KR20220170249A - 커패시티브 바이오센서 칩 및 리더기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 반복 사용이 가능한, 비표지(label free) 기반의 인터디지털 커패시터형(Interdigital Capacitive, IDC) 바이오센서 칩 및 리더기에 관한 것으로서, 구체적으로는 이중 맞물린 형태의 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC)에 결합하는 리셉터의 종류를 변경하는 것만으로 각종 바이오마커의 검출이 가능한 바이오센서 칩 및 상기 칩의 리더기에 관한 것이다.
Description
본 발명은 반복 사용이 가능한, 비표지(label free) 기반의 인터디지털 커패시터형(Interdigital Capacitive, IDC) 바이오센서 칩 및 리더기에 관한 것으로서, 구체적으로는 이중 맞물린 형태의 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC)에 결합하는 리셉터의 종류를 변경하는 것만으로 각종 바이오마커의 검출이 가능한 바이오센서 칩 및 상기 칩의 리더기에 관한 것이다.
바이오센서 칩(biosensor)란 생물체의 특정한 기능을 가지는 표적물질인 효소, 항체, DNA 등을 인식하고 반응하는 리셉터가 신호 변환장치와 결합되어 생화학적 상호작용 및 인식반응을 전기적 신호로 변환함으로써 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 전기 화학적 센서를 의미한다.
바이오센서 칩은 다양한 생리활성 물질의 농도를 신속하게 정량화 할 수 있어 대상 물질의 종류에 따라 바이오, 화학, 환경 등의 활용 용도로 널리 사용될 것으로 기대되는 소자이다.
전기 화학적 센서를 이용한 표적물질의 검출 및 분석을 위해서는 표적물질이 가지는 미세한 특성에도 신호의 변화가 크게 나타날 수 있도록 높은 감도를 가지고 있어야 하며, 체액의 화학성분에 견딜 수 있는 화학적 안정성과 유체의 흐름에도 영향을 받지 않는 물리적 안정성을 지니고 있어야 한다. 또한 용이한 사용을 위하여 기존의 측정 플랫폼을 이용할 수 있어야 하며 경제성과 실용성을 위하여 대량 생산이 용이한 구조로 제작될 것이 요구된다.
여러 차례의 범 지구적인 감염병의 출현과 건강에 대한 관심이 높아지면서, 진단 분야에 대한 필요성이 날로 증가하고 있는 추세이고, 용량성 바이오센서 칩 등 다양한 첨단 바이오 센싱 기술이 개발되고 있으나, 고감도, 빠른 결과 판별, 재사용 가능이라는 세가지 필요성 모두를 만족시킬 수 있는 기술이 존재하지 않아, 이와 같은 기술의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 각종 바이오마커에 반응하는 리셉터가 결합된 이중 맞물린 형태의 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC) 바이오센서 칩 및 이의 리더기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서 칩을 이용한 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서 칩을 이용한 질병 치료제의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서 칩을 이용한 질병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면은, 기판; 상기 기판 상에 위치한 구리금속 전극; 전도성 코팅제; 티타늄 전극; 상기 기판 상에 위치한 백금 전극; 및 상기 기판 표면의 적어도 일부에 산화 그래핀으로 개질된 고정부를 포함하는, 바이오센서 칩을 제공한다.
상기 바이오센서 칩은 간단한 방법으로 세척 후 활성화하여 재사용할 수 있으며, 3회 이상의 재사용 시에도 특성을 유지할 수 있다.
본 발명에서 상기 기판은 실리콘(silicon, Si), 실리콘 산화물(silicon oxide, SiO2), 질화규소(silicon nitride, Si3N4), 사파이어(sapphire), 다이아몬드(diamond), 탄화규소(silicon carbide), 질화갈륨(gallium nitride, GaN), 게르마늄(germanium, Ge), 인듐 갈륨 비소화물(indium gallium arsenide, InGaAs), 갈륨 비소화물(gallium arsenide, GaAs), 황화납(lead sulfide) 폴리이미드(Polyimide) 필름, PET(Polyethylene Terephthalate) 필름, PET 합성 필름으로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것이들의 조합과 같은 어느 적합한 재료를 포함할 수 있으며, 본 실시예에서는 실리콘 산화물(SiO2)을 이용하여 제조하였으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 바이오센서 칩은 상기 고정부에 목적하는 바이오마커와 결합하는 리셉터(receptor)가 고정화(immobilized)되어 있을 수 있으며, 상기 리셉터와 시료 내 존재하는 바이오마커의 결합 과정에서 변화하는 정전용량을 측정함으로써, 대상시료 내 바이오마커의 수준을 검출하여 해당 바이오마커로부터 판별 가능한 질병 또는 건강상태를 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 바이오마커(biomarker)란 단백질이나 DNA, RNA(리복핵산), Aptamer(압타머) 대사 물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하는 것으로서, 바이오마커를 활용하면 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 바이오마커는 스크리닝(screening) 바이오마커, 예후(prognostic) 바이오마커, 계층(stratification) 바이오마커, 효능(efficacy) 바이오마커, 독성(toxicity) 바이오마커, 반응예측(Predictive) 바이오마커 및 약역학(Pharmacodynamic) 바이오마커로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
이러한 바이오마커의 수준을 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는데 이용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 구리금속 전극, 전도성 코팅제, 티타늄 전극 및 백금 전극 등은 각각 적어도 하나의 가지가 20~200 μm의 간격으로 서로 교호 배치(alternately arranged)된 맞물린 형태의 구조일 수 있다. 맞물린 형태의 구조란, 상기 가지가 마치 깍지낀 손가락과 같이 일 전극과 타 전극이 번갈아 배치된 것을 의미할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 고정부는 기판 상에 화합물이 결합하여 일종의 화학층을 형성한 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 고정부에는 상기 바이오마커와 결합하는 프로브(probe) 또는 리셉터가 고정화(immobilized)된 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 바이오센서 칩에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin), 압타머(Aptamer) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커가 핵산인 경우 이와 상보적인 서열을 갖는 핵산서열이 리셉터가 될 수 있으며, 상기 바이오마커가 단백질인 경우 이와 결합할 수 있는 항체(antibody), 압타머(aptamer) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 바이오마커에 결합 가능한 생체 분자라면 어떤 것이라도 무방하다.
일 실시예에 있어서, 상기 고정부에 리셉터를 고정하는 방법은 그 종류를 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 EDC-NHS 커플링을 이용하여 아미드 결합을 형성하거나, 아미노프로필트리에톡시실란(APTES, 3-Aminopropyltriethoxysilane) 용액 등을 이용하여 직접 분자구조를 고정부에 결합하도록 한 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서는 EDC-NHS 커플링을 이용하여 리셉터를 고정하는 방법을 개시하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 EDC는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)이고, NHS는 N-히드록시 석신이미드(N-Hydroxy succinimide)로서, 아민 및 카복시 그룹에서 강력한 공유결합을 형성하여 항체를 견고하게 고정하기 위하여 사용되었다.
일 실시예에 있어서, 상기 바이오센서 칩은 대상시료 내 바이오마커의 수준을 검출할 수 있다. 구체적으로, 상기 바이오마커 수준은 상기 바이오센서 칩의 정전용량 변화를 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 시료 내 바이오마커 농도의 로그 값이 정전용량 값에 선형비례 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 바이오센서 칩은 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머란, 공유 결합된 두개 이상의 모노머(monmer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 5-30개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다. 또한 3차원적 형태를 이루어 표적물질에 특이적으로 결합하는 단일가닥 올리고 핵산으로 항체와 유사한 기능을 가져 “Antibody”로도 불리는 물질인 압타머(Aptamer)를 프로브로 사용할 수 있다. 여기서, 압타머란, 표적의 3차원적인 형체를 인식해 결합하는 특징을 가지고 있으며, 생물학적 생산이 아닌 화학적 합성으로 생산하기 때문에 배치 재현성이 높고, 물질 안정성 (stability) 도 우수하며, 제조가격도 저렴하고, 생체내 면역원성 (immunogenicity)도 보고된 바가 없는 안전성도 우수한 바이오 소재이다.
올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.
아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.
펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.
특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 5-30개의 뉴클레오타이드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 다른 일 측면은, 전술한 바이오센서 칩을 포함하는, 진단용 키트를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 가질 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 용액 형태의 검출용 키트는 나트륨-인산, 칼륨-인산, 트리스-염산 및 이외의 여러 종류의 완충액 등의 완충액에 단백질 또는 프라이머 등을 별도로 또는 혼합하여 제제화할 수 있으며, 필요에 따라 냉동시키거나 동결 건조할 수도 있다.
상기 검출용 키트는 면역측방유동 스트립 방식을 이용한 것일 수 있다. 측방유동분석법(lateral flow assay)은 크로마토그래피 방법을 기본으로 하는 단백질 또는 핵산의 검출 방법이다. 이러한 측방유동분석법은 임신진단, 암진단, 기타 특정 단백질 또는 유전자의 존재 여부 또는 미생물탐지 등 다양한 분야에 널리 사용되고 있다. 측방유동분석법은 항원-항체 반응과 같은 두 물질 간의 특이적인 반응을 기본으로 하는 것으로, 민감도와 특이성이 높고, 빠른 시간 내에 결과를 확인할 수 있다는 장점이 있어 질병의 진단 및 빠른 예방 조치를 가능하게 한다.
본 발명의 검출용 키트에는 본 발명의 바이오센서 칩을 이용하여 목적하는 질병의 바이오마커를 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermusaquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcusliteralis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(H2O)을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, (a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계; (b) 상기 시료를 전술한 바이오센서 칩에 접촉시키는 단계; (c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오센서 칩 내 리셉터(항체)에 결합됨에 따라 정전용량성(capacitive) 변화를 감지하는 단계; 및 (d) 정전용량성(capacitive) 변화 정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 대상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액, 정액 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계의 표적물질은 바이오마커(biomarker)일 수 있으며, 구체적으로 스크리닝(screening) 바이오마커, 예후(prognostic) 바이오마커, 계층(stratification) 바이오마커, 효능(efficacy) 바이오마커, 독성(toxicity) 바이오마커, 반응예측(Predictive) 바이오마커 및 약역학(Pharmacodynamic) 바이오마커로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 바이오마커로부터 진단 가능한 질병은 암 종류로서 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 혈액종양(hematopoietic malignancy), 자궁경부암(cervical cancer), 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 내분비 종양(endocrine tumor), 골암(bone cancer), 전립선암(prostate cancer), 자궁암(uterus cancer), 유방암(breast cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌 종양(brain cancer), 간암(liver cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreas cancer), 피부암(skin cancer), 폐암(lung cancer), 후두암(larynx cancer), 두경부암(head and neck cancer), 식도암(esophageal cancer), 대장암(colorectal cancer) 및 난소암(ovarian cancer)일 수 있다.
또한, 상기 질병은 염증 질환, 면역 질환, 또는 자가면역 질환일 수도 있다. 예를 들면, 이 질환은 염증성 장 질환 (IBD), 크론 질환 (CD), 궤양성 결장염 (UC), 골반 염증, 맥관염, 건선, 당뇨병, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 유형 I 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 하시모토의 갑상선염, 그레이브의 질환, 강직성 척추염, 요그렌(Sjogrens) 질환, CREST 증후군, 경피증, 류마티스 질환, 장기 거부, 원발성 경화성 담관염, 또는 폐혈증일 수 있다.
또한, 상기 질병은 신경 질환, 가령, 다발성 경화증(MS), 파킨슨 질환(PD), 알츠하이머 질환 (AD), 정신불열증, 양극성장애, 우울, 자폐증, 프리온 질환, 픽(Pick) 질환, 치매, 헌팅턴 질환(HD), 다운 증후군, 뇌혈관 질환, 라스무센(Rasmussen)의 뇌염, 바이러스성 수막염, 신경정신성 전신 홍반성 낭창 (NPSLE), 근위축성 측삭 경화, 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-Jacob) 질환, 게르스트만-스트라우서-쉐인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 질환, 전염성 해마상뇌증, 허혈성 재관류 손상(가령 발작), 뇌외상, 미생물 감염, 또는 만성피로 증후군을 포함할 수 있다.
또한, 상기 질병은 감염질환, 가령, 박테리아성, 바이러스성 또는 효모 감염을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 질환 또는 상태는 휘플(Whipple) 질환, 프리온 질환, 간경변, 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스, HIV, 간염, 매독, 수막염, 말라리아, 결핵, 인플루엔자 또는 코로나 바이러스일 수 있다. 바이러스성 단백질들, 가령 HIV 또는 HCV-유사 입자들은 바이러스성 상태를 특징화하기 위하여 소낭에서 평가할 수 있다.
본 발명의 기술분야에 숙련된 자들은 합당한 실험으로 이러한 방법의 다양한 단계들의 순서를 바꾸더라도 사용되는 특정 공정 및 물질에 따라 동일하거나 유사한 결과들이 나올 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 명세서에서 설명되는 다양한 단계들이 수행되는 순서 및 공정은 한정의 의미로 고려되어서는 안되며, 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자들은 본 개시내용의 사상 및 범위 내에서 이러한 방법을 적절하게 수정하여 적용할 수 있을 것이다. 다양한 실시예에서는, 예시되는 단계들 중 하나 이상의 단계가 생략될 수 있다. 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자는 원하는 결과를 여전히 획득하면서도 어떤 단계들이 생략될 수 있는지를 예를 들어, 사용되는 특정 물질, 물질의 품질, 이용가능한 시약(reagents), 이용가능한 장비 등과 같은 인자들에 근거하여 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 환자의 시료에 치료제를 처리하는 단계; 및 상기 시료에서 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 바이오마커 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 질병 치료제의 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 일 측면은, (i) 이중 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor) 센서 칩을 피라냐 용액(황산과 과산화 수소를 3:1의 비율로 혼합)으로 80℃에서 1분 ~ 20분간을 선별 세척하고, 이후 에탄올과 탈이온수(DI)를 이용해 다시 세척하는 단계; (ii) 산화 그래핀(GrO) 4uL를 스핀 코터를 이용하여 500 ~ 1300 rpm, 30~80℃에서 선별하여 1~60분중에 개별적으로 선택하여 상기 센서 칩에 코팅하는 단계; (iii) 100℃의 핫플레이트에서 1 ~ 10시간중에 선별하여 산화 그래핀(GrO)를 어닐링하고, 실온에서 식히는 단계; (iv) 0.4M 및 0.1M 농도의 EDC-NHS를 스핀 코터를 이용하여 10 ~150rpm중에서 5 ~ 60분간 고정화 하는 단계; (v) 바이오마커의 리셉터를 고정하는 단계; 및 (vi) 고정되지 않은 잔여 항체에 의한 비특이적 반응을 차단하기 위해 소 혈청 알부민(BSA)을 처리한 후 실온에서 10~60분동안 처리하고 탈이온수(DI)로 세척하는 단계를 포함하는, 바이오센서 칩의 제조 방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 사용된 바이오센서 칩은 상기 피라냐 용액으로 세척한 후에 재사용할 수 있다. 상기 바이오센서 칩은 간단한 방법으로 처리하여 재사용할 수 있으며, 다수 회의 재사용 시에도 센서로서의 성능을 유지할 수 있다.
본 발명의 바이오 센서는 라벨링이 필요 없고(label free), 간단하며, 매우 높은 민감도를 갖고, 초고속 반응시간(30초이내)으로 실시간 감지가 가능하며 재사용이 가능한 것을 특징으로 한다.
상기 바이오 센서는 목적하는 대상 질병의 특정 바이오 마커, 대사체 및 유전물질 등 나노홀 어레이 표면에 부착할 수 있는 리셉터 종류에 제한이 없고, 검출 과정에서 단백질 변형이 없을 뿐 아니라 형광물질이나 동위원소를 사용하지 않아 인체에 대한 유해성이 적다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명 이중 인터디지털 커패시터(DIDC) 센서와 이를 이용한 바이오센서 칩의 형태를 나타낸 것이다(A: DIDC 칩의 구조, B: DIDC 칩을 스트립에 탑재하기 위해 변경된 구조).
도 2는 본 발명 바이오센서 칩이 탑재된 스트립의 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 바이오센서 칩이 탑재된 스트립과 리더기의 일 실시 형태를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 탐지 리더기에 스트립이 장착되는 부분의 세부 구조도를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명 바이오 센서의 반복 실현성 및 재활용성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 바이오센서 칩의 전자현미경(SEM) 사진이다. (a) DIDC 칩의 표면을 산화 그래핀(GrO)으로 코팅한 모습, (b) DIDC 기판에 EDC-NHS로 코팅한 모습, (c) 코로나 바이러스의 항체가 고정화 된 모습, (d) 코로나 바이러스의 항원인 S1 단백질이 고정된 모습, rm 밑의 그림은 DIDCdml 크리에 대한 실제적 사진이다.
도 7은 표면에 대한 접착상황을 확인하기 위한 (a) GrO DIDC칩, (b) EDC-NHS 기능화 된 IDC칩, (c) 항체 결합된 DIDC칩, (d) SARS-CoV-2의 스파이크 S1 이 결합된 모습, (e) 재사용성 팩터의 AFM 이미지이다.
도 8은 (a) bare DIDC칩, (b) 산화 그래핀(GrO)이 기능화 된 IDC칩, (c) EDC-NHS 기능화 된 DIDC칩, (d) 항체 결합된 DIDC칩의 FTIR 값을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 바이오센서 칩이 탑재된 스트립의 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 바이오센서 칩이 탑재된 스트립과 리더기의 일 실시 형태를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 탐지 리더기에 스트립이 장착되는 부분의 세부 구조도를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명 바이오 센서의 반복 실현성 및 재활용성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 바이오센서 칩의 전자현미경(SEM) 사진이다. (a) DIDC 칩의 표면을 산화 그래핀(GrO)으로 코팅한 모습, (b) DIDC 기판에 EDC-NHS로 코팅한 모습, (c) 코로나 바이러스의 항체가 고정화 된 모습, (d) 코로나 바이러스의 항원인 S1 단백질이 고정된 모습, rm 밑의 그림은 DIDCdml 크리에 대한 실제적 사진이다.
도 7은 표면에 대한 접착상황을 확인하기 위한 (a) GrO DIDC칩, (b) EDC-NHS 기능화 된 IDC칩, (c) 항체 결합된 DIDC칩, (d) SARS-CoV-2의 스파이크 S1 이 결합된 모습, (e) 재사용성 팩터의 AFM 이미지이다.
도 8은 (a) bare DIDC칩, (b) 산화 그래핀(GrO)이 기능화 된 IDC칩, (c) EDC-NHS 기능화 된 DIDC칩, (d) 항체 결합된 DIDC칩의 FTIR 값을 나타낸 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
공간적으로 상대적인 용어인 "아래(below)", "아래(beneath)", "하부(lower)", "위(above)", "상부(upper)" 등은 도면에 도시되어 있는 바와 같이 하나의 소자 또는 구성 요소들과 다른 소자 또는 구성 요소들 과의 상관관계를 용이하게 기술하기 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시되어 있는 방향에 더하여 사용시 또는 동작시 소자의 서로 다른 방향을 포함하는 용어로 이해되어야 한다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 실시예들에 따른 바이오센서 칩은 바이오 시료에 포함되어 있는 바이오 분자(biomolecule)를 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는데 이용된다. 바이오센서 칩은 분석하고자 하는 바이오 시료의 대상에 따라 그에 맞는 프로브(probe) 또는 리셉터들을 채용한다. 바이오센서 칩에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함한다. 칩 형태로 제조된 바이오센서 칩은 바이오칩으로도 지칭된다. 예를 들어, 각각 채용되는 프로브의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 바이오센서 칩은 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머란, 공유 결합된 두개 이상의 모노머(monmer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 5-30개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다.
올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.
아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.
펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.
특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 5-30개의 뉴클레오타이드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서는 일 실시예로서 코로나바이러스의 단백질을 바이오마커로 하고, 이의 항체를 바이오센서 칩에 결합시켜 정전용량의 변화를 측정하였으나, 본 발명이 코로나 바이러스 탐지에 국한되지 않음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1 : 시료 및 장비 준비
모든 저장액(Stock Solution)은 Simplicity, Millipore(USA)의 물 분배기 시스템 Milli-Q로부터 공급된 탈이온수를 사용하여 제조되었다. SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 모노클로날 IgG 항체, HEK293에서 발현된 Rabbit Mab(Catalog Number: 40150-R007) 및 SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-His Recombinant Protein (HPLC-verified) (Catalog Number: 40591-V08H) (Expression Host: HEK293 Cells) (consists of 681 amino acids)은 중국 Sino Biological로부터 구입하였다. 과산화수소(H2O2), 황산 (H2SO4), EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride), NHS (N-Hydroxysuccinimide, 98+%)(C4H5NO3)는 Fisher Scientific로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 가장 순도가 높은 분석 등급(analytical grade)으로 준비하였
샌드위치형 바이오 전극을 특성화하고 바이오마커의 농도를 계산하기 위해 임피던스 분석기 또는 LCR 미터가 사용되었다. 용량 측정은 1 kHz 내지 100 kHz의 주파수 범위에서 개방 회로 전위에서 수행되었다.
생체 복합체의 표면 특성을 분석하기 위해 위해 원자력 현미경(AFM)을 태핑 모드(AFM (Model XE-Model XE- 100, Park Systems, 대한민국))에서 사용했다.
고분해능 저진공 주사 전자 현미경(High-Resolution low vaccuum Scanning Electron Microscope; SEM, FEI (Nova Nano SEM 200))으로 두께와 개질된 표면을 확인하였다. 준비된 시료 격자들은 한국나노기술원(KANC)의 FT-IR Nicolet5700으로 확인하였으며, DIDC 칩에 그래핀 산화물의 확산성과 습윤성을 확인하는데 OCA 25 접촉각 측정기를 사용하였다.
실시예 2 : 산화 그래핀으로 표면을 개질한 DIDC 바이오센서 칩의 준비 및 성능 검증
본 발명 바이오센서 칩을 다음과 같은 단계를 거쳐 제조하였다(도 2).
첫 단계로 이중 맞물린 형태의 인터디지털 커패시터(Double Interdigitated Capacitor; DIDC) 센서 칩을 피라냐 용액(황산과 과산화 수소를 3:1의 비율로 혼합)으로 80℃에서 15 내지 20분간 세척하고, 이후 에탄올과 탈이온수(DI)를 이용해 다시 세척하였다.
이후 표면을 산화 그래핀(GrO) 4uL를 스핀 코터를 이용하여 1300 rpm, 80℃에서 60분간 상기 센서 칩에 코팅하였다(도 2(b)).
이어서 100℃의 핫플레이트에서 4시간 동안 산화 그래핀(GrO)를 어닐링하고, 실온에서 식혀주었다.
이후, 0.4M 및 0.1M 농도의 EDC-NHS(4μL)를 스핀 코터를 이용하여 150rpm에서 15분간 처리하여 그래핀과 EDC-NHS가 결합되도록 하였다.
이후, SARS-CoV-2스파이크 단백질의 항체 5uL를 드롭 캐스트 방법(Drop cast Method)으로 칩에 처리한 후, 2시간 동안 인큐베이션 하여 항체가 고정되도록 하여주고, 고정되지 않은 잔여 항체에 의한 비특이적 반응을 차단하기 위해 소 혈청 알부민(BSA)을 처리한 후 실온에서 30분동안 처리하고 탈이온수(DI)로 세척하여 바이오센서 칩을 준비하였다.
상기 준비된 바이오센서 칩에 SARS-CoV-2의 스파이크 S1 단백질 항원을 처리하고, 표적 분석 물질의 결합으로 인한 바이오 칩의 정전용량 변화에 반응한 결과를 도 3에 나타내었다.
구체적으로, 산화 그래핀 처리한 DIDC 칩은 정전용량 증가량이 1.37nF (0.0261nF에서 1.4nF까지)임을 확인하였다. 이러한 정전용량의 증가는 산화 그래핀의 높은 전도율 때문인 것으로 보인다. 즉, 이러한 결과는 산화 그래핀 처리를 함으로써 더욱 높은 민감도를 가질 수 있음을 의미하는 것이다.
또한, 본 발명 바이오센서 칩의 특이성과 관련하여, 도 3의 c, d에 나타난 것과 같이 항원과 반응한 경우(녹색선)와 항체만 존재하는 경우(파란색)의 nF 값의 차이가 20배 가까이 현저히 차이나는 바, 이러한 결과는 본 발명 바이오센서 칩이 높은 특이성을 가지는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 바이오센서 칩의 주요 개념은 전하 분포(charge distribution), 유전 상수(dielectric constant) 및 전도성(conductivity)을 조절하는 것에 기반한다.
분석 대상 물질이 DIDC 바이오센서 칩에 배치되면 유전체(dielectric)와 반응하여 전하 분포 및 항체와 항원의 전도도가 함께 변경되고, 이러한 감지 매개 변수의 변화는 IDC의 용량성 리액턴스(capacitive reactance)에 해당한다.
따라서, IDC 전압을 통한 용량성 리액턴스를 관찰함으로써 IDC 바이오센서 칩의 감지 응답을 얻을 수 있다.
정전용량 기반 감지 기술은 다른 방법에 비해 민감도가 높고, 응답시간이 짧다고 알려져 있다. 그러나 상기 바이오센서 칩은 유리 기판 상에 생물학적 구성이 가미된 Ti/Pt를 구비하여 종래의 기술보다 감도와 선택성을 현저히 개선하였다. 이러한 독특한 설계는 보다 정확한 결과를 도출할 수 있도록 한다.
상기 바이오센서 칩은 3초 이내에 극 미량인 1fg/ml 수준까지 정전용량의 변화를 감지할 수 있었다. 상기 샌드위치기반 층대층(layer-by-layer) 배열은 분석 시간을 감소시켜 실시간으로 감지가 가능하였다.
실시예 3. 본 발명 바이오센서 칩의 재사용성 및 신뢰성 확인
본 발명의 DIDC 바이오센서 칩을 SARS-CoV-2 스파이크 S1 단백질(항원)의 농도를 달리하면서 정전용량 값을 모니터링함으로써 재사용성에 대하여 평가하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명 바이오센서 칩 칩의 정전용량 변화를 10시간 동안 측정한 결과 안정된 결과를 보였으며(도 5a), 10일간의 연속 정전 용량 값 또한 실온에서 저온으로 칩이 옮겨지면서 변화가 발생한 2일차를 제외하고는 전반적으로 우수한 안정성을 보이는 것을 확인하였다(도 5b).
나아가, 1.0 μg/ml 부터 1.0 fg/ml까지 항원인 SARS-CoV-2-Spike (S1) protein의 농도를 달리하면서 정전용량을 확인하였으며, 반복적으로 3회 사용 가능한 것을 확인하였다(도 5 c-e).
생물표면은 빠르고 비파괴적 제어된 생물학적 시스템으로 인하여 활성화되었으며, 완전한 바이오센서 칩 절연 시스템의 균형잡히고 표류하지 않는 신호를 제공하였다. 매우 빠른 응답 시간인 3초의 응답시간 이내에서 정전용량의 변화를 확인하여 평가되었다.
이는 바이오센서 칩 칩이 80℃에서 피라냐 용액으로 세척 및 건조시킨 후 원래의 특성을 회복한 것을 나타낸다. 상기 DIDC 바이오센서 칩 칩은 3회 이상 재사용이 가능하여 장기적으로 제품 비용을 절감시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명 실시예에서는 동일한 DIDC 바이오센서 칩을 실험에 계속 사용하였으며, 각각의 분석을 3회 반복한 후에도 우수한 안정성을 보여 결과에 차이가 없음을 확인하여 본 발명의 DIDC 바이오센서 칩이 우수한 재사용성 및 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예는 3초 이내에 바이오마커의 선택성 및 감도 검출을 위해 생체 기능화된 IDC 전극(Ti / Pt)을 사용하여 라벨 없는 정전용량 바이오센서 칩을 제조한 것이다. 상기 바이오센서 칩은 신속하고 비용 절감적인 코로나 감염 확진을 실시간으로 수행하도록 구성되었으며, 이러한 코로나 바이러스 감염의 진단에는 매우 적은 양의 샘플이 필요했고 센서는 최대 10일 동안 재현성과 안정성을 나타내었다. 상기 바이오센서 칩은 신속하고 민감하며 선택적인 바이오 마커 검출이 시급히 요구되는 표적 질병 관리 프로그램에 적용될 수 있다.
실시예 4 : 정전용량 기반 바이오 칩의 표면 특성
정전용량 측정, AFM, SEM, FT-IR 분석을 통해 DIDC 칩의 표면 개질의 특성을 분석하였다.
1)
SEM 이미지
도 5에 도시된 바와 같이 본 발명 바이오센서 칩 칩에 산화 그래핀(GrO), EDC-NHS, 항체 및 항원이 결합한 기판의 표면 형태를 초고분해능 저진공 주사 전자 현미경 (SEM, FEI (Nova Nano SEM 200))으로 관찰하였다.
2)
AFM( Atomic force microscopy studies) 분석
도 6에 도시된 바와 같이 GrO DIDC칩, EDC-NHS 기능화 된 DIDC칩, 항체 결합된 DIDC칩, SARS-CoV-2의 스파이크 S1 이 결합된 표면을 특성화하기 위해 원자력 현미경 (AFM)을 태핑 모드(AFM (Model XE-Model XE- 100, Park Systems, 대한민국))에서 사용했다.
3)
FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy) 분석
도 7에 도시된 바와 같이, Bare 바이오 칩(a)은 1060cm-1에서 피크가 나타나 C-O 1차 알코올의 존재를 확인할 수 있다.
산화 그래핀을 처리한 바이오칩(b)는 C-O(방향족 에스테르)에 해당하는 1038cm-1에서 피크가 존재하여 바이오칩상에 그래핀 산화물을 고정하여 아로마 링의 존재를 확인할 수 있다.
(c)에서는 EDC-NHS의 니트로 그룹에 해당하는 1567cm-1에서 날카로운 피크 를 확인할 수 있다.
(d) 에서는 C-H 스트레치 피크에 해당하는 2976 cm-1를 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 기판;
상기 기판 상에 위치한 티타늄 전극;
상기 기판 상에 위치한 백금 전극; 및
상기 기판 표면의 적어도 일부에 산화 그래핀으로 개질된 고정부를 포함하고, 상기 고정부에는 질병 또는 건강상태를 나타내는 바이오마커의 프로브(probe) 또는 리셉터가 고정화(immobilized) 된, 바이오센서 칩. - 제1항에 있어서,
상기 티타늄 전극 및 백금 전극은 각각 적어도 하나의 가지가 20~200m의 간격으로 서로 교호 배치된 이중 맞물린형태의 인터디지털 구조인, 바이오센서 칩.
- 제2항에 있어서,
상기 가지의 너비는 각각 20~200m인, 바이오센서 칩.
- 제1항에 있어서,
상기 기판은 실리콘(silicon, Si), 실리콘 산화물(silicon oxide, SiO2), 질화규소(silicon nitride, Si3N4), 사파이어(sapphire), 다이아몬드(diamond), 탄화규소(silicon carbide), 질화갈륨(gallium nitride, GaN), 게르마늄(germanium, Ge), 인듐 갈륨 비소화물(indium gallium arsenide, InGaAs), 갈륨 비소화물(gallium arsenide, GaAs) 및 황화납(lead sulfide), 폴리이미드(Polyimide) 필름, PET(Polyethylene Terephthalate) 필름, PET 합성 필름으로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것이들의 조합과 같은 어느 적합한 재료로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것인, 바이오센서 칩. - 제1항에 있어서,
상기 고정부는 EDC-NHS 화합물로 더 개질된, 바이오센서 칩. - 제1항에 있어서,
상기 질병은 암, 염증 질환, 면역 질환, 자가면역 질환, 신경 질환 또는 감염질환, 기생질환 중 어느 하나 이상인 것인, 바이오센서 칩. - (a) 피험체로부터 대상시료를 수득하는 단계;
(b) 상기 시료를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이오센서 칩에 접촉시키는 단계;
(c) 대상시료에 존재하는 표적물질이 상기 바이오센서 칩 내 리셉터에 결합됨에 따라 정전용량성(capacitive) 변화를 감지하는 단계; 및
(d) 정전용량성(capacitive) 변화 정도를 감지하여 대상시료 내 표적물질의 수준을 판별하는 단계;를 포함하는 질병의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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