TWI453282B - 連接物、阻抗式生物晶片及使用該晶片在流體樣品中定量偵測目標分析物之方法 - Google Patents

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Description

連接物、阻抗式生物晶片及使用該晶片在流體樣品中定量偵測目標分析物之方法
本發明係有關於一種生物晶片上之連接物，尤係有關於一種橋接生物晶片上電極和抓取探針之連接物。
生物晶片係一種設計為偵測或量化目標分析物(如蛋白質、DNA、細胞、葡萄糖、心血管疾病生物標記(如S100和C-反應蛋白(CRP)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、CKMB等之類)、癌症生物標記(如癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)等之類)、細菌生物標記(如大腸桿菌，金黃色葡萄球菌等之類)、和病毒(如H1N1等之類)之晶片。許多生物晶片是親和型的(affinity-based)，其代表它們使用已經固定好的抓取探針(capture probe)以結合目標分析物，然後使用傳感器來偵測局部表面上之改變。抓取探針係生物識別元件(bio-recognition element)，可以與目標分析物結合或交互作用。例如當目標分析物為一抗原時，抓取探針可以為一抗體。這種變化可以多種方式測量。在這些選擇之中，測量電極和流體樣品間之電阻抗之阻抗式生物晶片具有免標定、低成本、低功耗和易於縮小化之優勢。由於這些優點，阻抗式生物晶片非常適合如定點照護(point-of-care)等小尺寸及成本係至關重要的應用上。
阻抗式生物晶片可分為兩種：非法拉第(non-faradic)和法拉第。非法拉第生物晶片(亦稱為電容式生物晶片)藉由測量電極-溶液界面之非法拉第瞬時電流或電容改變量來偵測目標分析物(例如，生物標記物)的濃度。當在電極-溶液界面發生生物標記-抓取探針間的交互作用時，該介面的電容值會改變，而其電容差異係來自該交互作用所導致之介電常數、電荷分佈、尺寸和形狀的變化。然而，電容式生物晶片有一個致命缺點，也就是形成一無缺陷的生物識別層要來得比在法拉第生物晶片中更為重要，因為如果這些層沒有很好的絕緣性，離子就可以通過缺損區到達電極表面，並造成短路而導致信號減少或不足。
相對之下，法拉第生物晶片係測量氧化還原對之氧化/還原反應所引起的法拉第電流變化。因此，法拉第生物晶片需要加入氧化還原對。由於固定抓取探針和目標分析物之間的結合會形成空間障礙，因此會阻礙氧化還原對從溶液至電極的擴散作用，因此當流體樣品之濃度愈高時，所量測到的法拉第電流就會愈小。通過進一步計算阻抗之電壓/電流比，可以很容易的相關目標分析物之濃度與計算之阻抗。
連接物為一種用於將抓取探針固定於生物晶片上之特殊分子。關鍵的是，連接至生物晶片表面上的抓取探針需仍然保持其探針之專一性和活性，卻又能抑制非專一性吸附。連接物最常見的類型係基於硫醇結合金表面與矽烷結合到氧化物表面。對於採用表面電漿共振或石英晶體微天平來測量目標分析物的相關變化之生物晶片而言，緊密堆疊之自組裝單層(SAM)係較佳，因為他可以阻斷溶液中之大多數物質通過(access)該電極。為達到這樣的目的，傳統上會使用長鏈硫醇之連接物，如12-巰基十二酸(12-mercaptododecanoic acid(12-MCA),HS(CH2 )11 COOH)。然而，在法拉第阻抗式生物晶片中，阻抗式生物晶片之電極表面必須能使氧化還原對通過，而這些習知連接物便不再合適。
因此，業界仍存有發展連接阻抗式生物晶片之抓取探針與電極的連接物之需要，該連接物需對於氧化還原對具有較高的導電性和低阻斷效應(block effect)。
鑑於上述習知技術之缺失，本發明之一實施例提供一種用於連接生物晶片上電極和抓取探針之連接物，係包括化學式(I)之化合物：
R2 -(CH2 )m -(R3 )n -(CH2 )k -R1 　(I)
其中R1 係用於結合如蛋白質、DNA、RNA或酶之抓取探針之官能基；R2 係用於連接如金、鉑、銀和銦錫氧化物(ITO)電極的官能基；R3 係噻吩或噻吩衍生物；n係1至4；m係0至5；和k係0至5。
在本發明的另一實施例中，用於連接晶片上電極和抓取探針之連接物包括化學式(I)之化合物：
R2 -(CH2 )m -(R3 )n -(CH2 )k -R1 　(I)
其中R1 係氫原子，選擇性具有取代基之鏈脂肪烴類基、-C(=O)-R11 、-C(=O)-O-R11 、氨基，或環氧基；R2 係-SH、S-C(=O)-R11 、硫化物、二硫化物或矽烷；R3 係選擇性具有取代基之5-至7-員含硫芳香族雜環基；R11 係氫原子或選擇性具有取代基之C1-6 烷基，n係1至4；M係0至5；k係0至5。
本發明之一實施例進一步提供一種晶片，用於在流體樣品中定量偵測目標分析物之濃度，係包括：至少兩個電極；具有化學式(I)之化合連接物；和抓取探針，用於在流體樣品中與目標分析物交互作用，其中連接物有兩端個別地連接抓取探針和至少一電極，從而連接抓取探針和電極。
本發明之另一實施例進一步提供一種在流體樣品中定量偵測目標分析物之濃度之方法，係包括：提供目標分析物於上述之晶片上之流體樣品中；提供氧化還原對至流體樣品中；在一段時間內施加具有交流(AC)頻率之電位圖形至該生物晶片之兩電極並同時測量其電流響應，其中電位圖形包括直流(DC)偏壓和交流(AC)電壓；及關聯從晶片產生的電流信號與流體樣品中目標分析物之濃度。
依據本發明的實施例，生物晶片採用包括化學式(I)之化合連接物，提供氧化還原對在電性上更可及的表面，以增加氧化還原對產生的法拉第電流。增加法拉第電流之優點係用於測量生物晶片表面的阻抗的電子電路可以設計成低成本及小體積，因而更適合應用於定點照護。
以下係藉由特定的具體實施型態說明本發明之實施方式，熟悉此技術之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施型態加以施行或應用。
第1(D)圖係顯示用於連接晶片100之電極106和抓取探針104之連接物102和在流體樣品中之目標分析物108之示意圖。如本發明的實施例，用於連接晶片上電極和抓取探針之連接物，係包括化學式(I)之化合物：
R2 -(CH2 )m -(R3 )n -(CH2 )k -R1 　(I)
其中R1 係用於結合如蛋白質、DNA、RNA或酶之抓取探針之官能基，較佳為-C(=O)-OH、-C(=O)H、-NH2 或環氧基；R2 係用於連接如金、鉑、銀和銦錫氧化物(ITO)電極的官能基，較佳為-SH、S-C(=O)-R11 、硫化物基團、二硫化物基團或矽烷基團；R3 係噻吩或噻吩衍生物；n係1至4；m係0至5；和k係0至5。如本發明的實施例，連接物包括R2 -(CH2 )m -(R3 )n -(CH2 )k -R1 之化學式(I)，其中，R1 係為-C(=O)-OH或-C(=O)H；R2 係-SH或-S-C(=O)-CH3 ；R3 係噻吩；n係1至3；m係0至3；和k係0至3。此外，如本發明的實施例，包括選自以下組成之基之化合物之連接物：5’-巰基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰乙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰乙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰丙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩或5’-巰丙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩。
依據本發明的實施例，化學式(I)之化合物組成的連接物提供一個更易於傳遞電子的修飾表面。當用於需要附加氧化還原對以測量由目標分析物結合抓取探針所引起之表面阻抗變化的法拉第阻抗式生物晶片時，本發明的連接物提供一個更易於傳遞電子的表面而可以增強法拉第電流。藉由具有較低的阻抗基準，本發明設計可使用來測量晶片信號的裝置進一步簡化其電子電路設計，並可降低成本及縮小體積，且可用於定點照護(point-of-care)應用。依據本發明之一實施例，生物晶片100包括至少兩個電極106，包括化學式(I)之化合連接物102和用於與流體樣品中之目標分析物108交互作用之抓取探針104，其中，連接物102具有兩端分別連接抓取探針104和該等電極106至少之一。
如本發明之一實施例，如第1(A)圖所示，生物晶片100具有三個電極且所有電極106和抓取探針104都關聯到連接物102。如本發明之一實施例，如第1(B)圖所示，生物晶片100具有兩個電極且兩個電極106和抓取探針104都關聯到連接物102。第1(C)圖說明依據本發明之實施例之生物晶片100具有指叉結構的兩個電極106。如另一實施例，生物晶片100之電極只有部分跟連接物102和抓取探針104有關聯。此外，如第1(A)、1(B)和1(C)圖所示，生物晶片100可連接到電化學分析儀200。如本發明之一實施例，該等電極係一選自由金、鉑、銀和ITO所組成的群組之導電材料，以及該抓取探針係選自由蛋白質、DNA、RNA和酶所組成之群組中的至少之一者。此外，如本發明之一實施例，具有非定域π電子之連接物包括噻吩的結構，較佳為5’-巰基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰乙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰乙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰丙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩或5’-巰丙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩。
如本發明之一實施例，在流體樣品中定量偵測目標分析物之濃度的方法，包括：提供目標分析物於生物晶片上之流體樣品中，而該生物晶片包含有式(I)之化合連接物以固定抓取探針；提供氧化還原對(如Fe(CN)6 3-/4- 、Ru(NH3 )6 2+/3+ 、Fe2+/3+ 、Mn2+/3+ 、Fe(NOTA)0/- 、[Fe(tacn)2 ]3+/2+ 等之類)於流體樣品中；在一段時間內施加具有交流(AC)頻率之電位圖形至該生物晶片之兩電極並同時測量其電流響應，其中該電位圖形由直流(DC)偏壓和交流(AC)電壓組成，直流偏壓較佳係從-0.5到0.5V，交流(AC)電壓最佳係正弦波，三角波或方波，或正弦波，三角波和/或方波之組合，AC電壓較佳具有從0.001到0.05V之振幅範圍；和關聯阻抗式生物晶片產生的電流信號與流體樣品中之目標分析物之濃度。於所施加之該電位圖形中，該DC偏壓和AC電壓可在此一段時間內保持不變或有所不同。而所施加之DC偏壓的設定基本上係根據氧化還原對(如氧化還原活性對)和環境條件(如pH值)加以選擇。
如本發明的實施例，該電位圖形具有單一的交流頻率或在一段時間於兩個或以上的交流頻率之間切換。
電化學阻抗譜(EIS)之阻抗測量
如本發明之一實施例，係採用CHI 614D電化學分析儀施作電化學實驗。
於三極式電化學單元進行循環伏安法(CV)和阻抗測量。在三極式電化學單元中，電流不再流過參考電極，而流過工作和輔助電極，從而參考電極可以恆定系統的電位。
第2(A)及2(B)圖係顯示CV圖施加之電位與時間的關係及電流響應與施加之電位。CV的電位掃描範圍為-0.2至+0.6V，掃描速度為50 mV/s。至於阻抗測量，如第3(A)圖所示，外加之電位圖形包括兩個部分：直流偏壓和交流電壓。在本發明之一實施例，施加之電位圖形之直流偏壓定為氧化還原對之開路電壓，交流電壓振幅為5mV，且其測試頻率範圍從1赫茲(Hz)至100千赫(kHz)。第3(B)圖係顯示頻率被定為定值或於兩個或兩個以上不同的頻率之間切換之實施例。阻抗值可藉由電流響應和施加的電位圖形來計算。量測到的阻抗資料可帶入等效電路並進行數學運算與擬合(fitting)來提取電路中之每一參數。
第4(A)圖說明溶液電阻(Rs )，電雙層電容(Cd1 )，電子轉移電阻(Ret )，以及Warburg阻抗(Zw )等參數所組成之等效電路。Rs 來自於本體溶液之有限的離子導電性，因此一般不會為電極的表面修飾影響。由於某些材料，如連接物和生物分子，屬於介電物質，因此，其Cd1 將依據電極表面上所修飾或結合之物質而改變。Ret 涉及電子轉移之動力學，而Zw 係一種涉及質量傳遞之電阻。參數Rs 、Cd1 、Ret 和Zw 可藉由量測兩個或兩個以上(如三個)不同的頻率所獲得的阻抗資料帶入等效電路並進行數學運算與擬合而得到。
為減少在不同的頻率施加電位所花費之時間，如第4(A)圖所示之等效電路係由選擇適當的頻率簡化成第4(B)圖之電路。經過簡化，該電路的阻抗為：
其中，j係虛數單位，ω係角頻率。
由於選擇適當的頻率及使用本發明之如式一之化合物，使得Ret j ω Cd1 <<1，因此ZRs +Ret ，而且Δ|Z|ΔRet 。換言之，於單一頻率使用電位掃描可得到阻抗之近似變化(ΔRet )，不需要擬合(fitting)等效電路以提取參數，從而簡化後端電路設計。
電化學實驗之溶液之製備
在以下實驗中，UR(UR-PBS001)提供的磷酸鹽緩衝液(PBS)用於製備抓取探針和目標分析物溶液。電化學實驗之電解液係具有1mM之K3 Fe(CN)6 /K4 Fe(CN)6 (Sigma-Aldrich)及1×PBS pH7.2之混合溶液，並於使用之前再即準備。用於活化之羥基丁二醯胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二乙基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)分別購自Fluka(56480)和Sigma Aldrich(E1769)。阻斷劑(用於阻斷連接物之鍵結區)，乙酸銨(ETA-HCl)自Sigma-Aldrich(E6133)取得。再生劑，甘氨酸，用於再生生物晶片之抓取探針係從Sigma(50046)取得。使用通過Milli-Q純水系統純淨過之去離子水(D.I. water)製備所有的溶液。
生物晶片結構
在以下實驗中，生物晶片包括三個電極：2毫米直徑金為工作電極，銀/氯化銀電極和鉑絲分別為參考和輔助電極。使用0.05微米的氧化鋁拋光粉和微研磨布(microcloth)來拋光2毫米直徑的金工作電極，然後於去離子水中進行超聲波清洗。
比較實施例
自Aldrich取得12-巰基十二酸(12-Mercaptododecanoic acid(12-MCA)，HS(CH2 )11 COOH)來作為比較的例子，並利用95%乙醇溶液來製備12-MCA溶液。
在比較之生物晶片，將2毫米直徑的金電極於室溫下浸泡在12-MCA溶液中6小時。隨後，使用乙醇和去離子水沖洗修飾有12-MCA的電極。接下來，對12-MCA修飾電極用400 mM EDC/100 mM NHS(1：1)的溶液來活化12-MCA之羧基官能基，接著將antiS100(abcam)固定上去。
為量測修飾於電極之上的SAM的阻斷效應，這裡利用循環伏安法來觀察可逆的Fe(CN)6 3- /Fe(CN)6 4- 之氧化還原行為。在第5圖，對裸電極來說，氧化和還原峰電位出現在約0.24 V和0.17 V的位置。12-MCA修飾後，因為12-MCA對Fe(CN)6 3- /Fe(CN)6 4- 之電子轉移有阻斷效應，因此在第5圖中可發現峰電位消失。這表示傳統使用的長鏈硫醇連接物係不適合用在法拉第生物晶片上。
實施例
電化學特性分析
作為連接物或連接物中之分子見表1。
電化學特性分析用之電解液係1mM之K3 Fe(CN)6 /K4 Fe(CN)6 (Sigma-Aldrich)與pH 7.2的1×PBS之混合溶液，並於使用之前再即準備。作為連接物或部分連接物之分子係：5’-巰基-5-甲醛-2,2-雙噻吩(與5’-巰基-5-甲酸-2,2-雙噻吩)、5’-巰甲基-5-甲醛-2,2-雙噻吩(S2TA)(5’-巰甲基-5-甲酸-2,2-雙噻吩)、5’-巰丙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩(A2T3S)(5’-巰乙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩)、5’-巰丙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩(CS23S)(5’-巰乙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩)，以及5’-巰己基-5-甲酸-2,2-雙噻吩(CPD)合成。S2TA和A2T3S溶液利用二氯甲烷製備，CS23S和CPD則溶解在四氫呋喃中，其濃度均為5mM。
在生物晶片製作方面，將2毫米直徑的金電極分別於室溫下浸泡在S2TA，A2T3S，CS23C和CPD溶液中6小時。此後，S2TA和A2T3S修飾電極(即用鍍有金之玻璃基板的生物晶片去連接S2TA或A2T3S)以二氯甲烷、乙醇和去離子水沖洗。CS23S和CPD修飾電極均以四氫呋喃、乙醇和去離子水沖洗。由於S2TA和A2T3S之官能基係CHO，antiS100結合到S2TA和A2T3S時無須進一步活化。
接著使用循環伏安法(CV)並透過可逆的Fe(CN)6 3- /Fe(CN)6 4- 之氧化還原行為，來測量電極上的SAM的阻斷效應。第5圖係顯示比較實施例之裸電極、S2TA、A2T3S、CS23S、CPD和12-MCA修飾電極之CV測量結果。經連接分子修飾後，電流峰值會下降，而在陽極和陰極峰值電壓之間的ΔEp 差異增加；然而，以S2TA與A2T3S的情況來看，仍然可見氧化還原峰電位的存在。這係由於S2TA等之類的結構具有非定域π電子(以含硫芳香族雜環基的形式，如噻吩或噻吩衍生物)，可提高電子轉移能力，因此係最導電。
由擬合(fitting)阻抗資料與Randles等效電路並以Zview軟體分析後，裸露電極、S2TA修飾電極和12-MCA修飾電極的電子轉移電阻(Ret )估計分別為1.22kΩ、5.78kΩ以及1.58 MΩ。結果列於表2。
結果顯示相較於12-MCA修飾電極，S2TA修飾電極之電子轉移電阻低得多，呈約三個數量級。
抓取探針(如抗體)固定化後的電化學特性
由於靜電力會影響阻抗，因此，最好是將抓取探針固定於連接物或部分的連接物之後再行比較Ret ，以確定哪一連接物係用於法拉第阻抗式生物晶片是最好的。第6圖顯示掃描範圍從1Hz到100kHz之antiS100固定後之阻抗資料。藉由擬合阻抗資料與Randles電路，每一分子之電子轉移電阻(Ret )總結於表3，其分別顯示各種連接分子固定抓取探針(antiS100)後之Ret 。其中，12-MCA係不導電的長碳鏈硫醇。
從結果很顯然得知，Ret 的大小係S2TA<A2T3SCS23S<CPD12-MCA的順序。antiS100固定後之S2TA之阻抗約較A2T3S低一個數量級。這係由於亞甲基(CH2 )數量的不同。對於A2T3S和CS23S，其Ret 沒有太大的差異，與表2結果不一致。不一致可能係一旦antiS100固定於SAM後，SAM和氧化還原對之間的靜電力消失所造成。因此，Ret 只取決於CH2 的數目。實驗結果顯示碳鏈(CH2 )越短，導電性越好之趨勢。以這幾種連接物來看，S2TA具有最高的導電性，因為只具有一個CH2 。如無CH2 ，導電性會更好。在這種情況下，連接物主要依賴其中兩個噻吩以執行導電性。結果顯示碳鏈長度應盡可能短，這顯示了使用噻吩等之類結構的益處。
因此，包括具有與S2TA結構相似的分子之連接物，比通常使用之傳統的長鏈硫醇連接物更適於法拉第阻抗式生物晶片，因為這種結構提供較低的阻抗基準和更好的偵測極限。較低的電阻也意味具有更高的電流，更利於定點照護應用，因為電子電路系統可以被設計為小體積和低成本。
抗體抗原(antiS100-S100)交互作用的阻抗測量
通常情況下，一般抓取探針包括蛋白質(如抗體)、DNA及酶等之類；一般目標分析物(如一般生物標記)包括蛋白質、DNA、細胞、葡萄糖、心血管疾病生物標記(如：S100和C-反應蛋白(CRP)、肌鈣蛋白I、CKMB等之類)、癌症生物標記(如癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)等之類)、細菌生物標記(如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等之類)和病毒(如H1N1之類)。在我們的實施例中，選定S100和antiS100來進行阻抗量測以驗證本發明的優點與應用可行性。
抗體抗原交互作用測量步驟如下：將antiS100固定在連接物上之後，利用pH8.2的1M ETA-HCl進行20分鐘的反應，以阻斷連接物之鍵結區來防止非專一性結合。S100(Sigma)以1×PBS(pH 7.2)製備，濃度自10ng/mL至10μg/mL，然後與antiS100交互作用15分鐘。最後利用0.1M甘氨酸，pH值2.5來再生antiS100表面。
第7圖係顯示附加流體樣品(即antiS100，ETA，和不同濃度的S100抗原：(a)S2TA；(b)antiS100；(c)ETA；(d)10ng/ml之S100；(e)50ng/ml之S100；(f)100ng/ml之S100；(g)200ng/ml之S100；(h)500ng/ml之S100；(i)1μg/ml之S100；(j)2μg/ml之S100；(k)5μg/ml之S100；及(l)10μg/ml之S100)之後，在具有1mMFe(CN)6 3-/4- 的1×PBS溶液中，結合連接物(如S2TA修飾電極)之抗原辨識分子之生物晶片之阻抗資料圖。從圖上看，附加antiS100、ETA和S100蛋白後，半圓的直徑增加。增加的直徑表示Ret 增加。由於antiS100和ETA係不導電，antiS100之固定化和ETA之結合形成空間障礙阻斷Fe(CN)6 3-/4- 之電子轉移。由於S100蛋白也不導電，與antiS100交互作用後，可發現Ret 進一步增加。正如預期，當S100蛋白的濃度增加，antiS100和S100之間的交互作用也有所增加。因此產生較大的空間阻礙和靜電排斥力而造成阻抗更為顯著改變。
由擬合阻抗資料至等效電路模型，可以得到Rs 、Ret 和Cd1 之詳細值，結果見表4。
從表中可以發現Rs 和Cd1 的變化比在Ret 小。資料與預測係一致的，因為Rs 僅與電解質組成有關。因氧化還原電流存在，Cd1 將不會發生很大的變化。一般來說，Ret 於法拉第阻抗式生物晶片係變化最大的參數。為量化S100，阻抗變化參數被定義為：
△Ret =Ret(S100) -Ret(ETA)
其中Ret(S100) 係加入不同濃度S100蛋白後測量的Ret 值，Ret(ETA) 代表加入S100蛋白之前之Ret 值。表5顯示不同濃度的S100之Ret 變化。
第8圖顯示ΔRet 和S100蛋白之間之線性關係，其線性區間在10ng/ml至10μg/ml之間，偵測極限約為10ng/ml(0.5nM)。計算後之相對標準偏差(RSD，n=4)約為10至15%。相對於使用長鏈硫醇作為連接物之現有技術，本系統之偵測極限大大改善(82nM與0.5nM)，這是因為導電連接物可以增加S/N和進一步降低偵測極限。
基於以上的電化學特性量測，已經用來做為連接物或部分的連接物之測試分子如下，
上述分子之阻抗(Ret )測量結果顯示Ret 單單取決於(CH2 )碳鏈的數目(或長度)，測量結果符合預測。亦即，碳鏈越短(CH2 )，其導電性越佳。
鑑於以上，依據本發明之實施例之連接物及連接物組成的生物晶片具有成本低，體積小，方便校準的優點。增加法拉第電流的優點係用來量測阻抗式生物晶片的電子電路可以設計為體積小，成本低，因而適合定點照護的應用。
儘管本發明已將與較佳實施例有關的來作顯示及描述，但對在此技術領域具有通常知識者會明瞭在不脫離如附加的申請專利範圍所定義之本發明之精神與範疇下，可作修改及變化。
100．．．晶片
102．．．連接物
104．．．抓取探針
106．．．電極
108．．．目標分析物
200．．．電化學分析儀
本發明之以上與其它物件、特徵及其它優點再結合以下所附圖式之詳細說明將會清楚瞭解，其中：
第1(A)圖係測量生物晶片之阻抗的示意圖，包括：依據本發明之實施例之具有三個電極106的生物晶片100，和用於提供電位圖形和測量電流響應的電化學分析儀200；第1(B)圖係測量依據本發明另一實施例之具有兩個電極106之生物晶片100之阻抗的示意圖；第1(C)圖係測量依據本發明另一實施例之具有兩個電極106之生物晶片100之阻抗的示意圖；和第1(D)圖係具有連接物102之電極106和於其上之抓取探針104和在流體樣品中之目標分析物108之示意圖。
第2(A)及2(B)圖係顯示CV圖施加之電位與時間的關係；及電流響應與施加之電位；
第3(A)圖係顯示依據本發明之實施例之施加之電位圖形之圖，包括兩個部分：直流偏壓和固定頻率之交流電壓，和第3(B)圖係施加之電位圖形的圖式，包括切換兩個或兩個以上不同的頻率。
第4(A)圖係顯示等效電路，用於擬合(fitting)和取得Rs ,Cd1 ,Ret 和Zw ；及第4(B)圖係由第4(A)圖所簡化之電路；
第5圖係顯示裸電極及S2TA、A2T3S、CS23S、CPD和12-MCA修飾電極之CV測量圖；
第6圖係包括S2TA之連接物連接後，固定有抗原識別分子之生物晶片之阻抗資料；
第7圖係顯示附加抗原流體樣品於結合連接物(如S2TA修飾電極)與抗原識別元素之生物晶片後，在含有1mM Fe(CN)6 3-/4- 的1×PBS溶液中所量測到之阻抗資料圖；和
第8圖係顯示S100濃度從10ng/ml至10μg/ml(n=4)之相對應之Ret 變化之圖。
100．．．晶片
102．．．連接物
104．．．抓取探針
106．．．電極
108．．．目標分析物

Claims (16)

  1. 一種用於連接生物晶片上電極和抓取探針之連接物，包括下列式(I)之化合物：R2 -(CH2 )m -(R3 )n -(CH2 )k -R1 (I)其中，R1 係用於結合蛋白質、DNA、RNA或酶之抓取探針的官能基，其中，R1 係-C(=O)-OH、-C(=O)H、-NH2 或環氧基；R2 係用於連接金、鉑、銀或銦錫氧化物(ITO)電極的官能基，其中，R2 係-SH、-S-C(=O)-CH3 、硫化物基團、二硫化物基團或矽烷基團；R3 係噻吩；n係1至4；m係0至5；和k係0至5。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之連接物，其中，n係1至3；m係0至3；k係0至3。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之連接物，係包括選自下列化合物所組成之群組：5’-巰基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、5’-巰甲基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰乙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、 5’-巰乙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩、5’-巰丙基-5-甲醛-2,2-雙噻吩、或5’-巰丙基-5-甲酸-2,2-雙噻吩。
  4. 一種用於在流體樣品中定量偵測目標分析物濃度之生物晶片，包括：至少兩個電極；如申請專利範圍第1項所述之連接物；及抓取探針，用於與在該流體樣品中之該目標分析物交互作用，其中，該連接物具有兩個末端，其個別連接該抓取探針和該至少兩電極中之至少一電極。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之晶片，其中，該至少兩電極之材料係選自金、鉑、銀和銦錫氧化物(ITO)所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之晶片，其中，該抓取探針至少之一係選自下列所組成之群組：蛋白質、DNA、RNA和酶。
  7. 一種在流體樣品中定量偵測目標分析物的濃度之方法，包括：提供如申請專利範圍第4項所述之生物晶片上的流體樣品；提供氧化還原對至該流體樣品中；在一段時間內施加具有交流(AC)頻率之電位圖形至該生物晶片之兩電極並同時測量其電流響應；及將該電流響應關聯至該流體樣品中該目標分析物 之濃度。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該電位圖形之交流電壓係正弦波、三角波、方波或正弦波、三角波及/或方波之組合。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，電位圖形尚包括直流偏壓。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，在該一段時間內之該直流偏壓保持不變。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，在該一段時間內之該直流偏壓不同。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，該直流偏壓範圍從-0.5至0.5V。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該交流電壓之振幅範圍從0.001至0.05V。
  14. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該目標分析物係選自由蛋白質、DNA、細胞、葡萄糖、心血管疾病生物標記(如S100和C-反應蛋白(CRP)、肌鈣蛋白I(Troponin I)、CKMB等之類)、癌症生物標記(如癌症抗原125(CA125檢測)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)等之類)、細菌生物標記(如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等之類)和病毒(如H1N1等之類)所組成之群組的至少一者。
  15. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，在該一段時間內之該電位圖形切換一個以上的AC頻率。
  16. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該氧化還原對係Fe(CN)6 3-/4- 或Ru(NH3 )6 2+/3+ 。
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