행되었다.
- 라만 스펙트로스코피(UniNano Tech/UniD2G, South Korea), 및 FT-IR(Fourier-transform infrared) 스펙트로스코피(Jasco-4600 FTIR, USA)를 이용하여 물질 및 나노복합체의 구조를 분석하고 확인하였다.
- 3-전극 시스템(작업 전극: ITO 마이크로-디스크 전극, 기준 전극: Ag/AgCl, 및 상대 전극: ITO 패턴화된 층이 구비됨)을 이용한 순환전압 전위법(cyclic voltammetry) 및 전기화학적 임피던스 스펙트로스코피(EIS; EC-Lab, Bio-Logic, sp-200, France)를 통하여 개별 단계에서 센서의 전기화학적 성능을 평가하였다(0.1 M KCl/PBS(pH 7.4)에 1 mM의 K[Fe(CN)6]3-/4-가 함유된 용액의 존재 하에서 수행됨).
PBS 및 HS 내 aβ40의 커패시턴스 검출
ITO 마이크로-디스크 전극이 구비된 2-전극 시스템 내에서 전기화학적 임피던스 스펙트로스코피를 이용하고 K[Fe(CN)6]3-/4-의 부존재 하에서 PBS 및 인체 혈청(HS) 내 센서의 임피던스 및 커패시턴스를 측정하였다. EIS 데이터는 1 Hz에서 1MHz의 주파수 대역에서 50 mV의 sinus amplitude로 세팅하여 얻었다.
PBS 및 HS 내 aβ40를 상이한 농도(101 내지 105 fg/mL)로 용해시킨 용액을 사용하여 상온에서 20분 동안 항-aβ40/β-CD/RGO 센서를 인큐베이션시킨 다음, EIS 측정을 수행하였다. HS 내에서 aβ40에 대한 EIS 검출을 개시하기에 앞서, 순수 HS를 1 × PBS (pH 7.4)과 1 : 100의 비율로 희석시켜 측정 과정 중 매트릭스 영향을 제거하였다. HS 내(1 : 100) 내에서 다양한 농도(101 내지 105 fg/mL)의 aβ40 용액을 제조하여 EIS 측정에 적용하였다.
ITO 마이크로-디스크 전극 어레이의 제조
포토리소그래피 테크닉을 이용하여 글라스 표면(7.5 × 2.5 cm) 상에 (ITO 마이크로-디스크 전극 어레이를 제작하였는 바, 8개의 작업(검출) 디스크 전극(Ø = 500 ㎛) 및 하나의 공유 상대 전극을 형성하였다. 이러한 설계를 통하여 aβ40을 검출하기 위한 임피던스 측정용 2-전극 시스템을 구성하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 제작된 ITO 마이크로-디스크 전극 어레이를 폴리스티렌 재질의 8-웰(well) 챔버에 부착시켰다(8개의 반응 챔버).
항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 마이크로-디스크 전극 센서의 제조
ITO 마이크로-디스크 전극 어레이를 100% 에탄올 및 탈이온수로 세척하고 질소 가스 블로잉에 의하여 건조시켰다. RGO의 전기화학적 부착을 위하여, 검출 영역 챔버 내 ITO 마이크로-디스크 전극 어레이 상에 300 μL GO 용액 (1 mg/mL, DI water)을 공급하였다. 3-전극 시스템을 이용하고, 시간대 전류법에 의하여 인가 전압(-1.4 V)에서 30초 동안 RGO의 전기화학적 부착을 수행하였다. 이때, 작업 전극으로서 ITO 마이크로-디스크 전극, 기준 전극으로 Ag/AgCl, 그리고 상대 전극으로 Pt 코일을 사용하였다.
RGO 층 상에 β-CD를 전기적으로 부착하기 위하여, PBS (pH 7.4)에 β-CD를 용해시킨 용액(0.01 M)을 제조하였다. 전위 대역 -1 내지 1 V 및 주사 속도 50 mV/s에서 4회의 부착 사이클로 순환전압 전위법을 수행하였다. 후속적으로, ITO 전극 상에 형성된 β-CD/RGO 나노복합체(β-CD/RGO/ITO)를 항-aβ40 항체(50 μg/mL)를 이용하여 습한 챔버 내에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 결과, 항-aβ40 항체는 β-CD/RGO 나노복합체에 고정되었는 바, 호스트(β-CD/RGO) 및 게스트(항-aβ40 항체) 간에 거대분자 포접 복합체를 형성시켜 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서를 제조하였다.
전극 표면 상에 임의의 비특이적 흡착을 블로킹할 목적으로 BSA (0.5% in 1x PBS, pH 7.4)를 가하였다. 앞서 제조된 센서를 이용한 전기화학적 임피던스 검출을 위하여, PBS 및 인체 혈청(HS) 내에 다양한 농도의 aβ40 단백질을 용해시킨 용액을 제조하였다.
결과 및 토의
- ITO 마이크로-디스크 전극 상에 형성된 β-CD/RGO 나노복합체의 구조 특성
β-CD, 및 ITO 전극 표면 상에 개질된 GO, RGO 및 β-CD/RGO 각각의 XRD 패턴을 도 3a에 나타내었고, RGO/ITO의 XRD 스펙트럼을 도 4에 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, GO 시트에 대한 탄소 (001)의 XRD 특성 피크는 10° 근처에서 나타났는 바, 이는 8 Å의 d-spacing에 해당된다. RGO 및 β-CD/RGO 내에서 GO의 특성 피크는 사라지고, 새로운 넓은 피크가 25° 근처에서 나타났는 바, 이는 그래핀의 층간 거리(interlayer distance; 4 Å)에 대응한다. 상술한 결과는 전기화학적 환원 프로세스 과정에서 GO 내 상당량의 산소 기능기가 제거되었기 때문으로 볼 수 있다.
ITO 전극 상에 형성된 β-CD/RGO의 XRD 결과(도 3a)에 따르면, RGO의 특성 피크, β-CD의 다결정성 구조의 다중 피크, 및 결정성 ITO의 전형적인 피크가 관찰되었는데, 이는 ITO 전극 표면 상에 RGO 및 β-CD/RGO가 전기화학적으로 부착되었음을 의미한다.
한편, 라만 스펙트로스코피는 탄소 물질의 구조 및 품질의 특성을 분석하고, 특히 결함(defects) 및 규칙적(ordered) 구조와 불규칙적(disordered) 구조의 비를 정하는데 사용되는 비파괴적 분석 수단이다. 도 3b는 GO, RGO, 및 β-CD/RGO의 라만 스펙트럼을 나타내는 바, 약 1335 cm-1 및 약 1575 cm-1에서 2개의 현저한 피크가 관찰되었고, 이는 명확한 D 및 G 밴드에 각각 대응한다. 이와 관련하여, G 밴드는 그래핀의 6방형(hexagonal) 구조 내부의 sp2 탄소 네트워크로부터 기인한 것이고, D 밴드는 상이한 탄소 구조체의 sp2 네트워크에서의 결함 또는 불규칙성(무질서)의 존재 하에서 관찰된다. 따라서, 강도(intensity)는 시료 내 불규칙성의 정도에 비례한다. 이처럼, 불규칙성에 의하여 유도된 D 밴드와 G 밴드의 sp2 탄소 네트워크의 강도 간의 비(ID/IG)는 불규칙성을 정량화하는데 사용 가능한 파라미터에 해당된다. ID/IG 강도 비가 1.00에서 1.12로 증가하였는 바, 이는 GO 환원 시 평균 사이즈의 감소 및 sp2 도메인 수의 증가를 시사한다. 이러한 관찰 결과는 산소 기가 제거됨을 의미하는 바, GO가 성공적으로 환원되었음을 뒷받침한다. β-CD/RGO의 비는 1.15로 증가하였는 바, 이는 그래파이트화된 구조 내에 보다 많은 결함 및 불규칙성이 존재함을 시사한다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, RGO 및 β-CD/RGO의 피크는 GO의 피크에 대하여 블루 시프트를 나타내었다. β-CD/RGO는 RGO에 비하여 많은 블루 시프트를 나타내었는 바, 이는 β-CD에 의하여 보다 많은 결함이 RGO로 도입되었음을 지시하고, ITO 전극 표면 상에 β-CD/RGO 나노복합체가 형성되었음을 뒷받침한다.
도 5에 GO, RGO, β-CD/RGO 및 β-CD의 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다.
상기 도면을 참조하면, GO는 3500-3700 cm-1에서 넓은 히드록시 피크, 2930 cm-1 및 2850 cm-1 근처에서의 GO의 비대칭 및 대칭 CH2 스트레칭, 그리고 카르복시기의 C=O 스트레칭에 상당하는 1720 cm-1 근처에서의 피크를 나타내었다. RGO는 GO와 유사한 피크, 및 그래파이트 영역의 C=C 스트레칭로부터 1619 cm-1 근처에서의 피크를 나타내었다. β-CD는 2925 cm-1, 1159 cm-1, 및 1027 cm-1에서 CH2 스트레칭, C-O-C 스트레칭 및 O-H 벤딩 진동의 전형적인 피크를 각각 나타내었다. 최종 β-CD/RGO 나노복합체는 RGO 및 β-CD로부터 기인하는 특성 피크를 나타내었으며, 이는 β-CD/RGO 나노복합체가 성공적으로 형성되었음을 지시한다.
- 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서의 전기화학적 성능 평가
ITO 전극 표면 상에 물질의 부착은 표면 인터페이스를 분석하기 위하여 EIS를 이용하였고, 나이퀴스트 플롯을 통하여 1 Hz에서 1 MHz의 주파수 영역에 걸쳐 1 mM K[Fe(CN)6]3-/4-함유 0.1 M KCl의 PBS(pH 7.4) 용액의 존재 하에서 센서 표면에 대한 임의의 변화를 검출하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, β-CD/RGO, 항-aβ40, BSA, 및 aβ40으로 ITO 전극을 개질하는 각각의 단계에서의 나이퀴스트 플롯의 반원 직경(semicircle diameter)은 계면 전하-전달 저항(Rct)과 동일하였다. 또한, EIS 데이터는 EIS 파라미터 Cdl (double-layer capacitance for the electrode-solution interface), Rct(charge-transfer resistance), Rs (solution resistance), 및 Zw (Warburg diffusion impedance)를 포함하는 REC(Randle's equivalent circuit) 모델(도 6a의 삽입 도면 참조)에 피팅하였다.
베어 ITO 전극은 보다 큰 반원을 나타내었는 바, 이는 ITO 표면으로 향하는 레독스 프로브 K[Fe(CN)6]3-/4-의 전달 지연으로 인한 큰 Rct (115.4 ㏀)를 지시한다. ITO 전극 상에서 GO가 RGO로 전이되는 것은 도 7의 CV 곡선 및 나이퀴스트 플롯에 의하여 확인되었다. 또한, GO의 낮은 CV 전류 세기 및 큰 반원과 대비하면, RGO는 환원 프로세스 후, CV에서 전류 세기 증가 및 나이퀴스트 플롯에서 반원의 감소를 나타내었다(GO의 낮은 전기화학적 전도도 때문임). 이러한 결과는 ITO 전극 표면 상에서 GO가 성공적으로 RGO로 전이되었음을 뒷받침한다.
ITO 전극 표면 상에 β-CD/RGO를 전기증착한 후(도 6a 참조), Rct 값은 RGO의 높은 sp2 구조 및 높은 전도도로 인하여 10.8 ㏀까지 감소하였다. 이러한 결과는 나노복합체 내 RGO의 존재로 인하여 β-CD/RGO의 전기화학적 전도도가 증가하였음을 지시하며, 또한 베어 ITO 전극에서와 비교하면, CV에서 전류 세기의 증가에 대응된다(도 6b 참조).
항-aβ40 항체는 게스트 분자로 기능하는 바, 정전기적 포접 상호작용(electrostatic inclusion interaction) 및 수소 결합을 통하여 β-CD/RGO 나노복합체 내 호스트 β-CD 분자의 내측 캐비티로 침투하여, 거대분자 호스트-게스트 포접 복합체를 형성한다(도 1a 참조).
이처럼, β-CD/RGO 상에 항-aβ40 항체가 고정된 후, 나이퀴스트 플롯(도 6a)에서 Rct 값은 21.8 ㏀까지 증가하였고, CV 곡선(도 6b)에서 전류 세기는 감소하였다. 이는 β-CD와 항-aβ40 항체 간에 거대분자 포접 복합체가 형성되어 전극/용액 계면에서 전자 전달을 방해하였기 때문으로 볼 수 있다.
상술한 결과를 종합하면, ITO 마이크로-디스크 전극 상에 고정된 β-CD/RGO 나노복합체에 항-aβ40 항체가 성공적으로 형성되었고(항-aβ40/β-CD/RGO/ITO), 이는 항-aβ40 항체와 aβ40 단백질 간의 특이적 바인딩을 통하여 aβ40 단백질을 인식할 수 있음이 확인되었다.
한편, 비특이적 블로킹제인 BSA가 센서 표면 상에 흡착된 후에는 Rct 값이 34.1 ㏀으로 증가하였다(전극 표면에 특정 물질이 흡수되었기 때문임). 이처럼, 표면 저항의 증가는 BSA 처리 단계에서는 CV의 감소에 대응된다(도 6b 참조).
또한, aβ40를 첨가할 경우, 레독스 쌍 K[Fe(CN)6]3-/4-과 전극 표면 사이의 전자 전달이 억제됨에 따라 Rct 값은 53.8 ㏀까지 증가하였다. CV 결과는 aβ40 첨가에 따른 전류 세기의 감소를 나타내며(도 6b 참조), 이는 EIS의 Rct 값의 변화에 부합되었다. 모든 EIS 및 CV 결과를 통하여, aβ40의 검출을 위한 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서가 성공적으로 제작되었음을 확인하였다.
- 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서를 이용하여 PBS 및 혈청(HS) 내 aβ40의 검출
K[Fe(CN)6]3-/4- 레독스 쌍의 부존재 하에서 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서를 PBS 내 aβ40의 커패시턴스 측정에 적용하였다. 낮은 주파수 영역에서 전극의 계면 커패시턴스(전극/용액 계면에서의 유전층) 변화를 aβ40의 검출용 파라미터로 사용하였다.
이와 관련하여, 도 8은 ITO 전극 및 개질된 ITO 전극의 임피턴스 크기(|Z|) 및 대응되는 커패시턴스(C)를 나타낸다. 도 8a의 삽입 도면에 나타낸 바와 같이, 저-주파수 영역(1-103 Hz)에서 전극의 임피던스는 β-CD/RGO, 항-aβ40, 및 aβ40 부착 후에 증가하였다. 반면, 반응성 커패시턴스는 동일한 저-주파수 영역에서 감소하였다(도 8b의 삽입 도면 참조). 이때, 커패시턴스는 하기 수학식 1과 같이 표시된다.
[수학식 1]
C = 1/(2πf × Z)
상기 식에서, C는 커패시턴스, f는 주파수(Hz), 그리고 Z는 임피던스이다.
β-CD/RGO, 항-aβ40, 및 aβ40 부착 후, 전극의 커패시턴스 감소는 전극/용액 계면에서 일련의 유전층의 형성과 관련되어 있다(도 8b의 삽입 도면 참조). 전극/용액 계면에서 센서의 커패시턴스는 많은 커패시터가 직렬로 연결되어 있는 것으로 볼 수 있다. 제1 커패시터는 ITO 전극 표면 상의 개질된 β-CD/RGO 층(Cβ-CD/RG)을 포함한다. 제2 커패시턴스는 항-aβ40 층(Canti-aβ40), 그리고 제3 커패시턴스는 aβ40(Caβ40)을 포함한다.
β-CD/RGO, 항-aβ40, 및 aβ40의 고정 후, 센서의 총 커패시턴스는 하기 수학식 2로 표시된다.
[수학식 2]
1/Ctotal = 1/Cβ-CD/RGO + 1/Canti-aβ40 + 1/Caβ40
β-CD/RGO, 항-aβ40, 및 aβ40의 순차 부착 후 전극의 커패시턴스 감소는 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서에 의한 aβ40의 커패시턴스 검출이 구현됨을 지시한다.
PBS 내 101 내지 105 fg mL-1의 aβ40 농도 범위에서 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서를 사용하여 aβ40의 커패시턴스 검출을 수행하였다. 얻어진 응답은 도 9a에 도시된 바와 같이 상이한 aβ40 농도에서 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서의 커패시턴스 변화(|ΔC|)를 통하여 평가하였다. 커패시턴스 변화(|ΔC|)는 하기 수학식 3에 따른 커패시턴스의 정량화에 의하여 산출하였다.
[수학식 3]
|ΔC| = |(Caβ40 in PBS-C0)/C0|
상기 식에서, C0은 항-aβ40 항체의 부착에 따른 센서의 커패시턴스이고, Caβ40 in PBS는 aβ40(101 내지 105 fg mL-1)의 인큐베이션에 따른 센서의 커패시턴스이다.
도 9a에서 결정된 |ΔC| 대 주파수(1 내지 103 Hz)는 aβ40 농도가 증가함에 따라 |ΔC|가 증가함을 나타내는 바, 이는 |ΔC|가 aβ40의 정량적 검출을 위한 파라미터로 사용될 수 있음을 뒷받침한다. 3 Hz의 주파수에서 얻어진 |ΔC| 값을 PBS 내 aβ40의 농도(Caβ40 in PBS)에 대하여 플로팅하여 aβ40 검출을 위한 보정 곡선(calibration curve)을 구하였다(도 9b 참조). 보정 곡선은 101 내지 105 fg mL-1의 선형 검출 영역에서 선형 회귀식(y=0.16+0.029x; R2=0.99)을 따랐다. 검출 한계는 PBS 내 aβ40에 대하여 0.31 fg mL-1이었다. LOD는 (3S/b)에 의하여 결정되었는 바, 이때 S는 절편(intercept)의 표준 편차이고, b는 선형 범위의 기울기이다.
항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서는 임상 적용 가능성을 검토하기 위하여 인체 혈청(HS) 내 aβ40의 커패시턴스 검출에 적용하였다. 혈청 내 작은 단백질로부터 야기되는 매트릭스 효과(EIS 측정 과정에서 신호 응답 및 감도를 낮춤)를 제거하기 위하여, 순수 혈청을 1x PBS 내에서 1 : 100의 비율로 희석시켰다. HS 내 다양한 농도의 aβ40 (101 내지 105 fg mL-1)를 준비하였고, 커패시턴스 측정에 적용하였다.
도 9c에 나타낸 바와 같이, HS 내 aβ40의 농도가 증가함에 따라 |ΔC| 값은 증가하였는 바, 이는 센서가 HS 내 aβ40에 대한 검출능을 갖고 있음을 뒷받침한다.
도 9d는 3 Hz의 주파수에서 얻어진 |ΔC| 값 대 HS 내 aβ40의 농도로부터 얻어진 보정 곡선을 나타낸다. 상기 도면으로부터, 선형 회귀식(y=0.07+0.013x; R2=0.97)이 유도되었고; LOD는 0.69 fg mL-1이었으며, 그리고 LRD는 101 내지 5×104 fg mL-1 범위이었다.
상술한 결과로부터, 본 실시예에 따라 제작된 센서가 aβ40의 초감도 커패시턴스 검출을 가능케 하고, 이러한 센서를 임상에 적용 가능함을 알 수 있다.
- 센서의 항-aβ40 항체-aβ40 단백질 간 상호작용의 바인딩 친화도 및 해리상수, 선택도 및 안정성
해리 상수(KD) 파라미터를 사용하여 바인딩 친화도(항체와 항원 간 바인딩 상호작용의 세기)를 평가하였다. 해리 상수가 작을 경우, 항원에 대한 항체의 바인딩 친화도가 큰 반면, 해리 상수가 클 경우에는 항원에 대한 항체의 바인딩 친화도가 약해짐을 의미한다. 본 실시예에서, 해리 상수 값은 항원(aβ40)과 이의 항체(항-aβ40) 간의 상호작용을 기술하는 바, Langmuir 흡착 모델-기반의 접근방법을 이용하여 표시할 수 있다.
이와 관련하여, 도 10은 PBS 및 HS 내에서 형성된 Concaβ40 대 Concaβ40/|ΔC|에 대한 2개의 선형 회귀 곡선을 나타낸다. PBS에서 회귀 곡선의 기울기 및 y-절편은 각각 0.77 및 0.59이었고, HS에서는 각각 0.84 및 0.98이었다.
PBS 및 HS 각각에서 항-aβ40 항체-aβ40 바인딩의 해리 상수 값은 y-절편을 기울기로 나눔으로써 얻을 수 있는 바, 0.76 fg mL-1 및 1.16 fg mL-1으로 확인되었으며, 이는 각각 1.9×10-7 nM 및 2.9×10-7 nM에 상당한다. 이러한 해리 상수 값은 다른 aβ40-바인딩 파트너 상호작용에 비하여 작은 값이며, 이는 항체와 항원 간에 높은 바인딩 친화도가 형성되었음을 의미한다.
aβ40의 검출을 위한 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서의 선택도는 혈청 내 종양괴사인자-알파(TNF-α, 500 pg mL-1), C-반응성 단백질 (CRP, 10 ng mL-1), 및 인슐린 (1000 ng mL-1)의 존재 하에서 평가하였다.
3 Hz의 주파수에서 커패시턴스 |ΔC|의 변화를 이용하여 HS 내 TNF-α, CRP, 및 인슐린이 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과를 도 10c에 나타내었다.
상기 도면에 따르면, TNF-α, CRP, 및 인슐린에 대한 센서의 응답 값 |ΔC|은, aβ40에 대한 응답과 비교하면, 현저히 변화하지 않았는 바, 이는 항체(항-aβ40)와 항원(aβ40) 간 특이적 바인딩으로 인하여 aβ40의 검출 선택도가 양호함을 뒷받침한다. 도 10d를 참조하면, 항-aβ40/β-CD/RGO/ITO 센서의 커패시턴스 |ΔC|는 4 ℃로 유지되는 냉장고 내에서 1일, 2일, 3일, 7일 및 14일의 저장 후에도 3 Hz의 주파수에서 유지되었는 바, 이는 제작된 센서의 안정성이 양호함을 의미한다.
상술한 점을 고려할 때, 실시예에 따라 제작된 센서는 aβ40 단백질의 검출 임상에서 알츠하이머 질환의 조기 진단에 적합함을 알 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (20)

  1. 전극;
    상기 전극 상에 형성된 환원 그래핀 산화물 층;
    상기 환원 그래핀 산화물 층 상에 순차적으로 형성된 사이클로덱스트린 층; 및
    호스트-게스트 상호작용을 통하여 상기 사이클로덱스트린 층에 고정되며, 액상 시료와 접촉 시, 액상 시료 내에 함유된 아밀로이드베타 1-40 단백질과 특이적으로 바인딩되는 항-아밀로이드베타 1-40 항체, 상기 호스트-게스트 상호작용에 의하여 사이클로덱스트린과 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간에 거대분자 포접 복합체(supermolecular inclusion complex)가 형성됨;
    를 포함하는 아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서로서,
    상기 액상 시료 내에 아밀로이드베타 1-40 단백질이 함유된 경우에 항-아밀로이드베타 1-40 항체와의 바인딩에 의한 커패시턴스 변화를 검출하도록 구성되고, 그리고
    상기 환원 그래핀 산화물 층의 중량 기준으로, 상기 사이클로덱스트린 층의 함량은 3 내지 12 중량%의 범위에서 정하여지는 커패시턴스 센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전극은 기판 상에 형성되는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기판은 실리콘, 석영, 글라스, 세라믹 및 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 재질인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전극은 인듐-주석-산화물(ITO), 인듐-아연-산화물(IZO), 안티몬주석산화물(ATO), 아연산화물(ZnO), 주석산화물(SnO2), 갈륨-아연-산화물(GZO), 알루미늄-아연-산화물(AZO) 및 카드뮴-주석-산화물(CTO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 재질인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전극은 마이크로-디스크 전극인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  6. 제5항에 있어서, 상기 마이크로-디스크 전극의 직경은 100 내지 1000 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 층은 β-사이클로덱스트린 층인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  9. 제1항에 있어서, 상기 환원 그래핀 산화물 층의 두께는 1 내지 3 nm의 범위이고, 상기 환원 그래핀 산화물 층의 비표면적(BET)은 50 내지 150 ㎡/g의 범위인 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서.
  10. 삭제
  11. a) 전극을 제공하는 단계;
    b) 상기 전극의 표면 상에 환원 그래핀 산화물(RGO) 층을 부착하는 단계;
    c) 상기 환원 그래핀 산화물 층 상에 사이클로덱스트린(CD) 층을 순차적으로 부착하여 CD/RGO 나노복합체를 형성하는 단계; 및
    d) 상기 CD/RGO 나노복합체 내 사이클로덱스트린에 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 고정하되, 호스트-게스트 상호작용을 통하여 호스트인 사이클로덱스트린의 내측 캐비티 내로 게스트 분자인 항-아밀로이드베타 1-40 항체를 도입하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 호스트-게스트 상호작용에 의하여 사이클로덱스트린과 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간에 거대분자 포접 복합체(supermolecular inclusion complex)가 형성되고, 그리고
    상기 환원 그래핀 산화물 층의 중량 기준으로, 상기 사이클로덱스트린 층의 함량은 3 내지 12 중량%의 범위에서 정하여지는 아밀로이드베타 1-40 단백질 검출용 커패시턴스 센서의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단계 d) 중 게스트 분자인 항-아밀로이드베타 1-40 항체가 호스트인 사이클로덱스트린의 내측 캐비티로 정전기적 포접 상호작용 및/또는 수소 결합에 의하여 침투함으로써 거대분자 호스트-게스트 포접 복합체(supramolecular host-guest inclusion complex)를 형성하는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단계 b)는 순환 전압 전위법(cyclic voltammetry) 또는 전류법(amperometry)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 전류법은 시간대 전류법으로서, 그래핀 산화물의 용액을 사용하고, -2 내지 -0.5 V의 전압의 인가 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 단계 c)는 순환전압 전위법(cyclic voltammetry)에 의하여 수행되며,
    이때, 사이클로덱스트린의 용액을 사용하고, -1.5 내지 1.5 V의 전압의 인가 하에 5 내지 500 mV/s의 주사속도로 2 내지 50 사이클로 수행되는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서의 제조방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 단계 d)는 항-아밀로이드베타 1-40 항체 및 CD/RGO 나노복합체를 인큐베이션함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 커패시턴스 센서의 제조방법.
  17. 커패시턴스 센서를 이용한 시료 내 아밀로이드베타 1-40 단백질의 검출 방법으로서,
    분석 대상인 액상 시료를 제공하는 단계; 및
    상기 액상 시료에 커패시턴스 센서를 접촉시켜 커패시턴스의 변화를 측정하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 커패시턴스 센서는,
    전극;
    상기 전극 상에 형성된 환원 그래핀 층;
    상기 환원 그래핀 층 상에 순차적으로 형성된 사이클로덱스트린 층; 및
    호스트-게스트 상호작용을 통하여 상기 사이클로덱스트린 층에 고정되며, 액상 시료와 접촉 시, 액상 시료 내에 함유된 아밀로이드베타 1-40 단백질과 특이적으로 바인딩되는 항-아밀로이드베타 1-40 항체, 상기 호스트-게스트 상호작용에 의하여 사이클로덱스트린과 항-아밀로이드베타 1-40 항체 간에 거대분자 포접 복합체(supermolecular inclusion complex)가 형성됨;
    를 포함하며,
    상기 액상 시료 내에 아밀로이드베타 1-40 단백질이 함유된 경우에 항-아밀로이드베타 1-40 항체와의 바인딩에 의한 커패시턴스 변화가 발생하고, 그리고
    상기 환원 그래핀 산화물 층의 중량 기준으로, 상기 사이클로덱스트린 층의 함량은 3 내지 12 중량%의 범위에서 정하여지는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 액상 시료는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 검출 방법은 레독스 프로브의 부존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 커패시턴스 센서의 혈청에서의 검출 한계(LOD)는 100 fg/mL 이하이고, 그리고 혈청에서의 LRD(linear range of detection)는 1 내지 106 fg/mL의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
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